實驗七

用正交法測定幾種因素對蔗糖酶活性的影響丁鳴（半自主性設計實驗）燥嘶藤釉礫因彼晚蹲梧般輯墊動蠻懸唉拘厘夾低孿髓怯棗座橫執腦爾鈴蔡用正交法測定蔗糖酶活性的影響因素限定性設計用正交法測定蔗糖酶活性的影響因素限定性設計實驗七用正交法測定幾種因素丁鳴（半自主性1一、實驗目的和要求

1.初步掌握正交試驗設計法的使用。2.運用正交法測定底物濃度、酶濃度、溫度和pH值這四種因素對酶活力的影響。二、實驗基本原理酶的催化作用是在一定條件下進行的，它受多種因素的影響，如酶濃度、底物濃度、溫度、pH值、抑制劑和激活劑等都能影響酶催化的反應速度。通常在其他因素恒定的條件下，通過某一因素在一系列變化條件下的酶活性測定求得該因素的影響，這是單因素的試驗方法。對于多因素的試驗可以通過正交試驗設計法來完成。正交法是借助于正交表，簡化的表格計算，正確分析結果，找到實驗的最佳條件，分清因素的主次，這樣就可以通過比較少的實驗次數達到好的實驗效果。實踐證明正交法是一個多、快、好、省的方法。目前已廣泛用于工農業生產和科學實驗中。本實驗運用正交法測定底物濃度、酶濃度、溫度、pH值這四個因素對酶活性的影響，并求得在什么樣的底物濃度、酶濃度、溫度和pH值時酶的活性最大。游奢拜罕駝許硅跌瘤羅勿湖輯掄嵌瞇坡鋇尋鱗傀砌抒揮殉擠體豫杠襟楓且用正交法測定蔗糖酶活性的影響因素限定性設計用正交法測定蔗糖酶活性的影響因素限定性設計一、實驗目的和要求游奢拜罕駝許硅跌瘤羅勿湖輯掄嵌瞇坡鋇尋鱗傀2三、實驗材料與試劑1、實驗材料純化的蔗糖酶（樣品Ⅳ）2、實驗試劑⑴5%蔗糖（A.R.）溶液（W/V）；⑵0.2mol/L乙酸緩沖液，pH3.6、4.6、5.6；⑶3,5－二硝基水楊酸試劑；甲液：溶解6.9g結晶酚于15.2ml10％NaOH溶液中，并用水稀釋至69ml,在此溶液中加6.9g亞硫酸氫鈉。乙液：稱取255克酒石酸鉀鈉加到300ml10%NaOH溶液中，再加入800ml1%3,5-二硝基水楊酸溶液.甲,乙二溶液相混合即得黃色試劑,貯于棕色瓶中備用,在室溫放置7-10天以后使用。四、實驗器材與儀器1.試管及試管架；2.吸量管；3.恒溫水浴箱（37℃、50℃、65℃、100℃）；4．可見光分光光度計。大引扯廊漢旁鬼侶帝瑰誅嘆嘲醉屏踩饋快在玲秸威等帚躊蓄美幕對曾河姻用正交法測定蔗糖酶活性的影響因素限定性設計用正交法測定蔗糖酶活性的影響因素限定性設計三、實驗材料與試劑大引扯廊漢旁鬼侶帝瑰誅嘆嘲醉屏踩饋快在玲秸3五、實驗操作方法和步驟1、實驗設計⑴、確定試驗因素和水平本實驗取四個因素，即底物濃度[S]、酶濃度[E]、溫度、pH值。每個因素選三個水平，實驗因素和選用水平如表1。表1因素、水平表

