實驗八、九組織核酸含量化學測定

XiamenUniversity生物化學實驗2016年04月07日廈門1868年瑞士科學家米歇爾(F.Miescher)發(fā)現(xiàn)細胞核內(nèi)含高量磷的酸性物質(zhì)，命名為核素(后改名為核酸)早期的研究僅將核酸看成是細胞中的一般化學成分，沒有人注意到它在生物體內(nèi)有什么功能；核酸的發(fā)現(xiàn)F.Miescher核酸作為遺傳物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)過程20世紀初，德國生理學家柯塞爾(Kossel)證實了核酸是由四種不同的堿基所組成；美國科學家列文(Levene)又確定了核酸有兩種,即DNA和RNA；1928英國科學家格里菲斯(Griffith)利用細菌的性狀轉(zhuǎn)變實驗，證明了遺傳信息的可傳遞性；1944美國科學家艾佛瑞(Avery)證實了DNA造成細菌性狀轉(zhuǎn)變的物質(zhì)基礎(chǔ)；1952美國科學家赫雪(Heishey)和蔡斯(Chase)證明遺傳物質(zhì)是DNA非蛋白質(zhì)；1953年，英國科學家沃森和克里克發(fā)現(xiàn)了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)；核酸是一類生物高分子化合物，存在于一切生物體內(nèi)，是組成細胞的重要成分。它以與蛋白質(zhì)結(jié)合的形式--核蛋白存在于細胞中，是生命的基本物質(zhì)之一，具有儲存、復制生物體遺傳信息的功能，也是蛋白質(zhì)合成不可缺少的物質(zhì)，因此它對于生物體的生長、遺傳、變異等現(xiàn)象起著重要的決定作用核酸分為兩大類--核糖核酸(RNA)和脫氧核糖核酸(DNA)

核酸完全水解產(chǎn)生嘌呤和嘧啶等堿性物質(zhì)、戊糖(核糖或脫氧核糖)和磷酸的混合物核酸部分水解則產(chǎn)生核苷和核苷酸。每個核苷分子含一分子堿基和一分子戊糖，一分子核苷酸部分水解后除產(chǎn)生核苷外，還有一分子磷酸核酸的各種水解產(chǎn)物可用層析或電泳等方法分離鑒定核酸nucleicacid核苷酸nucleotide核苷nucleoside磷酸phosphate嘌呤堿purinebase

或嘧啶堿pyrimidinebase(堿基base)核糖ribose

或脫氧核糖deoxyribose

(戊糖amylsugar)DNA和RNA的分子結(jié)構(gòu)每個核苷酸都含有一個磷酸根，因此可通過測定磷含量來推算核酸的含量。通常DNA含磷量約為9.84%，RNA含磷量約為9.5%，根據(jù)所測磷量可計算DNA和RNA的含量。組成核酸的戊糖有兩種。DNA所含的糖為β-D-2-脫氧核糖；RNA所含的糖則為β-D-核糖。RiboseDeoxyribose核酸的化學性質(zhì)核酸可被堿水解產(chǎn)物核苷酸和脫氧核苷酸核苷酸可進一步被濃硫酸水解產(chǎn)物：堿基、核糖和磷酸核酸定量測定常見的方法1.定磷法：將核酸消化，測定其無機磷量，由此計算出核酸含量，反應(yīng)靈敏。2.紫外吸收法：利用核酸在260nm處有吸收高峰，操作簡便，受蛋白質(zhì)和核苷酸的干擾影響。3.地衣酚(苔黑酚)法：用于測定RNA的含量，RNA與濃鹽酸共熱，降解形成的核糖轉(zhuǎn)變?yōu)榭啡玫匾路?3,5二羥甲苯)反應(yīng)來測定，特異性差，戊糖均有此反應(yīng)。4.二苯胺法：DNA中的脫氧核糖在酸性溶液中轉(zhuǎn)化為ω-羥-γ-酮基戊醛，利用二苯胺試劑反應(yīng)，除脫氧木糖和阿拉伯糖外其他糖類無此反應(yīng)。定磷法的原理

首先將核酸樣品用硫酸消化成無機磷，利用定磷試劑測定無機磷量。反應(yīng)式為：(NH4)MoO4+H2SO4H2MoO4+(NH4)2SO4H3PO4+12H2MoO4H3P(Mo3O10)4+12H2O

H3P(Mo3O10)4Mo2O3?

