第一節組織培養基本概念第二節組織培養細胞生物學第三節

體外培養細胞成功率的分析第四節

建立細胞系或細胞株第五節

組織培養的基本操作和培養技術第六節

腫瘤細胞的培養本課內容2第一節組織培養基本概念一、組織培養基本概念二、對組織培養的評價三、對組織培養工作者的要求和工作方法45一、組織培養基本概念組織培養（TissueCulture）：指的

是從體內取出組織模擬體內生理環境，在無菌、適當溫度和一定培養條件下，使之生存和生長并維持其結構和功能

的方法。體外培養細胞種類（In

Vitro）細胞培養培養組織培養6Making

a

Primary

Culture7細胞培養（CellCulture）：用的是同樣方法，培養物是單個細胞或細胞群。891011培養（

an

Culture）：培養物是的原基、

的一部分或整個

，使之在體外生存、生長和保持一定功能的方法。an

culturecanbeused

tostudyearly

kidney

developmentinvitro(a).Branchingmorphogenesisandepithelialization

ofmesenchymalprecursor

cells

canbe

visualized

directly

(b)orvia

aHoxB7-EGFP

transgenethat

isexpressedspecifically

intheureteric（輸尿管）

bud.enhanced

green

fluorescence

protein強化綠熒1光2

蛋白13組織培養與細胞培養的關系組織培養與細胞培養并無嚴格區別:組織培養可出現細胞單一化現象→變成單一類型細胞→細胞培養。細胞在培養中的生命活動是互相依

存的，呈現著一定的“組織”特性。1415體外培養細胞種類16二、對組織培養的評價優點：非常好的實驗對象能長時間直接觀察活細胞的形態結構和生命活動；可用于細胞學、遺傳學、免疫學、實驗醫學和腫瘤學等多種學科的研究工作。便于使用攝影、攝和閉路電視等方法進行記錄，能直接觀察活細胞變化。可供研究的細胞種類極其廣泛，從生物到高等生物，以及人類；胚胎→成體；正常細胞→腫瘤細胞。17對組織培養的評價便于使用各種不同的技術方法，例如相差顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯微鏡、組織化學、同位素標記等方法觀察和研究細胞。培養細胞帶有與體內細胞同等的組（Genome），也是分子生物學和

工程的研究對象；細胞培養技術已是分子生物學和工程的重要組成部分。18對組織培養的評價易于施用物理、化學和生物因素等進行研究。可同時提供大量生物性狀相似的實驗對象，耗資少，比較經濟。已成為生物制品、單克隆抗體生產和 工程制品等的生產

。1920對組織培養的評價不足之處離體，獨立生存在人工培養環境中，與體內環境相比，差異很大。在利用培養細胞做實驗對象時，不應視為與體內細胞完全一樣，把實驗結果外推至體內，輕易作出與體內相同的結論。21三、對組織培養工作者的要求和工作方法除掌握操作技術之外，尚需明白各種操作的基本原理。要有判定細胞生長好壞和是否發生污染的能力。熟悉體外培養細胞的生存條件、細胞的生物學性狀和與此有關的基本理論知識。實驗操作要求應將所有操作程序如洗刷、配液、 等，制定出

的規范和要求。各種用液均由專人負責配制，并按規程行事：濃度精確，滅菌可靠。所有 好的溶液和試劑瓶上都要有 ，注上名稱、濃度、與否和

日期。一切培養用品都要有固定的存放地點，其中尤為重要的是：培養用品和非培養用品應嚴

格分開；已

與未

品應嚴格分開存放。2223第二節

組織培養細胞生物學24一、體內外細胞的差異與分化二、培養細胞形態分類三、培養細胞的大體形態四、組織培養細胞的生長和增殖過程五、培養細胞生存環境和條件25概念細胞生長：細胞體積增大；細胞增殖：細胞數量增多。一、體內外細胞的差異與分化它們的增殖方式是相同的，均賴于有絲

。體內、外細胞的差異關鍵在于細胞的分化，從而細胞分化是檢測細胞差異的問題。26（一）體內、外細胞的差異培養細胞最多見的表現：失去原有組織結構和細胞形態、分化減弱或不顯、出現類似

“反祖”現象；細胞趨單一化，或獲得不死性，或變成具有惡性性狀的細胞群。每個細胞的生命活動，均聽命于外源信號（來自其它細胞），通過相關

的調控，使之發生增殖或分化的表達。當細胞被離體培養后，信號來源切斷，特定

分化表達減弱或停止。而進化中保守的細胞增殖活動卻可維持；遂使體內外細胞出現了差異。27（二）培養細胞的分化細胞分化的概念：是指同一來源的細胞通過

逐漸產生結構和功能上穩定性差異的過程。即一種類型的細胞在形態結構、生理功能和生物化學特性方面穩定地轉變為另一類型細胞的過程。在

發育中，由一個或一種細胞增殖產生的后代，在形態結構和生理功能上發生穩定性的差異的過程稱為細胞分化（cellular

differentiation）。2829細胞分化的特點主要可以概括成四點持久性：細胞分化貫穿于生物體整個生命進程中,在胚胎期達到最大程度穩定性和不可逆性：一般來說，分化了的細胞將一直保持分化后的狀態，直到。普遍性：生物界普遍存在，是生物

