造成重大的經濟損失，嚴重影響人、畜健康和生產力發展。隨著我國市場經濟的發展，人民生活需求的提高，飼養畜密度的增加，動物性食品和毛、皮革制品的利用日趨普及，以及土地資源的開發和環境的改造，各類物資的頻繁交流，炭疽對我國人民生命安全和財產構成很大威脅，如不采取及時、有效的監控措施，炭疽發病勢將有增無減，隱患無窮。鑒于此種傳染性疾病在我國仍屬一種高、危病種，加以它尚有自外輸入我國的潛在可能，在今后加速發展市場經濟的的新形勢下，加強各級領導對炭疽防制工作的重視和支持，提高廣大的基層相關工作人員對炭疽的認識和防病能力，是很有必要的。要做到早發現、早治療、早控制，必須有相關豐富的流行病學和臨床知識外，一定要熟練掌握相關的實驗室檢測技術。第一頁，共三十六頁。二、炭疽病原檢驗程序

圖1示。

皮膚滲出物、血液、糞便或嘔吐物、土壤或動物標本直接涂片（革蘭氏染色）細菌培養必要時做PCR見到革蘭氏陽性大桿菌，可定為臨床診斷病例未見到革蘭氏陽性大桿菌，繼續別的試驗直接劃平板直接劃平板后的標本可增菌培養培養12~24h，選可疑菌落做青霉素敏感和噬菌體裂解試驗兩項均為陽性，可確診為炭疽第二頁，共三十六頁。三、血清中炭疽抗體水平檢測（一）意義人血清中炭疽抗體水平檢測的意義主要在于下列幾個方面：正常人群血清炭疽抗體水平資料收集，特殊人群（產業工人、畜牧人員、實驗室人員）血清炭疽抗體水平觀察，疫苗接種人群血清炭疽抗體水平分析，患病人群血清炭疽抗體水平研究，在患者標本中未獲得炭疽芽胞桿菌陽性檢測和分離結果的情況下，血清抗炭疽特異性抗體滴度出現4倍或4倍以上升高也可以結合流行病學線索和臨床表現進行確診。第三頁，共三十六頁。（二）檢測方法目前均為酶聯免疫吸附實驗（ELISA）1.標本的采集和保存：發病初期和恢復期（發病后15天左右）各采一次血，血清采集時應盡量避免溶血，因紅細胞破裂可釋放過氧化物酶活性物質干擾讀取方法的結果，可造成假陽性，長菌的標本同樣的道理易產生假陽性；抗凝不完全的標本因纖維蛋白元的干擾而造成假陽性，建議盡量不用抗凝血尤其是用肝素抗凝劑；標本在冰箱中保存時間過長易導致血清IgG聚合，使試劑本底加深，一般血清置4℃冰箱5天內完成測試，如需保存一周以上則要-20℃冰凍保存，融解時應上下顛倒充分混勻，同時避免氣泡。第四頁，共三十六頁。2.注意事項：ELISA實驗的結果受操作影響很大，每個步驟包括加樣、溫育、洗滌、顯色、酶標儀讀數均應認真負責才能充分發揮ELISA的高靈敏、強特異的優點。因此，應建立實驗項目的標準操作程序(SOP)。報告方式以定量分析結果的滴度單位表示；檢測時應以接種疫苗前或初報告病例地方的人或動物的血清作為陰性血清，如有可能也可設陽性血清對照。陰性血清每次都要和待測標本同時做。第五頁，共三十六頁。（三）具體程序1.包被抗原：用包被緩沖液將已知抗原稀釋至0.3μg／ml，每孔加0.1ml，4℃過夜。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。洗滌緩沖液配方為：Tris2.42克，1mol/LHCI13mL,吐溫-20（0.05%）0.5mL,加蒸餾水至1000mL。2.待檢血清反應：加1:8稀釋(稀釋液為生理鹽水)的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應孔中，置37℃孵育60分鐘，洗滌3次，每次3分鐘。(同時做空白、陰性及陽性孔對照)第六頁，共三十六頁。