MoO3(鉬藍)Vit?C實驗通過測定組織中的含磷量來計算組織核酸的含量。組織破碎后，經(jīng)酸(常用三氯醋酸或過氯酸)和脂溶劑的提取，得到不溶于酸的非脂性磷化合物(AINLP).其主要成分為RNA磷(RNA-P)、DNA磷(DNA-P)、磷蛋白、磷和少量其他磷化合物。采用Schmidt-Thannhauser法，使AINLP降解出RNA和DNA的核苷酸。此法對植物組織不太適用，因為部分DNA為堿所裂解。上述分離的DNA和RNA降解物(核苷酸或多核苷酸)，去其無機磷化合物，再經(jīng)強酸消化分解游離的堿醛，戊糖和磷酸，磷酸根PO43-在酸性溶液中能與鉬酸銨反應(yīng)生成戊磷鉬酸銨，遇還原劑即變成“鉬藍”藍色物質(zhì)，其反應(yīng)式如下：

H3PO4+12(NH4)3MoO4+21H+===(NH4)3PO4·12MoO3+12H2O+33NH4+鉬酸銨磷鉬酸銨(黃色)(NH4)PO4·12MoO3+

還原劑

(MoO4·4MoO3)2·H3PO4·4H2O

鉬藍(藍色)

鉬藍產(chǎn)物于溶液中PO43-的含量成正比，用722型分光光度計660nm波長比色，當無機磷含量在1-25μg

范圍內(nèi)，光吸收和含磷量成正比，測出光密度而求出含磷量。

儀器10ml刻度離心管7支凱氏燒瓶1個10ml刻度試管10支研缽1個移液管數(shù)支離心機722分光計水浴鍋(公用)試劑1、10%三氯醋酸(TCA)2、5%三氯醋酸3、95%乙醇4、乙醇-乙醚混合液=1：1(V/V)5、1NNaOH6、6NHCI7、4NNaOH8、0.1MCaCl211.10g稀釋至1000mL9、濃H2SO410、磷酸鹽標準液：稱取0.4394gKH2PO4

移入1000mL容量瓶中加蒸餾水至刻度，加入一滴氯仿，以防微生物活動，其液含磷100μg/mL11、2.5%鉬酸銨(不好溶)12、6NH2SO413、1、2、4酸還原劑：15%NaHSO3

實驗步驟1、核酸的提取分離：取豬肝3.0g-3.5g，加入約1mL冷凍的10%TCA，在冷凍條件下研成勻漿，并攪拌3min，移入離心管，用少量冷凍的10%三氯醋酸(共約4-5mL)洗滌研缽，洗液一并倒入離心管，攪拌，離心3min(轉(zhuǎn)速2000r/min)，棄去清液，于沉渣中加入2mL冷凍的5%TCA，攪拌2min，離心，棄清液，沉渣應(yīng)不含酸溶性磷化物(即不含無機磷，可用1、2、4氨基萘酚磺酸檢查)，此操作過程要迅速，以免發(fā)生自溶現(xiàn)象。加入5mL95%乙醇于上述沉渣中，攪拌，離心，棄清液，于沉渣中加入5mL乙醇-乙醚混合液，將離心管置于40-50℃熱水中5min，攪拌，離心，棄清夜(含有脂溶性物質(zhì))，得到的沉渣即為AINLP。

將AINLP管加入2mL1NNaOH，于37℃保溫15-20h進行堿水解(常振搖以確保充分堿解)。上述管內(nèi)加入0.4ml冷的6NHCl及2ml冷的10%TCA，則DNA及蛋白沉淀，離心，上清液含RNA分解產(chǎn)物及磷蛋白磷，收集清液于10ml刻度試管中，再以2ml冷的5%TCA洗滌沉渣，離心，合并清液，稀釋至刻度——待測RNA溶液。加入2ml5%TCA于沉渣中，置于90℃水浴上加熱15min，攪拌，則DNA分解而蛋白質(zhì)沉淀，離心，收集清液于10ml刻度試管中，再以2ml5%冷的TCA洗滌沉渣，合并清液，用水稀釋至刻度——待測DNA溶液。2.核酸的水解：上述DNA和RNA提取液每種各取二份，每份2ml，分別移入4支10ml離心管，用4NNaOH中和至中性，各加0.5ml0.1MCaCl2

，離心除磷酸鈣，溶液分別移入4支凱式燒瓶，加熱蒸發(fā)大部分的水分，稍冷卻，各管加入0.5ml濃H2SO4

水解約1h(溶液透明止)。產(chǎn)物為游離嘌呤嘧啶堿，戊糖和磷酸。3.標準曲線的制作和磷的測定

水解液分別移入4支10ml刻度試管，分別用蒸餾水1ml洗滌燒瓶兩次，洗液分別并入各自的試管，以1NNaOH中和溶液，然后按上表進行操作。混勻10分鐘后，選用660nm波長，以“0”號管調(diào)零分別測定OD值。21操作注意事項1.每人獨立操作，不允許兩人穿插取樣；2.要求試劑及所有器皿清潔，不含磷；3.每管加樣和測定均要求平行操作；4.消化溶液定容后務(wù)必上下顛倒混勻后再取樣；5.各種試劑必須用移液管按順序準確量取，移液管口用吸水紙