發育的基礎。正常情況下，細胞分化是穩定、不可逆的。一旦細胞受到某種刺激發生變化，開始向某一方向分化后，即使引起變化的刺激不再存在，分化仍能進行，并可通過細胞

不斷繼續下去。遺傳物質不變性：細胞分化是伴隨著細胞進行的，親代與子代細胞的形態、結構或功能發生改變，但細胞內的遺傳物質不變。30細胞分化的機制：極其復雜。是細胞與細胞、細胞與體液和細胞與細胞外基質相互作用下，有眾多

參與、多階段和多環節的動態演變過程。3132（三）培養細胞的分化不適應（Deadaptation）:細胞在原體內時所擁有的分化特性減弱或不顯。因環境改變所致。脫分化或去分化（Dedifferentiation）：細胞失去發生分化的能力。很可能是基因變異所致。在于是否存在有誘導細胞發生分化的因子如在培養液中存在有相應的因子時，體外培養細胞同樣能發生分化現象。如Friend細胞（小鼠紅白血病細胞）在一定條件下可以血紅蛋白，標志著腫瘤細胞向正常細胞狀態轉變。細胞惡變的本質是細胞增殖生長和分化調控的失控。誘導細胞發生分化是癌細胞逆轉的表現。培養細胞是研究分化最理想的實驗對象。細胞分化的關鍵33二、培養細胞形態分類培養細胞形態懸浮型多形型細胞上皮型細胞貼附型成纖維型細胞型細胞34貼附型細胞：在培養時能貼附在支持物表面生長。懸浮型細胞：不貼壁，懸浮生長，如某些癌細胞和白血病細胞。胞體圓形。優點：生存空間大，容許長時間生長，能產生多量細胞，便于做細胞代謝研究。35特點：細胞

呈梭形或不

規則三角形，有卵圓形核，胞質向外伸出2~3個突起。呈放射狀、火焰狀或漩渦狀走行。中胚層間充質的組織。成纖維型細胞：細胞來中胚層間充質組織。除真正的成纖維型細胞，心肌、平滑肌、成骨細胞、血管內皮細胞。36型細胞特點：細胞在支持物上散在生長，一般不連接成片。細胞質經常伸出偽足或突起，呈活躍的或變形運動，速度快而且規則。不很穩定，有時亦難和其它型細胞相區別。37特點：細胞扁

平不規則多角

型，核圓，細

胞緊密相連呈

單層膜。細胞

增殖數量多時，整塊上皮膜隨

之移動；處于

上皮膜邊緣的

細胞多與膜相

連，很少脫離

細胞群單獨活

動。上皮型細胞于內、外胚層細胞。組織:皮膚表皮及其衍生物、消化道分上皮、肝、胰、肺泡上皮。38上皮型細胞：人肝癌細胞細胞扁

平不規

則多角

型，核

圓，細

胞緊密

相連呈

單層膜。39多形型細胞特點：難以確定它

們規律的

細胞形態，如神經組

織的細胞

等。40412.

貼壁細胞：圓形

短時間內

扁平圓餅型（放射延展細胞）

極性細胞1.

懸浮細胞：圓形細胞與球體呈同心圓層（附于球體表面）0.5~2h三、培養細胞的大體形態懸浮狀態的圓形細胞細胞貼壁延展過程極性細胞：常伸出偽足，使細胞發生定向運動。當細胞互相接壤成片后，極性常變得不明顯。貼壁的放射延展細

胞：細

胞質可

區分為：內質：核周胞質稠密區，內含有較多細胞器。外質：物色透明包

繞內質，含微絲

和微管。42三、培養細胞的大體形態體外培養活細胞的形態光鏡下，細胞均質而透明，結構極不明，只有用相差顯微鏡才能看清細胞的輪廓和結構。一般有12個核仁。用固定染色法和特殊技術可顯示出細胞器等結構，但在活細胞中卻不易觀察到。細胞機能狀態不良的形態細胞輪廓會增強，反差增大。在胞質中時而出現顆粒、脂滴和空泡等，是細胞代謝不良的表現：反差很大的暗紅色小顆粒是變性的線粒體。43影響細胞形態的因素細胞在體外生存時間、細胞種類。初代培養的正常二倍體細胞：除大體形態外，在構造和生物學形狀上與原體內細胞近似性大，細胞均質性和都很強。傳代細胞：輪廓增強、核仁增多、有時出現雙核或多核巨細胞等。轉化細胞：形態變化更大4445四、組織培養細胞的生長和增殖過程1.

傳代（Passage

or

Subculture)：當培養細胞增殖達到一定密度后，則需要分離出一部分細胞和更新培養液，否則將影響細胞的繼續生存，這一過程叫傳代。組織培養細胞生命期（LifeSpan

of

Culture

Cells)是指細胞在培養中持續增殖和生長的時間。視細胞的種類、性狀和原供體的

等情況。人胚二倍體成纖維細胞可傳30~50代，相當于150~300個細胞周期，約一年左右。肝細胞或腎細胞：幾代或十幾代。46原代培養期傳代期期3.

培養細胞全生存過程三個階段4748即從體內取出組織接種培養到第一次傳代階段，一般持續約1~4周。特點：細胞群是異質的（Heterogenous），細胞相互依存性強。多呈二倍體核型，和體內細胞性狀相似性大，是檢測藥物很好的實驗對象。（1）原代培養（Primary

Culture）期492.

傳代期初代培養細胞一經傳代便改稱作細胞系（Cell Line）。特點：細胞增殖旺盛，并維持二倍體核型，也叫二倍體細胞系(diploid

cell

line)。為了保存二倍體細胞性質，細胞應在初代或傳代早期凍存為好。一般細胞在10代以內凍存。傳代10~50左右，細胞增殖減慢。3.

