親和層析技術在生物科學中的應用

摘要

Abstract

最近幾十年來．親和層析技術發展十分迅速，廣泛應用于生物分子(如結合蛋白、酶、抑制荊、抗原、抗體、激素、激素受體、糖蛋白、核酸及多糖類等)及組織(如細胞、細胞器、病毒等)的分離和純化，是蛋白質組學研究中重要的技術之一．介紹了親和層析的基本類型及配體舍成的研究進展，概述了親和層析技術在蛋白質組學以及在其他方面的應用和發展動態。Thedevelopmentofaffinitychromatographytechniqueisveryfastinrecentyears，remarkableaccomplishmentshavebeenachievedintheseparationandpurificationofbiomoleculesandorganismsaswellasinstudyingtheinteractionsbetweenbiomolecules．Thecommonlyuseddifferentligandtypesandrecentprogressinsearchingforligandsaredemonstrated.Theapplicationofaffinitychromatographyinproteomicsandinotherareasareoutlined.關鍵字：親和層析；蛋白質；純化；鑒定

Keywords：Affinitychromatography;protein;cellulose;purification;identify

引言

親和層析(affinitychromatography)是利用偶聯親和配體的親和吸附介質為固定相親和吸附目標產物。它具有很高的選擇和分離性能以及較大的載量，只需要一步處理即可使某待分離的生物大分子從復雜的混合物中分離出來，達到千倍以上的純化，并保持較高的活性，是分離純化以及分析生物大分子尤其是蛋白質的有力工具。近幾十年來，親和層析技術發展十分迅速，并在生物技術產品、生物分子及組織的分離和純化領域取得令人矚目的成就．現已廣泛用于分離純化蛋白質、肽、酶及其底物和抑制劑、抗體及抗原、核酸及其特異性作用物、激素及受體、細胞及細胞表面物等等基于此，本文針對親和層析的基本類型，配體的選擇和親和層析在生物學特別是蛋白質組學中的應用等方面作一介紹。1常規材親和層析的類型

1.1材生物親和層析(BAFC)生物親和層析是利用自然界中存在的生物特異性相互作用物質對的親和層析．通常具有高的選擇性，典型的物質對有酶．底物、酶．抑制劑、激素．受體等．1.2免疫親和層析(IAFC)

許多典型的親和層析純化蛋白質的過利用抗原抗體中的一方為配體，親和吸附另一方的分離系統，稱免疫親和層析．免疫親和層析應用相當廣泛．許多親和層析純化蛋白質過程已經使用了單克隆抗體作為親和配體．1.3金屬螯合親和層析(IMAC)

金屬離子親和層析是利用金屬離子的絡合物或形成螯合物的能力吸附蛋白質的分離系統．目的蛋白質表面暴露的供電子氨基酸殘基。

1.4擬生物親和層析(BiomimeticAFC)

擬生物親和層析是利用部分分子相互作用，模擬生物分子結構或某特定部位．以人工合成的配基為固定相吸附目的蛋白質的親和層析。

親和層析是一種非常有效的大規模純化生物技術產品的分級分離技術并已廣泛應用于蛋白質組學和其他領域的研究．

盡管其具有很大潛力，但針對每個目標是否能得到適當的配體，親和層析方法的利用是受到限制的．近年來發展的利用分子模型對配體進行設計和組合化學相結合以經成為一種為特定生物技術需求產生新穎而特異性強的配體的創新方法。2結親和層析配體的設計及應用組合方法篩選配體

2.1親和層析配體的設計

依據蛋白結構設計配體要考慮兩個重要因素：第一正確地預計被設計的配體構像的能力；第二，正確預計配體的親和力的能力．

1)符合一定要求的分子的形狀．例如，線形帶負電荷的分子肝磷脂對于純化DNA—結合酶是一種常規方法¨，另外純化核苷酸結合酶的配體三嗪染料CibacronBlue3GAt具備能與一些酶的核苷酸結合位點形成合適的相互作用所需的幾何結構以及離子和疏水性的基團．2)配體具特異功能團．例如苯甲脒作為胰蛋白酶類蛋白酶的配體，羥氨基酸作為與金屬結合的蛋白的配體．3)兩個或數個已知的底物、抑制劑、效應體或輔助因子這樣的結構模體的結合體衍生的結構模型。例如酮—羧基仿生物嵌合染料—配體被設計作為純化識別(酮)羧基的酶的配體.2.2組合方法篩選配體