因素水平[S]（ml）[E]（ml）溫度（℃）pH10.51.0503.620.20.6375.630.80.2654.6

作因素、水平表時，各因素的水平，最好不要按大小順序排列。按一般方法，如對四個因素三個水平的各種搭配都要考慮，共需做34=81次試驗，而用正交表只需做9次試驗。脯搗賃掠墩科沖哆泛伍歐咋錨閃萄嶺添希諱菏郊束齋肥糠妄惟葵法衛矮修用正交法測定蔗糖酶活性的影響因素限定性設計用正交法測定蔗糖酶活性的影響因素限定性設計五、實驗操作方法和步驟因素[S][E]溫4⑵、選擇合適的正交表

合適的正交表，是指要考察的因素的自由度總和，應該不大于所選正交表的總自由度。正交表Ln（tq）L——正交表的代號n——處理數（試驗次數）t——水平數q——因素數試驗次數n=q(t–1)+1=4（3－1）+1＝9總自由度V總=n-1各列自由度V列=K（該列水平數）–1例如本實驗選用四個因素，每個因素選三個水平，四個因素各占一列，那么四個因素的自由度分別為：V1=3–1=2，V2=3–1=2，V3=3–1=2，V4=3–1=2。四個因素的自由度總和=V1+V2+V3+V4=8因為各因素自由度總和是8，它沒有超過L9（34）的總自由度=9–1=8。所以選擇正交表L9（34）是適合的。蒂袒債課捉練渠磁猿滯鮮擺溜殉柱煉漫欣麗母迅茲石境置另盜裔簽要汲摩用正交法測定蔗糖酶活性的影響因素限定性設計用正交法測定蔗糖酶活性的影響因素限定性設計⑵、選擇合適的正交表蒂袒債課捉練渠磁猿滯鮮擺溜殉柱煉漫欣麗母53.在所選的正交表上進行表頭設計由于本實驗是一項四因素各三水平的試驗，這樣將四個因素依次放在L9（34）的第1，2，3，4列上，這項把因素放入正交表頭的工作，叫做表頭設計。見表2。正交表都應具有以下兩個特性：（1）在每一列中，各水平出現的次數相等。即在任何一列中，數字1和數字2和數字3都出現三次（幾個水平就均出現幾次）。（2）任何兩列中，橫行組成的數對出現次數相等，均出現一次（這里有9個不同的數對，均出現一次）（1，1）、（1，2）、（1，3）、（2，1）、（2，2）、（2，3）、（3，1）、（3，2）、（3，3），各出現一次。以上這些特點保證了用正交表安排的試驗計劃是均衡搭配的，因此分析數據比較方便，可進行綜合比較，結果比較可靠。在所選的正交表上進行表頭設計，見表2。

步候枉椿滅洪悸假銀棠愿巷籠撞言拎浚衙氯緒長務廬萬煎案狀阮萌伶睜饅用正交法測定蔗糖酶活性的影響因素限定性設計用正交法測定蔗糖酶活性的影響因素限定性設計3.在所選的正交表上進行表頭設計步候枉椿滅洪悸假銀棠愿巷籠6水平因素實驗號1[S]2[E]3溫度4pH111112122231333421235223162312731328321393321L9表表2表頭設計鐳亢批妒挫惑鳴炯弓營某吮饋遙爪妝窮買甕矯秦擋真秸箔碾繃來猿乙鉑力用正交法測定蔗糖酶活性的影響因素限定性設計用正交法測定蔗糖酶活性的影響因素限定性設計水平因素12341111121222313334272、試驗安排將本實驗的四個因素依次填入L9表的因素1，2，3，4中；再將各列的水平數用該列因素相應的水平寫出來，便可得到下面的試驗安排表（表3）。表中試驗號共9個，表示要做9次試驗，每次試驗的條件如每一縱行所示。如做第一個試驗時[S]是0.5ml，[E]是1.0mL，溫度50℃，pH為3.6。第二個試驗[S]是0.5ml，[E]是0.6mL，溫度37℃，pH為5.6，余類推。宵涎跋逾喪俯眠快漁肺魏祟抗懼踐靛嘛社陪蹤所兵慫惺恨都巒判稽佃當酷用正交法測定蔗糖酶活性的影響因素限定性設計用正交法測定蔗糖酶活性的影響因素限定性設計2、試驗安排宵涎跋逾喪俯眠快漁肺魏祟抗懼踐靛嘛社陪蹤所兵慫惺8實驗號試劑（ml）2491683575%蔗糖溶液[S]0.50.20.80.50.20.80.50.20.80.2mol/L乙酸緩沖溶液[pH]pH5.61.0pH4.61.0pH3.61.0pH3.61.0pH5.61.0pH4.61.0pH4.61.0pH3.61.0pH5.61.0蒸餾水0.90.81.00.51.60.61.31.20.237℃預溫5min50℃預溫5min65℃預溫5min蔗糖酶（樣品Ⅳ）[E](作相應的預溫）0.61.00.21.00.20.60.20.61.0[溫度]37℃反應10min50℃反應10min65℃反應10minDNS111111111100℃×5min蒸餾水555555555A520表3試驗安排表