3.酶標抗體反應：于反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標第二抗體(抗抗體)或SPA0.1ml，37℃孵育60分鐘，洗滌3次，每次3分鐘。4.顯色反應：于各反應孔中加入等體積混合的顯色底物A、B溶液0.1ml，37℃20分鐘。底物A液（磷酸鹽枸櫞酸緩沖液，pH5.0）配方為：0.2mol/LNa2HPO4(28.4g/L)25.7mL,0.1mol/L枸櫞酸(19.2g/L)24.3mL,H2O20.1%,蒸餾水50mL。底物B液[TMB(四甲基聯苯胺)使用液]配方為：TMB3.90g,枸櫞酸10.52g,EDTA1.86g,甘油2000mL,DMSO300mL,加熱溶解后加蒸餾水至10000mL。第七頁，共三十六頁。5.終止顯色：于各反應孔中加入顯色終止液(0.5mol/LH2SO4)0.1mL終止反應。6.結果判定：實驗結果用酶標儀判讀，被檢孔OD值達陰性血清對照孔OD值的2.1倍時，始可判為陽性。四、實驗項目（一）標本采集（二）細菌培養（三）涂片、G染色、莢膜染色、芽孢染色、光鏡檢查（四）噬菌體裂解和青霉素敏感性試驗（五）PCR基因檢測（六）菌種保存第八頁，共三十六頁。五、實驗方法（一）標本采集1.采集標本時應遵循的原則:盡可能在抗生素治療開始前采集標本，除必要時并在具備操作病毒細菌條件的實驗室內，不得用解剖的方式獲得標本。所需的血液與組織標本，均應以穿刺方式取得。所有標本均置無菌容器中2.血液標本：所有疑似病例，采取血液標本5-10ml（不加抗凝劑）。3.皮膚損害處標本：玻片直接在皮膚破損處壓蘸；再用棉簽采皮膚損害處滲出物，（不加增菌肉湯）。4.糞便與嘔吐物標本：有消化道癥狀的采糞便或嘔吐物標本，注意選取其中混有血液的部分。5.痰與咽拭子標本：有呼吸道癥狀的收集痰液及咽拭子標本。第九頁，共三十六頁。

6.腦脊液標本：表現腦膜刺激癥狀的病人，腰椎穿刺獲取腦脊液。7.尸體標本的采取：可通過穿刺心臟獲得血液或穿刺肝臟等實質性臟器獲得組織標本。8.有病死動物接觸史可采病死動物標本或相關土壤等環境標本。（二）細菌分離培養：全部標本均應進行細菌分離培養。1.標本處理：在生物安全柜內打開裝標本的專用容器。在正常情況下應該是無菌的標本，如血液或腦脊液，直接涂布平板，每平板0.1ml左右，組織標本應先以無菌剪刀剪開一斷面，在培養基表面壓印，然后以接種環涂開。疑似病例的滲出液標本，直接涂布平板后，剩余標本可放入肉湯增菌液中增菌。土壤等有污染或陳舊的標本，均首先制成懸液（土壤等標本經自然沉淀除去粗大沉淀物），10000轉／分鐘離心5第十頁，共三十六頁。分鐘，棄去大部分上清液，留少量液體與沉淀物混勻，沸水浴加熱15分鐘后，取適量涂布平板。2.細菌分離培養：將上述處理過的標本冷卻后，用移液器吸取0.1ml左右于固體培養基上，用接種環涂布均勻，在37℃孵育12-24h后，檢查是否長出可疑的炭疽芽胞桿菌菌落。3.挑選可疑菌落：上述平板在37℃孵育12-24小時后，檢查是否長出可疑的炭疽芽胞桿菌菌落。炭疽芽胞桿菌菌落的形態為：灰白色、不透明、中等大小，常不規則，表面呈毛玻璃樣。如圖2示。第十一頁，共三十六頁。圖2第十二頁，共三十六頁。（三）涂片、G染色、莢膜染色、芽孢染色、光鏡檢查1.在低倍鏡下觀察，可見菌落呈卷發狀，羊毛狀如圖3,4示。2.革蘭氏染色陽性，細菌呈鏈狀排列，菌體兩端平齊，呈竹節狀圖5,6,7示。在機體內或特殊培養條件下能形成莢膜，印度墨汁負染時可見菌體周圍有肥厚的莢膜，多色美蘭染色時菌體染成藍色、莢膜染成紅色。在固體培養基上，于大氣條件下可形成芽胞，芽胞體染不上顏色(革蘭氏)，位于細菌中央，呈卵圓形，不膨脹圖8示；石炭酸復紅染色，芽胞為紅色，菌體為藍色圖9示。第十三頁，共三十六頁。圖3第十四頁，共三十六頁。圖4第十五頁，共三十六頁。圖5第十六頁，共三十六頁。圖6第十七頁，共三十六頁。圖7第十八頁，共三十六頁。圖8第十九頁，共三十六頁。圖9第二十頁，共三十六頁。（四）噬菌體裂解和青霉素敏感性試驗將上述可疑菌落挑出，劃線接種于平板之上，在劃線區內一處滴一滴診斷用炭疽噬菌體，另一處貼一片青霉素紙片。37℃孵育8-24小時后，在滴噬菌體處有透明噬菌斑，青霉素紙片周圍有明顯的抑菌環（圖9）示，便可判定接種物為炭疽芽胞桿菌。在患者或尸體中分離獲得炭疽芽胞桿菌，炭疽的診斷即可確立。第二十一頁，共三十六頁。圖10第二十二頁，共三十六頁。（五）PCR基因檢測1.PCR標本處理：用于PCR模板制備的標本類型有土壤，毛皮，臟器，組織標本，棉拭子。（1）土壤標本：用硬紙條對折取約0.1～0.3g土壤標本置于1.5ml離心管中，加入蒸餾水或pH8.0的TE溶液至0.5ml，用移液器輕輕攪動，使其懸浮，蓋嚴蓋子。（2）毛皮標本：為避免毛皮受氣流影響飛到各處，在安全柜中放一個紙袋，在袋子中用無菌剪刀將毛皮標本剪碎成小塊，取剪碎的標本置于1.5ml離心管中，用移液器或吸管加入蒸餾水或pH8.0的TE溶液至0.5ml，蓋嚴蓋子。用過的剪刀、鑷子放入盛有消毒液的加蓋容器內。第二十三頁，共三十六頁。（3）臟器（心、肝、脾、肺等），組織標本：用無菌剪刀和鑷子約取1g標本，放入研磨器中研磨，再加入0.5ml蒸餾水或pH8.0的TE溶液懸浮，混勻后，用移液器將液體部分移入1.5ml離心管中，蓋嚴。用過的容器及標本碎塊放入可封閉容器中，剪刀、鑷子等放入盛有消毒液的加蓋容器內。（4）棉拭子標本：在棉拭子容器中加0.5ml蒸餾水或pH8.0的TE溶液，用無菌鑷子擠壓拭子幾次，用移液器或吸管吸液體放入1.5ml離心管中，蓋嚴。將以上放有標本的離心管蓋子封好，100℃加熱20min。10000rpm離心10min，用注射器將上清液吸出，必要時應用0.22μm濾器過濾除菌，濾液用一個新離心管收集即為模板。制備好的模板暫時不用時，要放在－20℃保存。第二十四頁，共三十六頁。

