關(guān)于組培實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計(jì)第1頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五第一節(jié)：商業(yè)性組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室和小工廠的設(shè)計(jì)與主要設(shè)備主要內(nèi)容：實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計(jì)儀器設(shè)備和器皿用具第2頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五

在進(jìn)行植物組織培養(yǎng)工作之前，首先應(yīng)對工作中需要哪些最基本的設(shè)備條件有個全面的了解，以便因地制宜地利用現(xiàn)有房屋，或新建、改建實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)室的大小取決于工作的目的和規(guī)模。以工廠化生產(chǎn)為目的，實(shí)驗(yàn)室規(guī)模太小，則會限制生產(chǎn)，影響效率。在設(shè)計(jì)組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室時，應(yīng)按組織培養(yǎng)程序來沒計(jì)，避免某些環(huán)節(jié)倒排，引起日后工作混亂。植物組織培養(yǎng)是在嚴(yán)格無菌的條件下進(jìn)行的。要做到無菌的條件，需要一定的設(shè)備、器材和用具，同時還需要人工控制溫度、光照、濕度等培養(yǎng)條件。一、實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)第3頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五組培實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)原則：

保證無菌操作，達(dá)到工作方便，防止污染。第4頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五組培實(shí)驗(yàn)室組成：標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)室包括:洗滌室（區(qū)）制備室（區(qū)）滅菌室（區(qū)）儲放室（區(qū)）操作室（區(qū)）培養(yǎng)室（區(qū)）觀察室（區(qū)）藥品室（區(qū)）▼可以根據(jù)自己的實(shí)際條件進(jìn)行合并第5頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五準(zhǔn)備室：完成所使用的各種藥品的貯備、稱量、溶解、配制、培養(yǎng)基分裝等。主要設(shè)備：藥品柜、防塵櫥（放置培養(yǎng)容器）、冰箱、天平、蒸餾水器、酸度計(jì)及常用的培養(yǎng)基配制用玻璃儀器.洗滌、滅菌室：完成各種器具的洗滌、干燥、保存、培養(yǎng)基的滅菌等。主要設(shè)備：水池、操作臺、高壓滅菌鍋、干燥滅菌器（如烘箱）等。第6頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五臥

式

滅

菌

鍋第7頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五無菌操作室（接種室）：

主要用于植物材料的消毒、接種、培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)移、試管苗的繼代、原生質(zhì)體的制備以及一切需要進(jìn)行無菌操作的技術(shù)程序。主要設(shè)備：紫外光源、超凈工作臺、消毒器、酒精燈、接種器械（接種鑷子、剪刀、解剖刀、接種針）等。接種室宜小不宜大，一般7～8平米，要求地面、天花板及四壁盡可能密閉光滑，易于清潔和消毒。配置拉動門，以減少開關(guān)門時的空氣擾動。要求干爽安靜，清潔明亮。在適當(dāng)位置吊裝1～2盞紫外線滅菌燈，用以照射滅菌。最好安裝一小型空調(diào)，使室溫可控，這樣可使門窗緊閉，減少與外界空氣對流。接種室應(yīng)設(shè)有緩沖問，面積1m2為宜。進(jìn)入無菌操作室前在此更衣?lián)Q鞋，以減少進(jìn)出時帶入接種室雜菌。緩沖間最好也安一盞紫外線滅菌燈，用以照射滅菌。第8頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五超