期特點：仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細胞形態輪廓增強，最后

凋亡。細胞可發生自發轉化（SpontaneousTransformation）轉化的標志之一是細胞可獲得永生性（Immortality）或惡性性（Malignancy）。永生性即細胞獲持久性增殖能力（無限細胞系）。5051無污染環境溫度氣體環境和氫離子濃度體外培養細胞生存所需基本物質滲透壓培養基附著物抑制細胞生長因素細胞代謝和調控五、培養細胞生存環境和條件52無污染環境代謝物要及時清除。溫度36.5℃±0.5℃。培養細胞對低溫的耐受力比對高溫強。溫度達43℃以上1小時，細胞都將被殺死。氧氣參與三 。95%氧氣，5%CO2。CO2能維持培養基的pH值（7.2~7.4），細胞耐酸性比耐堿性大一些，在偏酸性環境中更利于生長。細胞在生長過程中隨著細胞數量的增多和代謝活動的增強，不斷CO2，致培養基變酸。CO2+H2O←→H2CO3

←→

H+＋HCO3－CO2使pH值降低。3.

氣體環境和氫離子濃度5354體外培養細胞生存所需基本物質①糖②氨基酸③促生長因子④元素、促細胞貼附物質滲透壓人血漿滲透壓為290Osm/kg大多數細胞為260~

320

Osm/kg6.

培養基①培養基（Synthetic

Medium）：是按人和動物體內細胞所需成分模擬的、配方恒定的一種較理想的培養基。對動物細胞來說只能維持細胞的生存，要想使細胞生長和增殖，還需補充部分天然培養基②天然培養基：主要來自動物體液或從組織中分離提取的成分，其營養性較高，但成分復雜，差異較大，在來源上有一定限制。55③

無

培養基應用：研究細胞生長因子、單克隆抗體的

以及細胞

產物的研究等56絕大多數培養細胞需附著在適宜的底物上才能生長。細胞貼附在底物上生長的性質稱錨著依賴性。①玻璃②

塑料：聚苯乙烯；聚四氟乙烯：可制成薄膜，建成小塊后能置入各種平皿中，適于細胞貼附生長，便于取出、染色和做電鏡切片。③微載體：是由聚苯乙烯和聚丙烯酰胺制成的小球體，附著面大，利于大量繁殖細胞。④飼細胞（Feeder

Cell）：可用成纖維細胞或其它細胞長成單層后，再用大劑量射線照射，使細胞失去增殖能力但尚存活和有代謝活動。令其作為底物，將其它細胞接種于其上；伺細胞的代謝產物利于其它細胞生長。可用于培養特殊難培養細胞。7.

附著底物578.

抑制細胞生長因素物質或微生物能抑制細胞生存和生長滅活 ，消滅 物質9.

細胞代謝和調控：糖、蛋白質、脂類、核酸代謝（略）58第三節

體外培養細胞成功率的分析一、組織和細胞供體二、培養條件三、貼附底物四、培養方法59關鍵在于初代培養何謂培養成功？兩步驟培養物必須能貼附在底物上，繼而細胞才能發生運動、生長增殖、細胞數量增多，它標志著成功率達90%以上或者說已基本成功。擴大再培養，使細胞數量增多和繼續生存。60如何使第一步獲得成功？一、組織和細胞供體來自年幼

比年老者易于培養分化低的組織比分化高的易培養一個培養物中的細胞成分性狀是不均一的，即異質性，表現在分化程度、生物性狀、

增殖能力和對體外培養環境的適應能力不同。如皮膚培養時，成纖維細胞大多先生長，并能壓過表皮細胞的生長；干細胞比非干細胞易生長繁殖。6162二、培養條件不同細胞對培養基需求不同，應選擇相應的培養基。永生性細胞系和腫瘤細胞系等適應性強，可在各種培養基中生存。培養正常人上皮細胞尚需很多特殊生長因子，單細胞克隆需要用條件培養基和Ham

F12培養基。培養特定細胞時，應能了解到該細胞的生物學性狀和特殊需求成分才易獲成功。三、貼附底物不同細胞對附著底物要求不同，表皮細胞適應在膠原層生長。培養貼附型細胞時，第一步需要使細胞能夠貼壁，貼附是細胞增殖生長的條件，細胞首先貼賦于底物上才能生長繁殖。63四、培養方法不同消化方法對貼壁和生長增殖有影響，膠原纖維多的組織適用膠原酶消化，上

皮細胞適用胰蛋白酶消化。64第四節

建立細胞系或細胞株一、體外培養細胞的種類和命名立細胞系或細胞株的要求三、已建立細胞系或細胞株的鑒定、管理和使用65一、體外培養細胞的種類和命名1.

初代培養（primary

culture）初代培養又稱原代培養，即直接從體內取出的細胞、組織和

進行的第一次培養物。一旦已進行傳代培養（Subculture）的細胞，便不再稱為初代培養，而改稱細胞系。662.

細胞系初代培養物開始第一次傳代后的細胞，即改稱之為細胞系（Cell

Line）.如細胞系的生存期有限，則稱之為有限細胞系（Finite

Cell

Line）.已獲無限繁殖能力能持續生存的細胞系，稱連續細胞系或無限細胞系（InfiniteCell

Line）.6768NIH

3T

3

\

Rat

1

\

10T1/

2惡性轉化細胞系：永生性、異體致瘤性無限細胞系或轉化細胞系：只具有永生性而無惡性的細胞系。亞系（Subline）：由某一細胞系分離出來的、在性狀上與原細胞系不同的細胞系，稱該細胞的亞系。3.

