1、第三節中藥化學成分的分離方法 中藥化學成分經提取濃縮后，得到的仍是含有多種成分的混合物，需選用適當的方法將其中所含各種成分逐一分開，并把所得單體加以精制純化，這一過程稱為分離。 一、兩相溶劑萃取法兩相溶劑萃取法簡稱萃取法，是利用混合物中各成分在兩種不相混溶的溶劑中分配系數的不同達到分離的方法。分配系數是指在一定溫度時，一種物質溶解在相互接觸但不混溶的兩相溶劑中，溶解平衡后，兩溶劑中溶質濃度的比值。此比值在一定的溫度及壓力下為一常數，可以用下式表示： 分配系數 CH物質在上層溶劑中的濃度 CL物質在下層溶劑中的濃度混合物中各成分在兩相溶劑中，分配系數相差越大，分離效果越好。 （一）簡單萃取法是分

2、離物質最簡單最基礎的手段，常用于初步分離。 （二）逆流連續萃取法 是一種兩相溶劑逆行的連續萃取方法。其裝置如圖2-5 （三）逆流分溶法（Counter Current Distribution，CCD） 對性質相似的異構體或同系物，因在兩相溶劑系統中的分配系數接近，用一般的萃取及轉移操作常須進行幾十次乃至幾百次，簡單的分次萃取已不能滿足需要，用逆流分溶法可得到理想的分離效果。 逆流分溶法又稱逆流分配法、逆流分布法或反流分布法。是一種將液-液萃取反復進行數十次以上的分離方法。如圖2-6所示 逆流分溶法因操作條件溫和、試樣易回收，故特別適合于中等極性、不穩定、性質相似成分的分離。另外，溶質濃度越低

3、，分離效果越好。但試樣極性過大或過小，或分配系數受濃度或溫度影響過大時，則不易采用此法分離。易于乳化的萃取溶劑系統也不易采用此法。 （四）液滴逆流分配法（Droplet Counter Current Chromatography，DCCC） 這是在逆流分溶法基礎上改進發展起來的一種高分離效能的兩相溶劑萃取法。利用混合物中各成分在兩液相間分配系數的差別，由流動相形成液滴，通過作為固定相的液體柱而達到分離純化的目的。其裝置示意圖見2-7 影響液滴逆流分配的主要因素有：被分離成分在兩相溶劑間的分配系數要大；形成大小合適的移動相液滴，這與兩相間的界面張力、密度差、輸液管口徑和萃取管材料等有關，可以采

4、用數根萃取管預試液滴的形成情況而確定；液滴間的間隔，與泵的送液速度有關，送液速度過快，液滴間幾無間隔變成線流通過固定相，通常也可經過小樣探索而定。 液滴逆流分配法的分離效果往往比逆流分溶法好，且不會產生乳化現象。移動相用氮氣驅動，被分離物質不會因遇空氣中氧而氧化。應用該法曾滿意地分離純化多種成分，如皂苷、生物堿、蛋白質、多肽、氨基酸及糖類等。 二、超臨界流體萃取法 超臨界流體萃取法（Supercritical Fluid Extraction， SFE）是以超臨界流體（簡稱SF）代替常規有機溶劑進行提取、分離的一種新型方法。1超臨界流體的特性與種類 超臨界流體是指物質在高于其臨界溫度（TC）和

5、臨界壓力（PC）時所形成的單一相態。處于超臨界狀態的物質既不是液體，也不是氣體，理化性質介于液體和氣體之間，其特性表現為：超臨界流體的密度比氣體大，而與液體密度相近，因此分子間距離縮短，分子間相互作用大大增強，溶解作用近似于液體；粘度低于液體而與氣體的粘度相近，擴散系數卻比液體大10100倍，有利于成分的擴散溶解；超臨界流體的密度、粘度和擴散系數等，都與溫度、壓力和流體組成有關。 2基本原理超臨界流體萃取的原理主要是根據超臨界流體對物質有很強的溶解能力，且改變溫度或壓力即可改變流體的密度、粘度和擴散系數，流體對物質的溶解特性也隨之改變，因此，可將不同性質的成分分段萃取或分步析出，達到萃取分離的