靜

工

作

臺第9頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五酸

度

計(jì)第10頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五培養(yǎng)室：培養(yǎng)室是將接種的材料進(jìn)行培養(yǎng)生長的場所。其大小可根據(jù)需要培養(yǎng)架的大小、數(shù)目、及其他附屬設(shè)備而定。其設(shè)計(jì)以充分利用空間和節(jié)省能源為原則。高度比培養(yǎng)架略高為宜，周圍墻壁要求有絕熱防火的性能。主要設(shè)備：培養(yǎng)架（控溫控光控濕）、搖床、培養(yǎng)箱、紫外光源等。培養(yǎng)材料放在由金屬制成培養(yǎng)架上培養(yǎng)。培養(yǎng)架一般設(shè)5層，最低一層離地高約lOcm，其他每層間隔30cm左右，培養(yǎng)架高1．7m左右。其長度根據(jù)日光燈長度而設(shè)計(jì)，如采用40W日光燈，則長I．3m，30W的長lm，寬度一般為60cm。培養(yǎng)室最重要的因子是溫度，一般保持在20—27℃左右，具備產(chǎn)熱裝置，并安裝窗式或立式空調(diào)機(jī)。由于熱帶植物和寒帶植物等不同種類要求不同溫度，最好不同種類有不同的培養(yǎng)室。室內(nèi)濕度也要求恒定，相對濕度以保持在70%～80%為好，可安裝加濕器。控制光照時間可安裝定時開關(guān)鐘，一般需要每天光照10-16h，也有的需要連續(xù)照明。現(xiàn)代組培實(shí)驗(yàn)室大多設(shè)計(jì)為采用天然太陽光照作為主要能源，這樣不但可以節(jié)省能源，而且組培苗接受太陽光生長良好，馴化易成活。在陰雨天可用燈光作補(bǔ)充。第11頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室

該室用于對培養(yǎng)物的觀察分析與培養(yǎng)物的計(jì)數(shù)等。主要設(shè)備：雙筒實(shí)體顯微鏡、顯微鏡、倒置顯微鏡等。小型儀器設(shè)備有：分注器、血球計(jì)數(shù)器、移液槍、過濾滅菌器、電爐等加熱器具、磁力攪拌器、低速臺式離心機(jī)等。第12頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五顯微鏡顯微鏡第13頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五玻璃器皿及用具玻璃器皿培養(yǎng)用的：試管、三角瓶、培養(yǎng)皿等；顯微鏡下觀察用的：細(xì)胞微室、載玻片、培養(yǎng)皿等。微孔過濾器（細(xì)胞過濾器）：激素用于滅菌。一般用石棉濾膜第14頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五第二節(jié)：培養(yǎng)基及其配制主要內(nèi)容：培養(yǎng)基的成分培養(yǎng)基的種類、配方及其特點(diǎn)培養(yǎng)基的配制

1、培養(yǎng)基母液的配制

2、培養(yǎng)基的配制第15頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五一、培養(yǎng)基的成分大量元素微量元素氨基酸和有機(jī)附加物植物激素（植物生長調(diào)節(jié)劑）維生素類凝固劑第16頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五大量元素（以Ms培養(yǎng)基為例）序號化學(xué)式化學(xué)名稱用量mg/l1KNO3硝酸鉀19002NH4NO3硝酸銨16503KH2PO4磷酸二氫鉀1704MgSO4.7H2O硫酸鎂3705CaCL2.4H2O二氯化鈣440第17頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五微量元素（以MS培養(yǎng)基為例）序號化學(xué)名稱化學(xué)式用量（mg/l)1碘化鉀KI0.832硼酸H3BO36.23硫酸錳MnSO4.4H2O22.34硫酸鋅ZnSO4.7H2O8.65鉬酸鈉Na2MoO4.2H2O0.256硫酸銅CuSO4.5H2O0.0257氯化鉀CoCL2.6H2O0.025第18頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五氨基酸和有機(jī)附加物（以MS培養(yǎng)基為例）序號化學(xué)名稱化學(xué)式用量(mg/l)1肌醇C6H12O6.2H2O1002甘氨酸NH2.CH2.COOH23鹽酸硫胺素C12H17CLN4OS.HCL0.14鹽酸吡哆醇C8H11O3N.HCL0.55煙酸NC5H4COOH0.5第19頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五植物激素（植物生長調(diào)節(jié)劑）1、生長素類：IAA，IBA，2，4-D，NAA等。2、細(xì)胞分裂素類：KT，6-BA，ZT等。3、赤霉素類；GA1-GA4，GA7，GA9-GA16，GA24，GA25等4、脫落酸：ABA5、乙烯6、PH值：5.6-5.8

