基因條碼昆蟲：基于基因鑒別蝽類（昆蟲綱：半翅目：異翅亞目）摘要：背景：DNA條碼，為線粒體色素細胞C中氧化酶I（COI）基因的5’端編碼區基因序列變異的分析，為在大范圍內鑒定生物種類提供了一種十分有效地方式。為便于評估在異翅亞目鑒別中基因條碼的有效性，我們檢測了來自178個種屬的344個種類，均從加拿大國家昆蟲收集所獲得。研究法/主要成果：對于COI的分析表明，90%經過檢測的類群中，種內趨異性低于2%，77%同類物種中種間遺傳最小距離均超過3%，部分不同種屬的物種的基因條碼除外。而發現的一些具有較大種內趨異性的物種大多數為隱蔽種。結論/意義：通過這次對全球現有動物群的0.8%進行分析，結論顯示DNA條碼有助于異翅亞目的鑒別。這種技術有助于昆蟲的管理、調控以及環境應用，同時也揭示物種需要更深一步地進行形態學研究。簡介：蝽類（昆蟲綱：半翅目：異翅亞目）作為大部分半變態昆蟲的代表，目前已知種類有42000種，橫跨了超過5800個屬和140的系。而其次級中包括了許多影響經濟的植物害蟲，動物疫病攜帶者以及基于生物控制角度而引進的捕食者。在半翅目中，存在著許多難以采用生物分類學進行歸納的種群，其中包括有害昆蟲的種類（例如草盲蝽種）。同時，若以形態學基礎為核心來界定未成熟生物的形態通常而言也十分困難。線粒體色素細胞C氧化酶I基因（COI）的5’端常被看作是標準DNA條碼，用于檢測動物世界中的各個物種。DNA條碼借用確定形態隱蔽物種、關聯未成熟形態和成蟲間的關系，鑒別卵的等級以及殘留物（食物質量、生態學分析）等方式，來協助常規異翅亞目的鑒定。

先前只有少量的研究將DNA序列運用于異翅亞目物種的鑒定工作。達姆加德發現COI基因序列的作用（本案例中，在基因的3’端）在水黽屬物種的鑒別中受到嚴重限制。梅蒙等人也確定COI序列變異在限制產生新的半翅類物種中作用顯著，但是發現從基因庫中獲得的373種半翅類物種的基因序列具有較大的種間和種內遺傳距離重疊。然而，從相關研究中獲得的最新數據則揭示了分類困難的種群之間的關系。如此一來，大量有效數據就指向了這類問題，即物種形態形成會降低種間基因序列趨異的水平，并且通常會低估DNA條碼作為鑒別異翅亞目物種的作用。近期，榮格等人揭示了東非異翅亞目物種的COI基因條碼序列，并且總結得出這些條碼將有助于對物種的鑒別。但是，139個物種中的79個來自來3個不同的族（花蝽科、盲蝽科、蝽象科），25個族中的11個作為單系物種，在總體上限制了其對異翅亞目總結的程度。基于對加拿大昆蟲收集所樣品的鑒別分析，當前已經拓展至標準異翅亞目COI編碼區的基因序列變異研究。材料和方法：樣品本研究中的樣品均來自加拿大國家昆蟲收集所，其中的蛛形類、線蟲類來自渥太華。不采用40年之前的樣品，以便于最大化測序成功率。無論何時，只要有可能，就會選擇一種以上的生物種類。并且嘗試著采用具有代表性的異翅亞目類群，更大范圍的覆蓋特定的類群。因此，其中60%物種來自盲蝽科，在這些族中，一些似是而非的屬和類群常會表現得非常難以分類。總共檢測了1689個樣品，大部分樣品來自北美，其中一些來自中美和歐洲。少量樣品浸在濃度95%的酒精中，大部分已經干化，在過去的30年中收集（平均年數為11年），已經得到固定。收集的資料存入生命條碼數據系統（BOLD），并且可用于HCNC和HCNCS研究計劃。每個樣品都貼上標記，以便于將其和BOLD的相關記錄對應。COI的擴增和測序采用單管拿取干化或酒精保存的樣品，使用玻璃纖維提取裝置提取DNA。PCR擴增環境總容量為12.5μl，內含6.25μl10%海藻糖、2μl純凈水、1.25μl×10PCR緩沖液（10mMKCl，10mM(NH4)2SO4，20mMTris-HCl（pH8.8），2mMMgSO4，0.1%曲通X-100），0.625μl的MgCl2（50mM），每種引物（10uM）0.125μl，10mM的dNTP0.0625μl，0.06μl聚合酶，以及2μl提取的DNA。本研究中使用的PRC引物見圖1。PRC熱循環需滿足以下條件：95℃下2分鐘，94℃下40秒循環5次，45℃下40秒，72℃下1分鐘，94℃下40秒循環35次，51℃下40秒，72℃下1分鐘，72℃下5分鐘，4℃下，當使用引物混合物C_tRWF_t1（混合了上述表1中的引物）時就需要額外再循環5次。