克隆細胞株從一個經過生物學鑒定的細胞系用單細胞分離培養或通過篩選的方法，由單細胞增殖形成的細胞群，稱細胞株（cell

strain）。再由原細胞株進一步分離培養出與原細胞株不同的細胞株，稱該細胞株的亞株（Substrain）。694.

二倍體細胞細胞群數目具有與原供體二倍體細胞數目相同或基本相同（2n細胞占75%或80%以上）的細胞群，稱二倍體細胞培養。可供研究衰老之用。在初代或2~5代凍存作為原種。705.

遺傳缺陷細胞從有

遺傳缺陷者取材（主要為成纖維細胞）培養的細胞，或用人工方法誘發突變的細胞。這類細胞可能具有二倍體核型，也可呈異倍體716.

腫瘤細胞系或株具有不死性和異體接種致瘤性命名舉例：Hela：為供體者的名字（來自宮頸癌）CHO：中國倉鼠 細胞（Chinese

HamsterOvary）宮-743：宮頸癌上皮細胞，1974年3月建立NIH3T3： 國立衛生

（NationalInstitute

of

Health）建立；每3天傳代一次，每次接種3×105細胞/毫升。72立細胞系或細胞株的要求組織來源：應說明細胞供體所屬物種，來自、動物或其它；供體的、、取材的或組織；如系腫瘤組織，應說明臨床病理，組織來源，以及病例號等。細胞生物學檢測：應了解細胞一般和特殊的生物學性狀，如細胞的一般形態、特異結構、細胞生長曲線和

指數、倍增時間、接種率；特異性，如為腺細胞有否特殊產物；如為腫瘤細胞，應力求證明細胞確系來源于原腫瘤組織而非其它，并仍保持惡性性，為此需做軟瓊脂培養、異體動物接種致瘤性和對正常組織浸潤力等試驗。培養條件和方法：指明適用的培養基、種類、用量以及細胞生存的適宜pH等。73三、已建立細胞系或細胞株鑒定、管理和使用ATCC（

標準細胞庫或細胞銀行）入庫細胞要求檢測項目如下培養簡歷：組織來源日期、物種、組織、性別、

、供體正常或異常健康狀態、細胞已傳代數等。凍存液：培養基和防凍液名稱。細胞 ：融解前后細胞接種存活率和生長特性。培養液：培養基種類和名稱（一般要求不含抗生素）、 來源和含量。細胞形態：類型，如為上皮或成纖維細胞等。核型：二倍體或多倍體，標記 的有無。無污染檢測：包括細菌、真菌、支原體、原蟲和 等。物種檢測：檢測同工酶、主要為G6PD和LDH，以證明細胞有否交叉污染。免疫檢測：一兩種細胞建立者：建立者學檢測。、檢測者

。76第五節 組織培養的基本操作和培養技術一、培養室內的無菌操作二、基本操作和培養技術三、常規組織培養法7778一、培養室內的無菌操作培養用品布局緩沖液培養瓶架培養瓶吸管瓶帽燈廢液缸培養液架吸管架后備品培養液79培養室內的無菌操作程序超凈臺無人時開紫外燈（30瓦）20~30min,勿置培養細胞和培養用液等物；培養室用紫外燈或2%碳酸溶液噴霧消毒。無菌服、帽子、

，每周高壓一次

液（0.2

%新潔爾滅）

洗手及手腕，或用75%

擦洗80用

擦洗培養臺面備齊培養液、玻

璃器皿、吸管等，培養液用37℃水浴，擦干。在開啟培養瓶及液瓶時，需用酒精棉清潔瓶口附近，火焰滅菌。8182培養室內的無菌操作程序7.

瓶的開啟應在火焰

附近幾㎝以內的上

升氣流中進行，使

瓶口保持在對著火

焰而略微傾斜的狀

態。為了避免下落

的細菌污染，切忌

敞開瓶口垂直放置。膠塞用持吸管的右

手小指夾持之。吸管在滅菌后重新使用時，應用火焰將吸管外的棉花塞燒去。吸管在使用前火焰滅菌，不易過熱。吸管只能使用一次。移

液管前端殘留的少量液

體，可用火焰輕輕加溫，使空氣膨脹而將其壓出。整理桌面，

擦拭。83二、基本培養操作技術取材組織分離細胞細胞凍存與復蘇細胞運送841.取材取易培養的組織進行培養幼體組織或胚胎組織分化低的組織腫瘤組織2)

注意事項取材之后，最好立即培養。因故不能培養時，應把組織切成1㎜3左右的小塊，置于培養液中，4

℃

；存放時間不易超過24h。應嚴格保持無菌，也要避免受到紫外線照射或接觸任何化學試劑及有害藥物如 、碘等。85取材為減少污染，對腫瘤組織或其他病理組織，可用500~1000單位/ml的青、鏈霉素BSS液，漂洗5~10分鐘后再做培養處理。外科手術取材時，預先把好的平皿或小瓶送入手術室備用。手術時取一定量組織，置入皿中，立即送培養室進行培養。注意：要詳細記錄被取培養組織各種情況和組織種類等。86一般體積大于1㎜3的組織塊置于培養瓶中后，處于周邊的少量細胞即可能生存和生長繁殖，但大部分中心的細胞可因營養