應用組合化學的方法建立多肽文庫，然后利用多肽文庫來篩選與目的蛋白特異性結合的多肽配基．這一觀點的提出大大促進了親和層析篩選及合成配基技術的發展．過去的十幾年中已出現了允許產生多達1O種不同的蛋白，肽鏈或核酸文庫的方法．這樣的大文庫使選擇高親和性和特異性的分子成為可能．

2.3出頭設計配體

由于能將X射線晶體學，NMR或同源結構的知識與限定的或組合化學合成以及先進的計算機技術相結合，合理設計親和配體變得更切實可行，有效，符合邏輯且更快．這種方法依賴于利用目標蛋白的結構信息有目的地集中引導配體的合成并使合成的努力限定朝向已經過實驗評價能結合到被檢測目標或預計能結合到目標的方向，該方法包括以下的步驟：

選擇目標蛋白上合適的位點，設計與該位點的三維結構相配伍的配體，合成一個結構上相關聯的固相的組合配體文庫，并針對目標蛋白掃描這個文庫針對IgG的非肽仿生物配體已經建立，它是依據蛋白A的B結構域和IgG的Fc片段組成的復合物的x射線晶體學結構獲得的．利用計算機協助的分子模型，一系列圍繞蛋白A雙肽Phel32-Tyrl33的仿生物分子被設計出．其中一個這樣的配體能與人類IgG結合，該配體在三嗪環上帶有3-氨基苯酚和4氨基—1—萘酚部分．當這個仿生物配體被固定到瓊脂糖上被成功地用于純化人類血漿的IgG．為重組胰島索前體MI3以及重組人類凝固因子VIIa等而設計的仿生物學配體的類似方法也已建立．3結親和層析的應用

3.1親和層析在蛋白質組學中的應用

蛋白質組學最常用的實驗技術是用于分離蛋白的雙相電泳(2-DE)和用于鑒定被分離蛋白的質譜(MS)技術．然而親和層析也是起很大作用的分離方法．蛋白被2-DE分離前親和層析主要被用作選擇性地預先濃縮和預處理樣品．其應用包括去除一種或一類會干擾2-DE的分辨率的蛋白，一個典型的例子是血清及腦脊髓液樣品的白蛋白和免疫球蛋白IgG的去除，是通過吸附在親和樹脂上的方法進行的，這樣可顯著提高2-DE膠上蛋白斑點的分辨率．另外，親和層析可濃縮低豐度的蛋白，這樣它們就可在2-DE膠上被看到；還可將所有蛋白分類成兩組或幾組以便進一步分析。3.2分離純化目的蛋白、定量測定

近年來，高速發展的生物制藥工業已廣泛應用親和層析技術作為其重要的分離純化和定量測定用于臨床藥物的工具．親和層析最常用于靶標蛋白尤其是疫苗的分離純化上．特別在融合蛋白的分離純化上，親和層析更是起到舉足輕重的作用，因為融合蛋白具有特異性結合能力．親和層析在基因工程亞單位疫苗的分離純化中應用相當廣泛，其中，以對分別帶有(His)和GST親和標記的融合蛋白的抗原Ni-NAT和GST親和層析應用相當廣泛．金屬螯和層析與免疫親和層析也得到一定的應用．3.3生物分子間相互作用的鑒定

親和層析也被用來研究生物系統中生物分子間發生的相互作用,該領域已被用來檢驗各種生物系統,包括凝集素lectin／糖,酶／抑制劑,蛋白／蛋白,以及DNA／蛋白間的相互作用,臨床上主要將該技術用于研究藥或激素與血清蛋白間的結合,兩種層析方法可用來研究生物間相互作用.

3.4親和層析與其他分析技術相結合近年來的另一發展趨勢是尋求更加優化的系統設計和安排形式，從而獲得快速、優良的選擇性以及很大數量被檢測的樣品．親和層析與其他分析技術串聯結合即可很好地達到這一目的．目前已經有很多成功運用親和層析(AFC)．MS、AFC，HPLC、AFC．HPLC．MS、AFC．CE(毛細管電泳)等串聯結合的應用．這種結合因其不可替代的優點，仍將繼續發展.4結論

在發現和生產治療疾病的蛋白方面的挑戰已經使人們有必要重新考慮設計和進行純化的過程，這種選擇主要是由方法的引進速度,有效性,穩定性和經濟承受能力決定的.傳統的純化規程正被高度選擇