RNAextraction-Trizol主要流程準備耗材取出樣品，在液氮中研磨成粉末，迅速轉入2ml離心管適量Trizol中（1ml），劇烈混勻，室溫靜置20min，加入Trizol體積1/5的氯仿（200ul），劇烈混勻（1min）成乳濁液，靜置分層（冰浴），12000g，4℃離心15min。上清約600ul，200ul×3，轉入新的離心管中（2ml），，加入1/2-1/3（300-400ul）體積的水飽和酚（4℃會分層取下層液體），顛倒混勻成白色乳濁液，（冰浴）靜置分層（5min），12000g，4℃離心15min。重復3，吸取上清，遞減15ul。上清轉移至1.5ml離心管，加入1/2體積氯仿劇烈混勻，冰浴分層。12000g，4℃離心15min。上清轉移至1.5ml離心管中加入等體積的異丙醇（-20℃預冷），顛倒混勻(徹底混勻)，放置-20℃靜置1h以上。去除，12000g，4℃離心25min。在超凈工作臺倒掉異丙醇，加入80%乙醇1ml（提前冰浴，由depc水配置），小心蓋上蓋子橫滾幾圈倒掉乙醇并用槍頭吸取多余液體。再洗滌一次，加入80%乙醇，離心4-5min，倒掉乙醇。超凈工作臺吹干5min（一定要干）。加入適量（20ulDEPC處理過的超純水），用槍頭攪拌搗碎沉淀，方65度烘箱中5min，期間輕彈管子一次。稍離心。取上清到新的試管中，并分裝少許檢測，其余放-80℃。檢測：OD值260/280=1.9-2.1或電泳1.關于Trizol的購買：目前市面上買的大多是100ml裝的，比較出名的是Invitrogen公司的Trizol，100ml原裝的據說要1200大洋以上，不過有一種據說香港分裝的，只需600元，但是相對國產品牌三四百元的價格還是貴了一些。國產很多公司都有類似的Trizol試劑，價格大多三百多元，成分都差不多，可以說都是invitrogen的山寨產品。比如我用的是北京一家公司的，四百多，做出來也還不錯。Takara有一款專門提取smallRNA的trizol，好像貴一些。2.關于配套試劑：Trizol法提取RNA是要用到氯仿、異丙醇和乙醇的。氯仿現在是違禁品，不大好買（我們學校試劑科現在不賣），所以買的時候要讓試劑上給送，一般他們都能免費給送。氯仿遇光易分解，試劑商給你的時候應該是遮光的。異丙醇雖然沒有特殊說明，但我查的據說也是最好避光保存，不過這種試劑都是棕色瓶子，能遮蔽大部分的光線了。3.關于實驗時的防護：RNA很容易降解，所以實驗時一般都要求口罩帽子的，避免組織的污染。不過以我的經驗，好像內源性的RNA酶才是最主要的，也就是組織內本身的RNA酶。開始我是很小心，口罩手套帽子的，但是提取出來發現還是降解了，后來有經驗了，即使組織掉在地上，拿回去繼續提也沒問題（前提是不能化凍）。所以最最重要的是組織在液氮研磨成粉末并加Trizol之前不能化凍，這也是fast200法提取效果不好的原因（fast200法一般不用液氮研磨）。4.關于液氮研磨：萬事開頭難，液氮研磨是最開始的步驟，也是最辛苦的步驟。很多女孩子都怕液氮，畢竟是零下近200度的東西，當然不是鬧著玩的。不過只要小心操作，一般沒啥問題，我提了一個多月的RNA，對液氮是很親切了，呵呵。我是找了一個保溫杯，倒出一些液氮，然后再往研缽里倒。研磨的時候多加幾次液氮，組織會慢慢變脆，就會好研一些，對于一些含水量比較大，很硬的組織，我是準備了刀片，切成小塊后再研磨，一定研磨充分，不要求研磨成奶粉狀，但至少得看不到明顯的顆粒，這樣Trizol才能充分和組織接觸，快速裂解組織，也能防止組織的降解（Trizol內含RNA酶抑制劑）。5.關于組織量：研磨前最后稱一下組織的重量，畢竟1ml的Trizol最多只能裂解100mg的組織。Trizol里面是含有RNA酶抑制劑的，如果組織過量，Trizol無法完全浸潤組織無法完全裂解組織，多余組織內的RNA酶等物質會導致RNA的降解。這是RNA降解的很重要的原因。6.關于提取步驟：標準Trizol提取步驟為液氮研磨--加入Trizol裂解--加入氯仿抽提--離心--加入氯丙醇沉淀--離心--酒精洗滌--離心。因為提取的組織，在加入Trizol后增加了一步簡短的離心，可以幫助去掉一些無法降解的組織，比如纖維和雜質之類，然后取上清再加入氯仿，可以幫助提高氯仿的效率。然后就是在加入Trizol后，可以將裂解液放到-80凍存半小時以上，據說凍融過程中可以再次幫助更加充分的裂解細胞，分離蛋白和RNA。我試了一下，的確有效果。7.關于個步驟的時間：標準的時間是a.液氮研磨（沒時間要求，只要組織不化就好,我一般一個組織十分鐘左右，女孩子可能時間長一些，畢竟體力活）b.加入Trizol裂解5-10分鐘（我覺得還是10分鐘比較好，有人說這步要放在冰上，但是我的經驗室溫就可以，室溫更有利于Trizol完全發揮作用，而且畢竟Trizol含有RNA酶抑制劑，不用擔心RNA降解）c.加入氯仿室溫靜置15分鐘（國產試劑真是坑爹啊，說明書把這步時間縮短到3分鐘，出來效果奇差）d.離心15分鐘，這是管見的一步，離心后分成三層，RNA在上清里，所以離心管從離心機拿出來的時候要輕巧，以免管內物質震蕩導致下層沉淀激起。吸取上清的時候一定一定輕，切忌吸取太多，少量即可，洗到400-500ul就OK了，再多就容易碰到下層沉淀了。e.加入異丙醇靜置10min，然后離心10min。f.用75%酒精洗滌沉淀，幫助分離剩余的有機試劑（剩余右擊試劑過多會影響OD值和PCR反應），所以酒精盡量多加一些，一般說明書沒有說明這一步的時間，只是說劇烈渦旋震蕩，我的經驗是一定把沉淀彈起來，讓浮在酒精中，然后放1-2min，讓酒精充分接觸沉淀，充分溶解有機試劑，然后再離心。g.加入DEPC處理水，組織提取出來的量還是挺大的，雖然不是很純，所以溶解液還是不能太少，至少要50ul，之前一個大姐給我說加20ul就可以，結果濃度直接高得光度計測不出來了。而且濃度太高跑電泳時也跑不開，沒法