有限而代謝不良，且受纖維成分而難以移出。為獲得多量生長良好的細胞，必須把組織細胞分散開，使細胞解離出來；能達到單細胞水平更好，同時并不使細胞受，細胞能很好生長。2.組織分離8788組織分離方法離心分離法機械分散法消化分散法培養物為血液、羊水、腹水和胸水等細胞懸液時低速500~1000轉/min，5~10min分層液分離白細胞根據細胞

不同，使各類細胞相互分開。Rbc為1.092，淋巴細胞和大單核等白細胞為1.070；1)

離心分離法89902)

機械分散法

切割分離法剪切手術刀切割1㎜3把組織置于不銹鋼紗網中用鈍器壓取法機械分散法把組織放入注射器針管中擠壓需先剪成小塊是在把組織剪成較小體積的基礎上，應用生化和化學

進一步分散組織的方法。最后使被處理的組織分散成細胞團或單個細胞，然后加入培養液制成細胞懸液，接種入培養容器中后，細胞容易生長增殖。3)消化分散法911)

胰蛋白酶消化法0.25%、37℃適于消化細胞間質較少的軟組織，如胚胎組織、羊膜、上皮組織、肝、腎等軟組織，傳代細胞。5㎜3胚胎類軟組織小塊20~30min2)

膠原酶消化法適于消化纖維性組織、上皮組織、癌組織最終濃度200U/ml或0.1~0.3mg/ml3)

EDTA消化法常用不含Ca2+、Mg2+的BSS配成0.02%的工作液EDTA0.02%：胰蛋白酶0.25%=1：192程序計數板：用75%

沖洗計數板后，用干凈鹿皮擦凈，另擦凈蓋片一張；把該片附在計數板上面，使之微微移向一側，以便滴加細胞懸液；染色：無菌吸管一支，培養瓶中，輕輕反復吹細胞懸液使細胞重懸均勻后，立即吸細胞懸液少許，向另一離心管中滴入細胞懸液1滴，再滴入臺盼藍染液9滴，混勻，置2~3min;3.

細胞93③加懸液：把計數板平放在顯微鏡臺上，立即從計數板邊緣輕輕滴1~2滴已染色的細胞懸液，使之充滿計數板和蓋片間空隙中；94954)鏡檢：鏡下觀察可見細胞分散各處，健康細胞胞體完整，透明不。計算四個較大方格內的細胞數；壓中線者只計算左線和上線者，右線和下線不計算在內，計算公式965)

接種培養：一般接種量在1~10×105細胞/ml范圍病理教研室：細胞數/ml原懸液

4大格細胞總數10000

稀釋倍數44.

細胞凍存①原理在不附加任何條件下凍存細胞時，細胞內外環境中的水會結成冰晶，能導致細胞。但如向細胞培養液中加入保護劑甘油或二甲基亞砜（DMSO），可使冰點降低，在緩慢的凍結條件下，能使細胞內水分在凍結之前透出細胞外。凍存在-135℃低溫中，能減少冰晶的形成。融化細胞要快，使之迅速通過最易受損的-5~0℃以后，細胞

不受影響，仍能生長增殖。慢凍快融：標準的冷凍速度為-1℃~-12℃/min，當溫度下降到-25℃時，下降速度可增至-5~-10℃/min；當-100℃時則可迅速凍入液氮中。9899②凍存程序細胞：選對數生長期細胞；收集細胞前24小時換液一次；計數：令細胞密度達5×106/ml，離心去上清，吸入離心管中；凍存液：先用小牛

9份＋DMSO1份（或甘油）配成10%的DMSO凍存液；一滴一滴地加入離心管中，然后用吸管輕輕吹打令細胞重懸；分裝：每安瓿加1.5ml細胞懸液；

：擰緊瓶口；把安瓿縫入紗布小袋中，以防液氮浸入后，融解時因受熱發生 傷人；紗袋一端系以線繩，末端扎有小牌，注明：細胞名稱，凍存日期；凍存：從把凍存物懸在液氮罐口開始計算，按-1℃/min速度，在30~40min

內，下降到液氮面，再停30min后，直投入液氮中。10010102103復蘇方法從液氮罐中取出安瓿；應戴防護眼睛和手套；迅速放入盛有37℃~42℃水的搪瓷罐中，不時搖動，盡快解凍；剪開紗布口袋，取出安瓿，用70%

擦拭后，凈化臺上打開蓋；用吸管吸出細胞懸液，裝入離心管中，再補加10ml培養液（或Hanks液），吹打使成細胞懸浮；低速離心（500~1000轉/min）5min，取上清后再重復用培養液（或Hanks液）漂洗、離心；加入培養液適當稀釋后，再移裝入培養瓶中，置溫箱培養，次日更換一次培養液后再繼續培養。1045.

細胞運送①選生長狀態良好的細胞，待達到80%或90%匯合時，去掉舊培養液換入新培養液，量要達到培養瓶的頸部（過滿易污染），保留少許空間，塞緊瓶塞；空氣過多中氣泡運動易使細胞脫落；②妥善包裝和運送；一般在不超過四五天到達目的地的情況下，對細胞無嚴重影響；③到達后，倒出大部分培養液，保留正常量，置37℃培養，次日傳代。105三、常規培養法人工

培養基培養法㈠初代培養法優點：具有二倍體遺傳性狀，在一定程度上能反映體內狀態。初代培養細胞是研究

表達的理想系統藥物測試等效果也很好兩種組織塊培養法消化培養法106107處理組織：取自人或動物的新鮮組織1~5㎝3，把組織塊置入燒杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如懷疑組織可能污染，可先置于

含有青霉素的混合液中30~60min；剪切：用眼科剪（或手術刀）把組織塊切成2~3㎜大小的塊，以便于消化；加入比組織塊總量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角燒瓶中，結扎瓶口或塞以膠塞；消化：永恒溫水浴，或置入37℃溫箱中消化，消化中每隔20min應搖動一次，如用電磁恒溫攪拌器消化更好1.