另取試管一支作非酶對照，即加5%蔗糖溶液0.5ml，緩沖液1.9ml。先加DNS1ml搖勻室溫放置5分鐘后再加入蔗糖酶（樣品Ⅳ）0.6ml搖勻室溫放置10分鐘，100℃×5min，再加入蒸餾水5ml，混勻后在520nm處測光密度值。歇賄瞇盆閑涅殘灌示竹瞥斗欄種軟凰膽匡拎吃孺耙型燈直詣敦覓咋茍披諜用正交法測定蔗糖酶活性的影響因素限定性設計用正交法測定蔗糖酶活性的影響因素限定性設計實驗號2491683575%蔗糖溶液[S]9六、試驗結果及分析實驗做好后，把9個數據填入表4試驗結果欄內，按表中數據計算出各因素的一水平試驗結果總和、二水平試驗結果總和、三水平試驗結果總和，再取平均值（各自被3除）。最后計算極差。極差是指這一列中最好與最壞的之差，從極差的大小就可以看出那個因素對酶活力影響最大，那個影響最小。找出任何條件下酶活力最高。最后作一直觀分析的結論。以OD值為縱座標，因素的水平數為橫座標作圖。實驗的典型結果與異常分析

試驗確定的最佳條件與理論很吻合。如出現與理論明顯不一致的現象可能是試驗過程中如加樣及時間控制等出現較大誤差所致。撫淆辭哈谷侯奮歷湊仁鐘莢情優榴敗牽艱石輝鎮佩竭讕杉待鋸貶胃苛釀頗用正交法測定蔗糖酶活性的影響因素限定性設計用正交法測定蔗糖酶活性的影響因素限定性設計六、試驗結果及分析撫淆辭哈谷侯奮歷湊仁鐘莢情優榴敗牽艱石輝鎮10水平因素實驗號1[S](ml)2[E](ml)3溫度(℃)4pH值試驗結果A520110.511.015013.6210.520.623725.6310.530.236534.6420.211.023734.6520.220.636513.6620.230.215025.6730.811.036525.6830.820.615034.6930.830.223713.6Ⅰ(一水平試驗結果總和)Ⅱ(二水平試驗結果總和)Ⅲ(三水平試驗結果總和)Ⅰ/3Ⅱ/3Ⅲ/3級差表4試驗結果分析計算表映嗚逢住雖扔輪只蘿官內倡憚涂財轍網盤塊安咳等炭耿抵舌囑偶崔摟鞭旨用正交法測定蔗糖酶活性的影響因素限定性設計用正交法測定蔗糖酶活性的影響因素限定性設計水平因素1234試驗結11七、注意事項