6、目的。 實際應用中，一般采用程序升壓法分步萃取不同極性的成分。超臨界流體萃取成分之后，可利用減壓法，使流體膨脹，密度降低，變為氣體，與成分成為兩相而分離。所以此法的優點是萃取物無殘留有機溶劑，分離后的氣體可循環使用，而且避免了溶劑對環境的污染。工藝流程簡圖見圖2-8。3超臨界流體萃取法的應用 超臨界流體萃取法始于20世紀50年代，到70年代末，該法廣泛應用于煙草和食品工業，80年代以來，超臨界流體萃取技術在醫藥、化工、食品及環保等領域取得了迅速發展，特別是在中藥有效成分提取分離方面日益受到重視。目前主要用于萜類、揮發油、生物堿、黃酮、苯丙素、皂苷和芳香有機酸等成分的提取分離。在青蒿素浸膏、蛇床

7、子浸膏、胡椒精油、肉豆蔻精油等的制備分離方面已達到產業化規模。三、沉淀法 沉淀法是在中藥提取液中加入某些試劑，與其中一些成分生成沉淀，或加入某些試劑后可降低一些成分在溶液中的溶解度而自溶液中析出的一種方法 如果所需要分離獲得的成分生成沉淀，則沉淀反應必須是可逆的；如果是不需要的成分，則將生成的沉淀除去，可以是不可逆的沉淀反應。（一）乙醇沉淀法 此法是在濃縮后的水提取液中，加入一定量的乙醇，使某些難溶于乙醇的成分從溶液中沉淀析出的方法 （二）酸堿沉淀法本法是利用某些成分在酸（或堿）中溶解，而在堿（或酸）中沉淀的性質達到分離的方法。 （三）鉛鹽沉淀法 是利用中性醋酸鉛或堿式醋酸鉛在水或稀醇溶液中能

8、與許多物質生成難溶性的鉛鹽或鉛絡合物沉淀，而使各成分得以分離的方法。 鉛鹽沉淀法既可用來除去雜質，也可用來沉淀有效成分。 （四）鹽析法 此法是向混合物水溶液中加入易溶于水的無機鹽至一定濃度或成飽和狀態，使某些中藥成分在水中溶解度降低而析出，達到與其他雜質分離的目的。常用于鹽析的無機鹽有氯化鈉、硫酸鈉、硫酸鎂、硫酸銨等。 四、結晶法 從非結晶狀物質通過處理得到結晶狀物質的過程稱為結晶。用反復結晶的方法，從不純的結晶制得較純結晶的過程稱為重結晶。結晶法往往用于固體物質的精制純化，是利用混合物中各成分對某種溶劑溶解度的差別，使單一成分以結晶狀態析出，從而達到分離目的。 （二）結晶溶劑的選擇 結晶法的

9、關鍵是選擇適宜的溶劑。恰當的溶劑一般應符合下列條件： 1溶解度 對欲結晶成分熱時溶解度大，冷時溶解度小；而對雜質則冷、熱均溶或均不溶。 2與被結晶的成分不發生化學反應。 3沸點 溶劑的沸點適中，若沸點過高，則附著于晶體表面不易除去，過低又不利于晶體析出。（三）結晶純度的判斷 1晶形和色澤 結晶性純凈物質，一般具有一定的晶形和均勻的色澤。化合物結晶的形狀往往因所用溶劑不同而有差異。2熔點和熔距 單體化合物還應有一定的熔點和較小的熔距。如為純凈的化合物，重結晶前后的熔點應該一致。 六、分餾法 此法是利用混合物中各成分沸點的不同進行分離的方法。適用于能夠完全互溶的液體混合物的分離。在中藥化學成分的研

10、究工作中，常用分餾法分離揮發油及一些液體生物堿。七、色譜法 色譜法（chromatography）又稱層析法，是一種分離和鑒定化合物的有效方法，其最大的優點在于分離效能高、快速簡便。對一些結構性質相似化合物的分離，用經典的萃取法、沉淀法和結晶法等難以達到分離目的時，用色譜法往往可以收到很好的分離效果。 色譜法根據分離原理可分為：吸附色譜、分配色譜、凝膠色譜與離子交換色譜等； 根據分離方法又可分為： 薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC） 柱色譜法（column chromatography） 紙色譜法（paper chromatography，PC） 高效液相