消化培養法4)

分離：見消化液發混濁時，可用吸管吸出

少許消化液在鏡下觀察，如組織已分散成

細胞團或單個細胞，立即終止消化→通過

適宜不銹鋼篩濾過→低速離心消化液5min，的培養液；吸出上清，加入適量含有計數培養1081092.組織塊培養法剪切：把組織小塊1㎝3，置入燒杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污→吸凈Hanks液→剪成

1㎜3塊；擺布：用彎頭吸管吸取若干小塊，置入培養瓶中；把組織小塊擺布在培養瓶底上，小塊相互距離以0.5㎝為宜，每一25ml培養瓶底可擺布20~30塊；輕輕翻轉培養瓶，令瓶底向上；注意翻瓶時勿令組織小塊流動，2小時左右（勿超過4小時），使小塊微干涸；4)培養：從溫箱中取出培養瓶，開塞，46度斜持培養瓶（瓶底仍向上），向瓶底角部輕輕注入培養液少許，然后緩緩再把培養瓶翻轉過來，讓培養液慢慢覆蓋附于瓶底上的組織小塊；置溫箱中 培養。待細胞從組織塊游出數量增多后，再補加培養液。評價：翻轉培養瓶的目的是為使組織快微干涸，以利貼附和免從瓶壁流失。組織小塊貼壁培養

24小時后，細胞即可從小塊邊緣向四周游出。110當初代培養成功，細胞增殖成單層后，進而擴展匯合，占滿一切空間，此時需要進行分離培養。這一操作稱傳代或再培養。如拖延傳代，細胞會因增殖過度，培養枯竭和代謝產物積累而發生。80%匯合或剛匯合細胞是理想傳代階段。㈡傳代培養法111消化法傳代步驟：吸出培養液→加消化液2~5min→吸出消化液→加培養液終止消化→吹打制成細胞懸液→計數→分裝12病理教研室：113第三節特殊培養法單細胞分離（克隆）培養單細胞分離培養又稱細胞克隆（Cell

cloning）,即把單個細胞從群體內分離出來單獨培養，使之重新繁衍成一個新的細胞群體的培養技術。初代培養細胞或其它 細胞克隆化的細胞系都具有異質性，細胞經過克隆以后，后裔細胞

群來源于一個共同的祖細胞，即形成所謂純系，稱細胞株（Cell

Line）.細胞株的細胞遺傳性狀差異減少，生物性質均一，利于實驗研究。114115單細胞克隆程序消化→低密度細胞懸液：1~2細胞/ml培養液→接種：向塑料培養板每孔內加0.5ml→標記：培養6~12h后，待細胞下沉貼附于培養板孔底后，觀察和標記下含單個細胞的孔。3~4w.待孔內細胞增至500~600個時，可進行分離培養；→分離擴大培養：培養86~96小時觀察。挑選生長良好的單克隆細胞孔，先吸出舊培養液，用Kanks液洗1~2次，繼加胰蛋白酶少許，待發現細胞變圓時，加入0.1ml含10% 的克隆培養劑，用吸管輕輕吹打，當細胞離開懸浮物后，一并吸入管內，移入另瓶或皿中，再補加一定量克隆培養液→常規培養116117第七節腫瘤細胞培養一、組織培養腫瘤細胞生物學特性二、培養方法118形態和性狀生長增殖永生性浸潤性異質性細胞遺傳其它一、組織培養腫瘤細胞生物學特性119培養中癌細胞無光學顯微鏡下特異形態LM：比二倍體細胞清晰，核膜、核仁輪廓明顯，核糖體顆粒豐富。EM：癌細胞表面的微絨毛多而細密，微絲走行不如正常細胞規則1.

形態和性狀不受控增殖有自泌或內泌性產生增殖因子能力能在低接觸抑制培養液中生長→形成堆積物2.

生長增殖120永生性在體外培養中表現為細胞可無限傳代而不凋亡浸潤性在與正常組織混合培養時，能浸潤入其它組織細胞中，并有

人工隔膜生長的能力121異質性所有腫瘤都是由增殖能力、遺傳性、起源、周期狀態等性狀不同的細胞組成。異質性構成同一腫瘤細胞內的

有差別的瘤組織。細胞遺傳：失去二倍體核型、呈異倍體或多倍體。其它122腫瘤細胞不易在體外生長的原因123依賴性腫瘤細胞與腫瘤細胞的相互依存腫瘤細胞對基質成纖維細胞的依賴腫瘤細胞的自泌也會因分散培養而被稀釋→降低生殖力只有干細胞才有強的增殖生長能力可能需求與體內相似的特殊生存條件124二、培養方法（一）要點（二）成纖維細胞的排除法（三）提高腫瘤細胞培養存活率和生長率措施（四）體外培養腫瘤細胞生物學檢測腫瘤細胞培養成功的關鍵在于取材成纖維細胞的排除選用適宜的培養液培養底物125取材要挑選好的部位于4℃＜24h癌性轉移淋

或胸腹水取材后盡快培養；可2.