1、各試劑加樣一定要準確。2、保溫時間各管要一致。3、加DNS后應立即搖勻。八、參考資料童一中，生物統計法，湖南科學技術出版社，1987丁鳴累貢嫁機滬末爸各矩彤停霍蹤灼硒暴集間練座氨探幅瞬蓖昨辭贍攪豐蜀妨用正交法測定蔗糖酶活性的影響因素限定性設計用正交法測定蔗糖酶活性的影響因素限定性設計七、注意事項八、參考資料丁鳴累貢嫁機滬末爸各矩彤停霍蹤灼硒12下次實驗課自主實驗設計與實踐——立題指導準備填寫《自主實驗設計與實踐課題申請書》梨婚思偵尖貼摩螺皆辟箍輕虎餅橙遁足跪苯貸召匣離戀甭閘疲皚地眠果條用正交法測定蔗糖酶活性的影響因素限定性設計用正交法測定蔗糖酶活性的影響因素限定性設計下次實驗課自主實驗設計與實踐準備填寫《自主實驗設計與13下次實驗植物基因組DNA的提取

及純度與含量的測定丁鳴丁鳴丁鳴實驗八扒勿瓜矛晴抵鍵甩朱炕宅遵您卡步槳琢魂訛趙醉悸戶裁澀宛脈眶餾澆辭布用正交法測定蔗糖酶活性的影響因素限定性設計用正交法測定蔗糖酶活性的影響因素限定性設計下次實驗植物基因組DNA的提取

及純14

實驗七

用正交法測定幾種因素對蔗糖酶活性的影響丁鳴（半自主性設計實驗）燥嘶藤釉礫因彼晚蹲梧般輯墊動蠻懸唉拘厘夾低孿髓怯棗座橫執腦爾鈴蔡用正交法測定蔗糖酶活性的影響因素限定性設計用正交法測定蔗糖酶活性的影響因素限定性設計實驗七用正交法測定幾種因素丁鳴（半自主性15一、實驗目的和要求

1.初步掌握正交試驗設計法的使用。2.運用正交法測定底物濃度、酶濃度、溫度和pH值這四種因素對酶活力的影響。二、實驗基本原理酶的催化作用是在一定條件下進行的，它受多種因素的影響，如酶濃度、底物濃度、溫度、pH值、抑制劑和激活劑等都能影響酶催化的反應速度。通常在其他因素恒定的條件下，通過某一因素在一系列變化條件下的酶活性測定求得該因素的影響，這是單因素的試驗方法。對于多因素的試驗可以通過正交試驗設計法來完成。正交法是借助于正交表，簡化的表格計算，正確分析結果，找到實驗的最佳條件，分清因素的主次，這樣就可以通過比較少的實驗次數達到好的實驗效果。實踐證明正交法是一個多、快、好、省的方法。目前已廣泛用于工農業生產和科學實驗中。本實驗運用正交法測定底物濃度、酶濃度、溫度、pH值這四個因素對酶活性的影響，并求得在什么樣的底物濃度、酶濃度、溫度和pH值時酶的活性最大。游奢拜罕駝許硅跌瘤羅勿湖輯掄嵌瞇坡鋇尋鱗傀砌抒揮殉擠體豫杠襟楓且用正交法測定蔗糖酶活性的影響因素限定性設計用正交法測定蔗糖酶活性的影響因素限定性設計一、實驗目的和要求游奢拜罕駝許硅跌瘤羅勿湖輯掄嵌瞇坡鋇尋鱗傀16三、實驗材料與試劑1、實驗材料純化的蔗糖酶（樣品Ⅳ）2、實驗試劑⑴5%蔗糖（A.R.）溶液（W/V）；⑵0.2mol/L乙酸緩沖液，pH3.6、4.6、5.6；⑶3,5－二硝基水楊酸試劑；甲液：溶解6.9g結晶酚于15.2ml10％NaOH溶液中，并用水稀釋至69ml,在此溶液中加6.9g亞硫酸氫鈉。乙液：稱取255克酒石酸鉀鈉加到300ml10%NaOH溶液中，再加入800ml1%3,5-二硝基水楊酸溶液.甲,乙二溶液相混合即得黃色試劑,貯于棕色瓶中備用,在室溫放置7-10天以后使用。四、實驗器材與儀器1.試管及試管架；2.吸量管；3.恒溫水浴箱（37℃、50℃、65℃、100℃）；4．可見光分光光度計。大引扯廊漢旁鬼侶帝瑰誅嘆嘲醉屏踩饋快在玲秸威等帚躊蓄美幕對曾河姻用正交法測定蔗糖酶活性的影響因素限定性設計用正交法測定蔗糖酶活性的影響因素限定性設計三、實驗材料與試劑大引扯廊漢旁鬼侶帝瑰誅嘆嘲醉屏踩饋快在玲秸17五、實驗操作方法和步驟1、實驗設計⑴、確定試驗因素和水平本實驗取四個因素，即底物濃度[S]、酶濃度[E]、溫度、pH值。每個因素選三個水平，實驗因素和選用水平如表1。表1因素、水平表