2.PCR操作程序：（1）所用引物序列如下：其中cap外和cap內檢測的是同一個基因，可只使用一對。引物名稱序列基因定位擴增長度（bp）pagA普F:ATTTGCGGTAACACTTCACTpagA基因－pXO1923R:AGACCGTGACAATGATGGAAcap外F：CCTGGTTGTTCTTTTCGTTGCcap基因－pXO21242R：CGGATTGTATATGGAGTGGGcap內F：TTTCACCAGCACCCACATAGcap基因－pXO21002R：GGGACAGGAATGTTTGGATCrpoB普2F:CCAACAGTAGAAATGCCR:AATTTCACCAGTTTCTGGATCTrpoB基因－染色體197第二十五頁，共三十六頁。（2）反應體系：在PCR管內依次加入以下成分，反應體系總共25ul，10×反應緩沖液2.5μl4×dNTP混合物（每種2.5mM）2μl引物（上游）1μl引物（下游）1μl待測模板1μlTaqDNA聚合酶0.5μl（2-3U）無菌去離子水17μl使用2×mix的反應體系：25μl2×mix12.5μl引物（上游）1μl引物（下游）1μl待測模板1μl無菌去離子水9.5μl第二十六頁，共三十六頁。

（3）反應條件：預變性95℃5min；然后95℃1min，55℃1min，72℃1min，30個循環；最后72℃延伸5min。（4）電泳：1%瓊脂糖凝膠熔化，稍涼后，加入核酸染料（100ml凝膠加入染料5ul），倒入模具中，插入梳子，待凝固后放入電泳槽內，拔掉梳子。從擴增好的PCR管內吸取5ul與1ul6×loadingbuffer混勻后加入加樣孔內，兩側孔內加入5ulDNAMarker，100V，電泳1小時左右，在紫外透射儀或讀膠儀上觀察結果。第二十七頁，共三十六頁。

（5）結果分析：圖10示。pagA擴增結果，片段長度為923bpcap內擴增結果，片段長度為1002bpcap外擴增結果，片段長度為1242bprpoB2擴增結果，片段長度為197bp第二十八頁，共三十六頁。圖11第二十九頁，共三十六頁。（六）菌種保存1.50%甘油液保存：在固體培養基表面，于37℃培養4天以上，應有70%以上可形成芽胞。用磷酸鹽緩沖液洗下培養物，根據混濁度配制成約每毫升2×109個細菌的懸液，加入等量的滅菌甘油后，分裝入2ml螺口菌種管內，每管1ml。每株菌至少應制備2支，記錄制備支數。將菌種管置于菌種保藏盒中，4℃保存。2.半固體保存：從培養一天的固體培養基上用接種針挑取細菌，穿刺半固體培養管，37℃過夜培養，第二天取出，在半固體表面滴加一滴滅菌甘油。每株菌至少應制備2支，記錄制備支數。將菌種管置于菌種保藏盒中，4℃保存。第三十頁，共三十六頁。

3.菌種保存管保存：從培養兩天以上的固體培養基上用接種環挑取細菌，加入菌種保存管中，混勻，去掉適量液體，做好標記，置于菌種保藏盒中，-80℃保存。每株菌至少應制備2支，記錄制備支數。第三十一頁，共三十六頁。六、炭疽實驗室防護和實驗操作注意事項在炭疽桿菌的研究、檢測中，特別要求注意“控制”，避免對自身、他人和外界環境造成污染。特殊病原一般要求在生物安全2~4級實驗室生物安全柜（BiosafetyLevelX）