第20頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五培養(yǎng)基的種類、配方及其特點(diǎn)按性質(zhì)分基本培養(yǎng)基：MS、MT（MurashigeandTucher）White完全培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基＋其它成分（激素、有機(jī)物質(zhì)等）第21頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五按狀態(tài)分固體培養(yǎng)基；液體培養(yǎng)基。按作用分：誘導(dǎo)培養(yǎng)基；增值培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基。按培養(yǎng)過程分：初代培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基。第22頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五培養(yǎng)基配方及特點(diǎn)參見課本p17~18第23頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五培養(yǎng)基的配制母液（儲備液）的配制與保存培養(yǎng)基配制第24頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五Ms母液（儲備液）的配制與保存

成分

用量(g/l)每升培養(yǎng)基取用量(ml)母液1（大量元素）NH4NO3KNO3

MgSO4.7H2OCaCL2.2H2OKH2PO4母液2（微量元素）KIH3BO3MnSO4.4H20ZnSO4.7H2ONa2MoO4.2H2OCuSO4.5H2OCoCL2.6H2O８２.５９５.０１８.５４４.０１７.００.０８２０.６２２.２３０.８６０.０２５０.００２５０.００２５２０１０１０１０第25頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五

成分用量（ｇ／ｌ）每升培養(yǎng)基用量（ｍｌ）母液3（鐵鹽）FeSO4.7H2ONa2.EDTA.2H2O２.７３２.７８

１０母液4（維生素、氨基酸）肌醇煙酸鹽酸吡哆醇鹽酸硫胺素甘氨酸１０.００.０５０.００１０.０５０.２

１０第26頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五培養(yǎng)基的配制1、在潔凈的不銹鋼鍋里放入750ml蒸餾水，加入所需要的瓊脂和糖，加熱熔化。2、加入儲備液1－４０ｍｌ，儲備液2、３、４各１０ｍｌ，按需要量加入植物激素。3、用蒸餾水定容到1L。4、調(diào)ｐH值。ＰＨ一般５.８5、培養(yǎng)基的分裝。6、包扎。7、培養(yǎng)基的高壓滅菌。第27頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五培養(yǎng)基的滅菌高溫高壓蒸汽滅菌：121℃，1.1Kg/c㎡，15-20芬，時間過長，培養(yǎng)基成分易變性失效過濾滅菌：在高溫高壓下易分解的培養(yǎng)基和激素類第28頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五第三節(jié)：外植體的選擇與培養(yǎng)主要內(nèi)容：外植體的選擇外植體的滅菌外植體的接種和培養(yǎng)外植體的成苗途徑污染的原因及預(yù)防措施外植體的褐變及其防止措施培養(yǎng)物的玻璃化現(xiàn)象及其預(yù)防措施第29頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五一、外植體的選擇1、外植體（Explant）：是指植物離體培養(yǎng)中的各種接種材料。包括植物體的各個器官、組織、細(xì)胞和原生質(zhì)體等。2、外植體選擇的要求選擇優(yōu)良的種質(zhì)：材料的選擇要有目的,具有一定的代表性,提高成功率,增加實(shí)用性。選擇健壯的植株：選取發(fā)育正常的器官或組織，再生能力強(qiáng)，組培易成功。第30頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五選擇合適的大小：根據(jù)不同的植物而異，太大容易污染，太小，多形成愈傷組織甚至難于成活。一般在0.5-1.0cm之間。選擇最適的時期：一般按植物生長的最適時期選取材料第31頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五外植體的類型1、莖尖（園藝植物組織培養(yǎng)中應(yīng)用最多，繁殖率高，不易發(fā)生遺傳變異，但取材有限）2、莖段（采用嫩莖的切段促進(jìn)腋芽萌發(fā)，取材容易）3、葉（幼嫩葉片組織通過愈傷組織或不定芽分化產(chǎn)生植株，取材容易，操作方便，但易發(fā)生變異）；4、花球和花蕾5、種子、根、塊根、塊莖、花瓣等。第32頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五二、外植體的滅菌