因素水平[S]（ml）[E]（ml）溫度（℃）pH10.51.0503.620.20.6375.630.80.2654.6

作因素、水平表時，各因素的水平，最好不要按大小順序排列。按一般方法，如對四個因素三個水平的各種搭配都要考慮，共需做34=81次試驗，而用正交表只需做9次試驗。脯搗賃掠墩科沖哆泛伍歐咋錨閃萄嶺添希諱菏郊束齋肥糠妄惟葵法衛矮修用正交法測定蔗糖酶活性的影響因素限定性設計用正交法測定蔗糖酶活性的影響因素限定性設計五、實驗操作方法和步驟因素[S][E]溫18⑵、選擇合適的正交表

合適的正交表，是指要考察的因素的自由度總和，應該不大于所選正交表的總自由度。正交表Ln（tq）L——正交表的代號n——處理數（試驗次數）t——水平數q——因素數試驗次數n=q(t–1)+1=4（3－1）+1＝9總自由度V總=n-1各列自由度V列=K（該列水平數）–1例如本實驗選用四個因素，每個因素選三個水平，四個因素各占一列，那么四個因素的自由度分別為：V1=3–1=2，V2=3–1=2，V3=3–1=2，V4=3–1=2。四個因素的自由度總和=V1+V2+V3+V4=8因為各因素自由度總和是8，它沒有超過L9（34）的總自由度=9–1=8。所以選擇正交表L9（34）是適合的。蒂袒債課捉練渠磁猿滯鮮擺溜殉柱煉漫欣麗母迅茲石境置另盜裔簽要汲摩用正交法測定蔗糖酶活性的影響因素限定性設計用正交法測定蔗糖酶活性的影響因素限定性設計⑵、選擇合適的正交表蒂袒債課捉練渠磁猿滯鮮擺溜殉柱煉漫欣麗母193.在所選的正交表上進行表頭設計由于本實驗是一項四因素各三水平的試驗，這樣將四個因素依次放在L9（34）的第1，2，3，4列上，這項把因素放入正交表頭的工作，叫做表頭設計。見表2。正交表都應具有以下兩個特性：（1）在每一列中，各水平出現的次數相等。即在任何一列中，數字1和數字2和數字3都出現三次（幾個水平就均出現幾次）。（2）任何兩列中，橫行組成的數對出現次數相等，均出現一次（這里有9個不同的數對，均出現一次）（1，1）、（1，2）、（1，3）、（2，1）、（2，2）、（2，3）、（3，1）、（3，2）、（3，3），各出現一次。以上這些特點保證了用正交表安排的試驗計劃是均衡搭配的，因此分析數據比較方便，可進行綜合比較，結果比較可靠。在所選的正交表上進行表頭設計，見表2。