采用標準方法對PCR進行檢測以及對DAN進行測序。68%的樣品，采用引物LepF2_t1-3’以及M13F注入5’端，LepR1則用于擴增目標線粒體COI基因序列的658-bp。當引物效果不佳，那么引物混合物C-tRWF_t1（見表1）就用于擴增658-bp條碼片段，以及擴增和額外15%樣品中的上游序列。那些相對而言較難分解的樣品，則采用LepF2（或）C_tRWF_t1配合MHemR、MHemF以及LepR1來進行擴增，以便產生重疊較短的序列并且方便混合序列的出現。鄰接和排序使用CodonCodeAligner2.0.6版本的DNA分析軟件進行操作計算。基因序列趨異性采用K2P距離模型進行計算，鄰接（NJ）樹用于為物種趨異性呈現直觀的圖像畫面，以便于為BOLD序列分析模數提供補充。所有和HCNC項目對應的序列都已被存入基因庫（入庫編號：HM394326至HM394342,HM914596至HM914598,HQ105390至HQ106459）。HCNC和HCNCS的項目采集細節、樣品圖片、序列、追蹤文件以及基因庫入庫編號等均儲存在BOLD。結果：物種鑒定從80%的樣品中獲得基因條碼，并且對上至35年的樣品成功進行了基因序列擴增。它們來自30個科的191個屬的380個物種，共1276個序列（表2）。其中，1090個序列（334個物種，178個種屬，29個科，見表3）的長度超過了500個堿基。COI序列中未發現終止密碼子和移碼存在，這就表明這些基因均不是假基因（NUMTs）。以下只對含有500個堿基以上的序列（見HCNC項目）進行研究。較短的序列只適用于NCNCS項目，但是在此不作深入探討。來自HCNC項目的鄰接樹相關信息見附錄S1。表3和圖4概括了不同分類水平下的樣品的趨異性（K2P距離）。種內趨異性平均為0.74%（范圍0-7.72%，標準誤差1.29%），344個物種中的27種，其最大的種內趨異性水平超過了2%，見表4。同基因物種的趨異性平均為10.7%（范圍0-24.8%），其最小種間遺傳距離均為3%以上，超過了3/4種對的水平。余下的物種分為兩類：種對共用相同或相似的基因條碼（表5A）。種對具有較低基因序列趨異性，但是形成各自的族群（表5B）。序列差異模式以下為不同屬但共有相同基因序列條碼的例子：Rhinocapsusvanduzeei（3個樣品中的2個）與Plagiognathusmorrisoni樣品共用序列，而Rhinocapsusvanduzeei和P.Fuscipes物種類群（P.emarginatae,fuscipes以及morrisoni）之間遺傳距離的最大值僅為0.806%。假如排除R.Vanduzeei，同科不同屬間遺傳距離的最小值就為5.05%（平均值19.8%，最大值35.8%）。當前研究中的228個同屬物種中，195個（85%）與其近親物種為同屬種。正如鄰接樹（圖2）所示，一些特定科的物種會產生相同族群。而主要的例外則出現在長蝽象總科的物種中，該科的組成，目前為止，包括的卻是大部分已成功鑒定的長蝽科物種。與此相似，緣蝽科和姬緣蝽科的物種也不能因基因序列的原因而被分入同個族群。換句話說，大部分科，如盲蝽科，其物種基本形成相同族群，但是有兩個屬，Tupiocoris以及Usingerella，這些屬的物種和科內的其他物種的關系就相差甚遠。不同科的樣品間的基因序列遺傳距離往往都會高于12%（平均值23.67%，范圍12.2-36.7%）討論本次研究成果通過提供大量水生異翅亞目和長蝽科的相關資料，以及拓展對盲蝽科這一重要領域的研究，大大地補充榮格等人對花蝽科以及其他蝽科物種的研究成果。本次研究中獲得的種間和種內趨異性的各種模式，使我們更加肯定榮格等人在報告中所給出的數值（見表3）是正確的。總體而言，每個物種的COI條碼使得物種與近親物種向分離，形成不同的族群，但偶爾也會有例外。其中包括了部分不尋常的超長種內遺傳距離的例子（見表4），而其他例子的種間距離均較短或者未出現隔離（見表5）。基因條碼不能進行界定的物種，它們的分類群在形態上異常相似或者關系密切。