1、關于原核生物的轉錄及調控第1頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四轉錄：在DNA指導的RNA聚合酶催化下，以DNA鏈的一條鏈為模板，按照堿基配對原則合成RNA鏈的過程。不對稱轉錄：在DNA雙鏈分子中，轉錄通常只在DNA的一條鏈上進行，另一條鏈則不能轉錄，但可能對轉錄起調節作用，這種轉錄方式稱不對稱轉錄。轉錄單位：就是從啟動子到終止子的一段DNA序列。第一節 轉錄概述第2頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四一、基因的編碼鏈和有意義鏈 模板鏈：用于轉錄RNA的鏈稱為模板鏈，或負（）鏈，又稱無義鏈。編碼鏈：與模板鏈互補的DNA鏈稱為編碼鏈，或正（）鏈，又稱有義鏈。第

2、3頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四二、轉錄的基本要點 底物：NTP； 模板：反義鏈；方向：53 ；酶：RNA pol ；產物：RNA單鏈第4頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四轉錄和復制：都是遺傳信息的傳遞第5頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四三、轉錄起始位點轉錄起點位點核苷酸為1。上游序列upstream ：轉錄起點的前面的序列，用負數碼（）表示，起點前一個核苷酸為1。下游序列downstream： 轉錄起點的后面的序列，用正數碼（）表示。沒有編號為的堿基。第6頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四第7頁，共67頁，

3、2022年，5月20日，7點4分，星期四第二節 原核生物轉錄的相關酶類 一、E.coli RNA聚合酶E.coli只有一種聚合酶；E.coli RNA pol全酶由5種亞基組成，即2，480kD；2 構成核心酶，核心酶與因子構成全酶。 第8頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四E.coli RNA聚合酶的基本性質第9頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四RNA polymerase in prok. Core EnzymeHolo Enzyme for elongationfor initiation依靠靜電作用力依靠空間結構非專一性與非特異DNA 結合專一性與

4、 特異DNA結合半衰期；60半衰期；數小時cover60bp 第10頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四Richard Burgess and Andrew Travers (1969) 150 kD160 kD 70 kD 40 kDCartoon illustrating separation of the subunits of E. coli RNA polymerase by SDS第11頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四1、核心酶：催化磷酸二酯鍵的形成亞基：2個，功能多樣（核心酶的組建因子、促進雙鏈的解開和重新聚合、啟動子識別、促進RNA po

5、l與DNA 模板鏈上游轉錄因子結合）亞基：1個，結合核苷酸底物，催化磷酸二酯鍵的形成； 亞基：堿性強，與模板鏈結合；二、RNA聚合酶各亞基的功能第12頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四2、因子：Reusable；修飾 RNA pol 的構型；識別啟動子，但無催化活性。 不同原核生物具有基本相同的核心酶，但亞基有所差別，決定了原核生物基因的選擇性表達。第13頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四3、原核生物RNA聚合酶抑制劑：利福平（Rifampin）：與細菌RNA pol 亞基結合，阻礙轉錄的起始作用；利鏈菌素（ streptolydigin）：與細菌RNA

6、 pol 亞基結合，抑制轉錄的延伸。肝素：與細菌RNA pol 亞基結合，阻礙其與模板DNA的結合。第14頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四第三節 原核生物轉錄的過程 RNA的轉錄包括promotion，elongation，termination 三過程；從promoter到terminator稱為transcriptional unit；原核生物中的轉錄單位多為 polycistron ；轉錄起始點記為+1，其上游記為負值，下游記為正值。+1 -10 +10upstreamstart pointdownstream第15頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星

7、期四一、轉錄的起始 關鍵：全酶能以很高的親和性結合在啟動子promoter ；啟動子：RNA聚合酶識別、結合并起始轉錄的一段DNA序列。第16頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四promoter 由兩個重要部分組成 （一）原核啟動子的結構第17頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四 -70 -40 ：up element（上游元件） CAP-cAMP binding site -35 -10：core promoter（核心啟動子） RNA pol. binding site 基因表達調控的正控制位點CAP： Catabolite gene Activator