外植體的消毒是組培成功與否的第一關(guān)鍵步驟。外植體的預(yù)處理：對外植體進(jìn)行修整,去掉不要的部分,在流水下沖洗干凈.外植體的表面滅菌：

原則：充分滅菌，但不傷外植體；不同的外植體，滅菌的要求也不一樣第33頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五常用滅菌藥劑的使用和效果消毒劑使用濃/%清除難易消毒時/min滅菌效果次氯酸鈉2易5-30很好次氯酸鈣9-10易5-30很好漂白粉飽和溶液易5-30很好升汞0.1-1較難2-10最好酒精70-75易0.2-2好過氧化氫10-12最易5-15好溴水1-2易2-10很好硝酸銀1較難5-30好抗菌素4-50mg/L中30-60較好第34頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五常用的滅菌方法(1)莖尖、莖段及葉片等的消毒：用清潔劑清洗---75%酒精浸泡10-20min---無菌水洗2-3次或Naclo或升汞溶液泡10-15min---無菌水洗3-4次（2）果實(shí)和種子的消毒：自來水沖洗10-30min---70%酒精漂洗---2%Naclo液浸10min---無菌水2-3次---取出種子培養(yǎng)（3）根及地下部器官的消互毒：自來水沖洗---純酒精漂洗---升汞浸5-10min或2%Naclo液浸10-15min---無菌水洗3次（4）花藥的消毒：自來水沖洗70%酒精浸泡數(shù)秒鐘---無菌水洗2-3次---漂白粉上清液浸10min---無菌水洗2-3次第35頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五消毒注意事項(xiàng)表面消毒劑對植物組織是有害的，應(yīng)正確選擇消毒劑的濃度和處理時間，以減少組織的死亡。在表面消毒后，必須用無菌水漂洗材料3次以上以除去殘留殺菌劑，但若用酒精消毒，則不必漂洗。與消毒劑接觸過的切面在轉(zhuǎn)移到無菌基質(zhì)前需將其切除，因?yàn)橄緞璧K植物細(xì)胞對基質(zhì)中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。若外植體污染嚴(yán)重則應(yīng)先用流水漂洗1小時以上或先種子培養(yǎng)得到無菌種苗，然后用其各個部分建立組織培養(yǎng)。HgCl2效果最好，但對人的危害最大，用后要用水沖洗至少5次。第36頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五三、外植體的接種和培養(yǎng)第37頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五（一）外植體的接種------無菌操作是將表面滅菌的植物材料切碎或分離出器官、組織、細(xì)胞，轉(zhuǎn)放到無菌培養(yǎng)基上的全部過程。整過接種過程均需無菌操作。第38頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五外植體接種全過程

酒精擦拭手外植體消毒浸泡5min器械消毒酒精燈灼燒酒精擦拭培養(yǎng)皿第39頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五酒精擦拭旋轉(zhuǎn)灼燒取外植體接種蓋好瓶塞修剪外植體第40頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五第41頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五第42頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五（二）外植體的培養(yǎng)1、光照2、溫度3、濕度4、氧氣第43頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五愈傷組織途徑：外植體的成苗途徑試管苗外植體愈傷組織根、芽芽芽根如安祖花的組織培養(yǎng)就屬此類途徑第44頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五器官發(fā)生途徑：外植體經(jīng)誘導(dǎo)后直接形成根和芽，進(jìn)而形成完整的植物體。如莖尖培養(yǎng)。第45頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五胚胎發(fā)育途徑：外植體胚狀體（原胚期、球形胚期、心形胚期、魚雷形胚期、子葉期）試管苗第46頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五50年代末期，Steward等人從胡蘿卜的韌皮部用液體培養(yǎng)基通過游離細(xì)胞的分化，獲得了胚狀體。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在植物組織培養(yǎng)中具有胚狀體分化能力的種子植物已達(dá)117種，分屬43科，75屬。培養(yǎng)基的激素成分和氮源影響胚狀體的發(fā)生。有的植物可在無激素培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出胚狀體，如煙草、曼陀蘿、水稻、小麥花藥培養(yǎng)；有的植物需要生長素與細(xì)胞分裂素的一定比例誘導(dǎo)胚狀體，如油茶、酸棗、桃等。在植物組織組織培養(yǎng)中，誘導(dǎo)胚狀體與誘導(dǎo)芽相比較，具有顯著的優(yōu)點(diǎn)，一是數(shù)量多，二是速度快，三是成苗率高。由于胚狀體具有這些優(yōu)點(diǎn)，所以在育種工作及園藝工作中，可用胚狀體作為特定的優(yōu)良基因型個體的無性繁殖手段，同時在研究胚胎發(fā)育中也有很重要的理論意義。第47頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五五、污染的原因及其預(yù)防措施1、污染：植物組織培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料滋生雜菌，導(dǎo)致培養(yǎng)失敗的現(xiàn)象2、污染的原因一是病原菌污染（細(xì)菌、真菌）二是外植體、培養(yǎng)基、培養(yǎng)器皿帶菌三是操作人員未遵守操作規(guī)程。真菌污染第48頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五第49頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五第50頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五污染的預(yù)防措施