培養基常用RPMI1640、DMEM、Mc-Coy5A按不同細胞需要不同的生長因子3.

成纖維細胞的排除㈠要點126（二）成纖維細胞的排除法機械刮除法反復貼壁法根據腫瘤細胞比成纖維細胞貼壁慢的特點，并結合使用不加的營養液，把含兩類細胞的細胞懸液反復貼壁，使兩類細胞互相分離。消化排除法：成纖維細胞比腫瘤細胞易先脫落。膠原酶消化法：是利用成纖維細胞對膠原酶較為敏感的特點其他方法127（三）提高腫瘤細胞培養存活率和生長率措施當腫瘤組織或細胞初代接種培養后，常出現的情況完全無細胞游出或移動有細胞游出或移動，但不增殖有細胞增殖，傳若干代后停止生長或

死亡傳數代后細胞增殖緩慢，經過一段停滯期后，才又呈旺盛生長狀態，形成穩定生長的腫瘤

傳代細胞系。128129提高腫瘤細胞培養存活率和生長率措施適宜底物生長因子動物體媒介培養（四）體外培養腫瘤細胞生物學檢測目的1.

所培養的細胞系的確來源于原體內具有細胞或其他細胞惡性的細胞，而具有腫瘤特異性闡明一般生物學形狀130131體外培養腫瘤細胞生物學檢測項目形態觀察細胞生長增殖：檢測細胞生長曲線和分裂指數、倍增時間、細胞周期時間細胞核型分析凝集試驗軟瓊脂培養：檢測集落形成能力異體動物接種：致瘤性其它：接種率、特異性，如為腺細胞有

否特殊產物；對正常組織浸潤力等試驗。第二節無菌操作設施和工作間操作間三、無菌操作箱：簡易操作二、無菌操作室緩沖間一、凈化工作臺：最普遍更衣間大型多人操作四、 和準備區：培養器皿的洗刷、浸酸、、蒸餾水的

等五、溫育和

區：放置溫箱、冰箱、干熱箱、液氮容器等。六、觀察和研究區132凈化工作臺凈化工作臺：內設鼓風

機，驅動空

氣通過高效

率器凈化后，讓凈化后空

氣徐徐通過

臺面空間，

使工作場地

構成無菌環

境。133第三節

設備最常用的大型必備裝置和儀器有一、電熱恒溫箱二、電熱干燥箱三、冰箱四、顯微鏡五、水純化裝置六、洗刷裝置七、抽濾裝置八、細胞冷凍

器九、離心機十、天平十一、加樣器1341.

電熱恒溫箱（

CO2溫箱）電熱恒溫箱：CO2溫箱，5%CO2可使培養液維持穩定的pH值。培養容器需通氣，箱內空氣應干凈，消毒（紫外線和擦拭）。箱內置水槽以維持箱內溫度、濕度和避免培養液蒸發，用無菌水加防腐劑以防生霉。135⒉電熱干燥箱電熱干熱箱：用于烘干和干熱

玻璃器皿。160℃，大型的帶有鼓風機→溫度均勻，

100℃時刻停止鼓風，鼓風與升溫同時開始。降到100℃后開箱。1363.

冰箱：4℃、-20℃，清潔4.

顯微鏡：倒置光顯微鏡倒置光

顯微鏡：帶有常

焦距相

差裝置

和攝影

裝置137水純化裝置：三蒸水→去掉有機物洗刷裝置：人工、超聲波、虹吸系底器（洗滌吸管）138；Zeiss濾器：7.

抽濾裝置：培養液抽濾除菌用微孔濾膜8.

細胞冷凍 器：液氮 器，-196℃，每兩周需充液氮一次1399.

離心機：1000轉左右140后用品貯藏柜141第四節器械用于解剖動物、取材和原代培養切割組織等解剖刀、白內障刀、解剖剪、虹膜剪、鑷子、持針器、止血鉗等。：煮沸、70%

浸泡、高壓142第五節培養器皿一、玻璃瓶皿二、塑料平皿玻璃系統應備用三套培養器皿一套使用中一套在進行刷洗處理一套

后

備用143一、玻璃器皿應選用好、無毒的中性硬質玻璃制成等：500ml、250ml、100ml玻璃瓶培養液、培養瓶優質材料：200ml、100ml、30ml、25ml、15ml瓶口≥1cm3.

培養皿培養和分離組織以及軟瓊脂培養等直徑60mm、120mm1444.

吸管直頭：吸加少量培養液、吸細胞懸液、加抗菌素等刻度吸管：移送培養液20ml~1ml短尖頭吸管彎頭：移液、吸取組織塊、擺布組織塊管的根端用少許脫脂棉堵塞→防異物5.