但也有例外，例如Rhinocapsusvanduzeei就使用和Plagiognathusfuscipes類群物種相同的COI序列。所有Rhinocapsus/Plagionathus的族群呈現出的都不是單系族群，因此看來不像是在實驗中產生了交叉污染或者誤配對。具有較大種內趨異性的的物種（見表4）會產生模糊分類，共祖多態性或者基因滲透方面的誤判。過去的研究中表明這些物種中大部分為隱蔽種，并且在當前的例子中有充分的證據來證明事實確實如此。譬如，Homaemusaeneifrons來自兩個族群，一個存在于來自加拿大東部的樣品，一個存在于來自加拿大西部的樣品。西部亞種H.Aeneifrons，則具有明顯的雄性生殖器官，這種較大的序列差異使得不同的同胞物種間產生亞種。麗盲蝽科是一種泛北極分布的物種且沒有亞種，然而，我們在20個該樣品中卻發現了顯著的趨異性（最大為5.98%），而且這個數值的分布在3個種群中，見圖3。其中一組種群的樣品來自德國，第二組樣品則橫跨整個北美（從不列顛哥倫比亞直到安大略湖），而第三組樣品則來自北美西部（從從不列顛哥倫比亞直到亞利桑那），這表明還有許多未被被界定的物種存在。魯比揭示了某個與生物學相關的基因條碼差異。該種下得物種分為兩個種群：從黑莓中收集到兩個使用相同條碼的樣品，但是他們與其他在紅醋栗上發現的卻存在著約5%的差異。這表明存在宿主專一性分類（與其他紅醋栗物種的形態不同，草科栗屬類物種在本次不作研究）。在榮格等人研究的來自韓國的物種中，某些例子中的假定物種（花蝽科等物種和余下物種之間存在著12%的個體差異）存在著不尋常的巨大趨異性，這可能是隱蔽種存在而導致的結果。與種內趨異性相反的是，部分物種混雜類群中的個體卻使用相同的基因序列。特別是，這些混雜類群中的部分物種還存在較大差異，這就可能導致基因滲入或者鑒定錯誤。因此，這些種群即表現出較高的種內差異（見表4）以及難以分類等問題（見表5a）。盲蝽屬以及部分與之密切相關的物種，即使最近分類學已經修改，并且也對此進行過相關的研究，但是他們所表現出的序列差異模式與當前所用的分類學仍舊不符（見表4）。然而，盲蝽科中的Plagiognathus.obscurus樣品被分為兩個類群，最小遺傳距離為4.37%，與種群趨異性最大值2.45%形成對比，這也揭示了隱蔽物種的存在。這兩種盲蝽屬Plagiognathus.obscurus物種以外的物種則混雜了盲蝽屬的其他物種。由于這些物種的最大趨異性為2.5%，因此可能表現出共祖多態性，或者曾今具有的趨異性如今已經產生基因滲入現象。而Plagiognathus.obscurus和Plagiognathus.brunneus這兩個物種在形態上極為相似，所以產生錯誤鑒別的可能性極高。但是，Plagiognathus.shoshonea則因其較大的外表、明顯的雄性生殖器官以及艷麗的外表而能很輕易地鑒別出來。因此對該物種的錯誤識別實際上不會對測序產生影響。該屬的其他物種，比如Plagiognathus.emarginatae、Plagiognathus.fuscipes以及Plagiognathus.morrisoni，在形態上極為相似而且在基因條碼上難以區分，這或許表明了該物種可能是近代才分化形成。在榮格等人研究的韓國物種中，6種偽麗盲蝽屬物種中的3種，形成了單系復雜鄰接族群。不同屬間物種存在相近DNA條碼很不尋常，但這也存在于其他昆蟲種群中。豪斯曼等人發現在鱗翅屬等地物種中存在COI序列共用現象。而蚜蟲類樣品中的Aulacorthum.dorsatum和Ericaphiswakibae具有相同的條碼序列。這兩個例子中，作者建議同屬鑒定需要重新研究和評估。即使他們在形態上具有差異，并且可以憑此進行辨別，但是在此，上述建議才是解決相關問題的唯一方式。然而，其他的一些機制也可能導致這個問題，例如性狀趨同，基因滲入以及微生物共生體或病原體的橫向轉移介導等。條碼形式的相似性（見圖2）與最高等分類關系顯示出驚人的一致性。我們的數據中不只一個物種，與他們中有86%與其近親物種是同屬種。不止一個物種表現出科種關系，他們中有8科與其近親物種為同科。由于這些形式的存在，COI條碼可以作為在未知分類中對同屬種或同科種水平進行判斷的指標，尤其僅有零碎殘骸或者未成熟狀態存在時。根據