11、色譜法和氣相色譜法等 硅膠和氧化鋁含水量越高、活性級別越大，吸附活性越弱。 只要在110左右加熱，這些“自由水” 就能被可逆性地除去。利用這一原理可以對吸附劑進行活化（去水）和脫活化（加水）處理，以控制吸附劑的活性。 硅膠、氧化鋁的含水量與活性級別活性級別 硅膠含水量% 氧化鋁含水量% 0 0 5 3 15 6 25 10 38 15（3）聚酰胺 （4）活性炭 1）粉末狀活性炭 2）顆粒狀活性炭 3）錦綸活性炭 3展開劑 化合物被吸附劑吸附后，需用合適的溶劑進行展開，這種溶劑稱為展開劑，在柱色譜中習慣稱為洗脫劑。展開劑在吸附色譜中主要作用是解吸附。 在吸附色譜中，展開劑的展開能力與其極性有關。

12、對于極性吸附劑，展開劑的極性越大，其展開能力越強，化合物在色譜中移動的速度就越快，而對非極性吸附劑則相反，展開劑的極性越小，其展開能力越強。 4被分離成分 被分離成分與吸附劑、展開劑共同構成了吸附色譜中的三要素。 對硅膠、氧化鋁等極性吸附劑來說，對極性大的化合物吸附強，移動慢，Rf值小；而對極性小的化合物吸附弱，Rf值大，從而將各成分分離開。全面考慮吸附劑、展開劑和被分離成分三者的相互關系，是分離成敗的關鍵。 5操作方式 吸附色譜常見的操作方式是薄層色譜和柱色譜。薄層色譜主要用于化學成分的預試、鑒定及探索柱色譜分離的條件，柱色譜主要用于化學成分的分離制備及含量測定。 （1）吸附薄層色譜法 此法

13、是將吸附劑均勻地鋪在玻璃板上形成薄層，把欲分離的試樣溶液點加到薄層板的一端，然后用合適的展開劑展開，使混合物中各成分得以分離的方法。 吸附薄層色譜的操作主要包括鋪板（制板）、點樣、展開和顯色四個方面。實際工作中常用硅膠-羧甲基纖維素鈉（硅膠CMC-Na）薄層板，展開方式有上行法、下行法、單向展開、雙向展開等多種。 將計算出的Rf值與已知化合物的Rf值對照，也可與文獻上記載的Rf值比較，進行定性鑒別。 薄層色譜廣泛應用于植物各類化學成分的分離鑒定，也可應用于中草藥品種、藥材及其制劑真偽的檢查、質量控制和資源調查。藥典一部采用薄層色譜法作鑒別的中藥材和中藥成方制劑品種已達1523種（2）吸附柱色譜

14、法 吸附柱色譜法是將試樣加入到一定規格裝有吸附劑的玻璃柱里，再用適當的溶劑洗脫，使結構性質不同的成分達到分離的方法。其分離原理、吸附劑和洗脫劑的選擇均與吸附薄層色譜法基本相同。柱色譜的具體操作可分為裝柱、加樣和洗脫三步。（二）分配色譜法 分配色譜法是一種利用混合物中各成分在互不相溶的兩相溶劑中分配系數的不同，進行分離的色譜方法。 1基本原理 1基本原理 分配色譜的原理來自于兩相溶劑萃取法。2載體 載體又稱支持劑、擔體，在分配色譜中只起支持固定相的作用，對被分離成分無吸附作用，而且作為分配色譜的載體均為中性多孔粉末，不溶于兩相溶劑中，也不與被分離成分發生化學反應。 3固定相、流動相與被分離成分

15、據固定相與流動相的極性差別，分配色譜有正相與反相色譜法之分。在正相分配色譜法中，流動相的極性小于固定相極性，而在反相分配色譜法中，流動相的極性則大于固定相的極性。 反相分配色譜法應用廣泛，其常用的固定相是在普通硅膠表面進行化學修飾，鍵合上長度不同的烴基（R）形成親脂性表面，習稱鍵合相，如十八烷基或辛基硅烷鍵合相。4操作方式 （1）紙色譜法 （2）分配薄層色譜法 （3）分配柱色譜法 （三）高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC） 此法是在經典的液相色譜基礎上發展起來的一種快速分離分析新技術。是采用了高效填充劑，利用加壓手段加快流動相流速的一種高效能液相色譜