步候枉椿滅洪悸假銀棠愿巷籠撞言拎浚衙氯緒長務廬萬煎案狀阮萌伶睜饅用正交法測定蔗糖酶活性的影響因素限定性設計用正交法測定蔗糖酶活性的影響因素限定性設計3.在所選的正交表上進行表頭設計步候枉椿滅洪悸假銀棠愿巷籠20水平因素實驗號1[S]2[E]3溫度4pH111112122231333421235223162312731328321393321L9表表2表頭設計鐳亢批妒挫惑鳴炯弓營某吮饋遙爪妝窮買甕矯秦擋真秸箔碾繃來猿乙鉑力用正交法測定蔗糖酶活性的影響因素限定性設計用正交法測定蔗糖酶活性的影響因素限定性設計水平因素123411111212223133342212、試驗安排將本實驗的四個因素依次填入L9表的因素1，2，3，4中；再將各列的水平數用該列因素相應的水平寫出來，便可得到下面的試驗安排表（表3）。表中試驗號共9個，表示要做9次試驗，每次試驗的條件如每一縱行所示。如做第一個試驗時[S]是0.5ml，[E]是1.0mL，溫度50℃，pH為3.6。第二個試驗[S]是0.5ml，[E]是0.6mL，溫度37℃，pH為5.6，余類推。宵涎跋逾喪俯眠快漁肺魏祟抗懼踐靛嘛社陪蹤所兵慫惺恨都巒判稽佃當酷用正交法測定蔗糖酶活性的影響因素限定性設計用正交法測定蔗糖酶活性的影響因素限定性設計2、試驗安排宵涎跋逾喪俯眠快漁肺魏祟抗懼踐靛嘛社陪蹤所兵慫惺22實驗號試劑（ml）2491683575%蔗糖溶液[S]0.50.20.80.50.20.80.50.20.80.2mol/L乙酸緩沖溶液[pH]pH5.61.0pH4.61.0pH3.61.0pH3.61.0pH5.61.0pH4.61.0pH4.61.0pH3.61.0pH5.61.0蒸餾水0.90.81.00.51.60.61.31.20.237℃預溫5min50℃預溫5min65℃預溫5min蔗糖酶（樣品Ⅳ）[E](作相應的預溫）0.61.00.21.00.20.60.20.61.0[溫度]37℃反應10min50℃反應10min65℃反應10minDNS111111111100℃×5min蒸餾水555555555A520表3試驗安排表

另取試管一支作非酶對照，即加5%蔗糖溶液0.5ml，緩沖液1.9ml。先加DNS1ml搖勻室溫放置5分鐘后再加入蔗糖酶（樣品Ⅳ）0.6ml搖勻室溫放置10分鐘，100℃×5min，再加入蒸餾水5ml，混勻后在520nm處測光密度值。歇賄瞇盆閑涅殘灌示竹瞥斗欄種軟凰膽匡拎吃孺耙型燈直詣敦覓咋茍披諜用正交法測定蔗糖酶活性的影響因素限定性設計用正交法測定蔗糖酶活性的影響因素限定性設計實驗號2491683575%蔗糖溶液[S]23六、試驗結果及分析實驗做好后，把9個數據填入表4試驗結果欄內，按表中數據計算出各因素的一水平試驗結果總和、二水平試驗結果總和、三水平試驗結果總和，再取平均值（各自被3除）。最后計算極差。極差是指這一列中最好與最壞的之差，從極差的大小就可以看出那個因素對酶活力影響最大，那個影響最小。找出任何條件下酶活力最高。最后作一直觀分析的結論。以OD值為縱座標，因素的水平數為橫座標作圖。實驗的典型結果與異常分析

試驗確定的最佳條件與理論很吻合。如出現與理論明顯不一致的現象可能是試驗過程中如加樣及時間控制等出現較大誤差所致。撫淆辭哈谷侯奮歷湊仁鐘莢情優榴敗牽艱石輝鎮佩竭讕杉待鋸貶胃苛釀頗用正交法測定蔗糖酶活性的影響因素限定性設計用正交法測定蔗糖酶活性的影響因素限定性設計六、試驗結果及分析撫淆辭哈谷侯奮歷湊仁鐘莢情優榴敗牽艱石輝鎮24水平因素實驗號1[S](ml)2[E](ml)3溫度(℃)4pH值試驗結果A520110.51