離心管離心、漂洗、分離細胞:50ml、15ml、10ml等其它：三較燒瓶、燒杯、量桶、漏斗、試管、注射器、安瓿145二、塑料瓶皿透明平坦、無毒性、利于細胞生長?多孔培養板單細胞克隆、生長曲線測定、藥物測試和單克隆抗體等研究用。4孔、6孔、12孔、24孔、96孔等培養皿：30mm、60mm、100mm培養瓶：分25cm（底面積）、75cm146第三節培養用液第一節水和平衡鹽溶液第二節天然培養基第三節 培養基第四節

培養基的選擇第五節

其它常用液147培養液是維持細胞生存和生長所需的基本溶液培養用液主要分為三類平衡鹽溶液（Balanced

Salt

Solution;BSS）天然培養基（Nature

Medium）3.培養基（Synthetic

Medium）BSS：又稱生理鹽水或鹽溶液。具有維持滲透壓，調控酸、堿平衡的作用，同時能供給細胞生存所需的能量和無機離子成分；用作洗滌組織、細胞以及配制各種培養用液的基礎溶液。148天然培養基：主要來自動物體液或從組織的成分，其營養性較高，差異較大，在來源上有中分離提取但成分復雜，一定限制。培養基（Synthetic

Medium）：是按人和動物體內細胞所需成分模擬

的、配方恒定的一種較理想的培養基。對動物細胞來說只能維持細胞的生存，要想使細胞生長和增殖，還需補充部分天然培養基。149第一節水和平衡鹽溶液一、水組織培養用玻璃三蒸水器皿用二蒸水二、平衡鹽溶液（BSS）BSS是從Ringer生理鹽水發展起來的，主要由葡萄糖和無機鹽組成。BSS中的無機離子不僅是細胞生命所需成分，而且對維持滲透壓、緩沖和調節溶液的酸堿度方面，起著重要作用150BSS內含少量的酚紅，作為溶液酸堿度變化的指示劑溶液變酸時呈黃色變堿時呈紫紅色中性時呈桃紅色?常用的BSS液：Ringer、PBS、Tyrode、Earle、Hanks、Dulbecco、D-Hanks、EagleHanks和Earle是配制各種培養液最常用的基礎溶液。：8磅10min高壓滅菌，4℃冰箱內保存151第二節天然培養基、組織提取液，如雞血漿、雞胚汁等

:含有許多種不可缺少的能維持細胞生長增殖的成分牛胎牛

：從母牛

出的胎牛中分離出

—

—貴小牛

：從剛出生，但尚未哺乳的小牛分離出的中成分：蛋白質、多肽、激素、氨基酸、葡萄糖、酮酸等152第三節

培養基是根據研究和了解細胞所需成分基礎上配制的創制出與體內相似的生存環境有固定的組織成分，利于控制實驗條件標準化只能維持細胞不死，不能促細胞增殖生長需添加天然培養基一、 培養基的種類二、 培養基的成分三、 培養液的配制四、無 培養基153一、

培養基的種類九種基本培養基：Eagle（MEM）、Dulbecco改良（DMEM）、HamF12、CMRL1066、RPMI1640、199、L15、

、MB752/1MEM（Minimum

Essential

Medium）是常用的培養基之一RPMI1640應用廣泛（最初為培養淋巴細胞而設計）Mc-Coy5A：為肉瘤細胞而設計。適用于原代細胞培養、組織活檢的細胞、淋巴細胞、特別較難培養的細胞。HamF12：常用單細胞克隆化培養154二、

培養基的成分氨基酸碳水化合物維生素無機離子其它成分155三、

培養液的配制1.培養液的

（干粉）出玻璃三蒸水將水加溫至15~30℃把干粉加入水中，攪拌令之溶解加NaHCO3加水至最終量6.

用≤0.22

孔濾膜濾過微m156培養液的種類生長培養液維持細胞增殖，含抗生素（青霉素100單位/ml和鏈霉素100g

ml

)/維持液為維持細胞緩慢生長或不死的培養液，含量甚少；

2%~5%。如培養正常細胞完全不加

，可維持細胞不死，但時間過長細胞難免

。157四、無

培養基應用：研究細胞生長因子、單克隆抗體的 以及細胞 產物的研究等成分1.

基礎培養液HamF12：DMEM培養液=1：1相混合補加15mM的HEPES1.2g/升NaHCO3作為基礎溶液。然后根據不同細胞的要求，再補加其它附加成分。用三蒸水以上的蒸餾水，而最后一次蒸鎦應在配制前 后立即使用。(key)1582.

附加成分1)

促貼壁附著成分膠原層粘連蛋白纖維粘連蛋白2)

促生長增殖成分胰島素硒酸鈉轉鐵蛋白3)

蛋白酶抑制物：大豆胰蛋白酶抑制劑→對抗起消化作用的胰蛋白酶的殘留無

培養基159160第四節培養基的選擇一、經驗法二、實驗法可用多孔培養板（96孔）做一組克隆形成率和細胞生長曲線看看細胞生長增殖與否。第五節其它常用液一、消化液：分離組織和分散細胞用胰蛋白酶EDTA(二乙胺四乙酸二鈉二、pH值調整液HEPES液NaHCO3液三、抗生素液

青霉素100單位/ml培養液鏈霉素100g

/ml培養液以預防由于操作不慎而產生的微生物污染161第四節

與第一節一、玻璃器皿的二、膠塞的三、塑料器皿的四、包裝第二節一、物理

法二、化學

法三、抗生素

液（滅菌）162第一節

的主要目的為清除雜質和微生物，使在器皿內不殘留任何影響細胞生長的成分。一、玻璃器皿的浸泡：清水浸泡→附著物軟化或被溶掉新瓶：自來水刷洗→5%稀鹽酸溶液浸泡過夜，以中和其中的堿性物質。使用后的：立即進入清水中2.

刷洗：用毛刷沾洗滌劑吸底，以除去器皿表面的附著較牢的雜質。1633.浸酸：洗刷不掉的極微量雜質經過硫酸和重鉻酸鉀清潔液浸泡劑的強氧化作用后，可被除掉。≥6h或過夜。三種不同強度的清潔液重鉻酸鉀濃硫酸蒸餾水弱液63g1000ml