組織培養(yǎng)中降低污染率是工廠化生產(chǎn)中不可忽視的技術(shù)環(huán)節(jié)。預(yù)防措施有：防止材料帶菌------選擇取材時間、材料與培養(yǎng)、外植體滅菌等措施；防止用具帶菌------器皿與金屬器械滅菌；操作室要處于無菌狀態(tài)------工作室、培養(yǎng)室滅菌等；操作人員要按照操作程序進(jìn)行。在培養(yǎng)基中加入抗菌素分散接種第51頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五假設(shè)污染率為95%：100塊材料，接種于100支試管，即1塊/支。 得率為：P=（1-95%）100=5塊無菌材料200塊材料，接種于100支試管，即2塊/支。

P1（2污）=95%95%=90.25% P2（1污1得或1得1污）=295%5%=9.5% P3（2得）=5%5%=0.25%若得到1支試管的無菌材料，至少要接種：

1/0.25%=400支，即接種800塊材料，能得2塊無菌材料。若按3塊/支接種，需做8000支試管培養(yǎng)基，接入2.4萬塊材料，才能有1支試管的（得3塊）無菌材料。第52頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五六、外植體的褐變及其防止措施第53頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五褐變

褐變是指外植體在培養(yǎng)過程中體內(nèi)的多酚氧化酶被激后活，使細(xì)胞內(nèi)的酚類物質(zhì)氧化成棕褐色醌類物質(zhì)，這種致死性的褐化物不但向外擴(kuò)散致使培養(yǎng)基逐漸變成褐色，而且還會抑制其他酶的活性，嚴(yán)重影響外植體的脫分化和器官分化，最后變褐而死亡的現(xiàn)象第54頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五影響褐變的因素植物種類：一般木本植物，單寧、色素含量高的植物易發(fā)生褐變?；蛐停和庵搀w的生理狀態(tài)：一般幼齡材料，幼嫩器官和組織，春季取外植體，褐變發(fā)生較輕。培養(yǎng)基的成分：培養(yǎng)基中6－BA或KT能促進(jìn)褐變發(fā)生，而生長素類如IAA可減輕褐變發(fā)生。材料轉(zhuǎn)移時間：第55頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五褐變的防止措施選擇適宜的外植體及最佳培養(yǎng)基：適當(dāng)降低培養(yǎng)基無機(jī)鹽濃度，降低PH值，降低細(xì)胞分裂素水平等，可顯著減輕培養(yǎng)物褐變連續(xù)轉(zhuǎn)移加抗氧化劑：如硫代硫酸鈉、抗壞血酸；加活性碳加多胺類物質(zhì)，如精胺、亞精胺第56頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五七、培養(yǎng)物的玻璃化現(xiàn)象及其預(yù)防措施

第57頁，共69頁，2022年，5月20日，23點(diǎn)12分，星期五玻璃化現(xiàn)象及其產(chǎn)生原因

培養(yǎng)物增殖培養(yǎng)時，若細(xì)胞分裂素濃度過高或細(xì)胞分裂素與生長素相對含量高，培養(yǎng)基中離子種類，比例不適，瓊脂濃度低，不良培養(yǎng)環(huán)境如溫度過低或過高，光照時間過長及通氣不良，易造成組培苗含水量高，莖葉透明，出現(xiàn)畸形，發(fā)生玻