8、 ProteincAMP Acceptor Protein（cAMP受體蛋白）（分解代謝基因激活蛋白）第18頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四 1、核心啟動子： Sextama Box：（R site）TTGAC（Sextama Box）-35 site。RNA pol. loosely binding sitePribnow Box： TATAAT（pribnow Box）-10 site。RNA pol. firmly binding site（B site）Initiation site ：+1 site。RNA transcriptional startpoint

9、（I site）A/G-35 (R)-10 (B)+1 (I)RNA第19頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四lSextama Box與Pribnow Box間距17bp，有利于RNA pol啟動l-35 Box or -10 Box mut. 間距趨近于17 bp，up mutation間距遠離于17 bp，down mutation17bp的間距比17bp的序列對轉錄更為重要-35 Box and -10 Box mut. 轉錄效率下降100倍 轉錄效率下降1000倍第20頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四2、上游元件： CAP-cAMP bindin

10、g site （Activator region，AR）當：ARI + CAP-cAMP AR I：CAP-cAMP 的強結合位點（-70 -50） AR II：CAP-cAMP 的弱結合位點（-50 -40）cooperative effect提高ARII 的結合效率IR-70 ARI-40ARII IR -50第21頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四 RNA pol AR II + CAP-cAMP 復合體： 促使-35 box附近GC島區的雙螺旋結構穩定性降低，-10 box的解鏈溫度降低，有利于轉錄啟動 ARI ARII GC Island -35 -10 Null

11、 AR II RNA pol. into -10 Box but transcription off ARII + CAP-cAMPpromotionRNA pol. into -35 Boxinto -10 Boxstarting transcription RNA pol RNA pol第22頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四-CTDCAP-cAMPARI ARIIARI ARIIActivation transcription Up element + CAP-cAMP RNA Polymerase復合體 CAP-cAMP 與RNA Polymerase的-CTD結合

12、，激活轉錄 第23頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四（二）原核基因轉錄的起始 1、因子的作用：降低全酶與一般DNA的非專一性結合力（20000倍）；增強全酶與啟動子R site、B site的專一性結合力 （100倍）；導致RNA鏈的延伸緩慢第24頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四Promoter與 factor 間的結合專效性決定了 strong promoter & weak promoter； -35 box, -10 box的差異影響啟動子與RNA pol 中因子的結合能力；不同啟動子的-35，-10 box間存在較為保守的標準序列（標準啟動子）

13、； factor is responsible for recognition of consensus sequence of promoter and only required for initiation.第25頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四2、RNA pol與啟動子的結合因子識別啟動子上結合位點。 RNA pol全酶與-35 box結合封閉型啟動復合物；酶向-10 box移動，并與之牢固結合，促使-10 box及起始位點處發生局部解鏈開放型啟動復合物；DNA解螺旋擴展到-10 box下游17bp范圍。第26頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四

14、3、轉錄起始位點的決定酶與-10 box 的結合，決定了第一個起始堿基的選擇。第一個被轉錄的堿基離-10 box 的保守T約69nts。mRNA的起始位點多為G，其次為A ，很少為U, 起始點核苷酸的兩側分別為C 和T。第27頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四4、三元復合物的形成和因子的解離RNA合成一開始，就形成模板-RNA pol-RNA的三元復合物。因子解離，核心酶與模板的親和性下降到非特異性結合的水平，RNA pol在DNA鏈上變得容易移動，為鏈的延伸創造了條件；游離的因子可以重新進行功能循環。 第28頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四轉錄的起始

15、核心酶在因子幫助下特異性結合到DNA上；RNA pol與啟動子-35 box 結合，形成封閉型起始復合物；酶滑動到-10 box，轉變成為開放型起始復合物，啟動子活化，雙鏈解開，模板鏈暴露，插入最初的2個核苷酸；酶繼續加上開頭的幾個NTP，形成三元起始復合物，在RNA鏈合成了89個堿基后，因子解離，轉錄開始。 第29頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四Model of the interaction between E. coil RNA polymerase holoenzyme and a promoterDNAIncorporating the first few Nt

16、第30頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四二、原核生物轉錄的延伸 RNA pol沿著模板鏈移動，RNA鏈不斷延伸，并保持三元復合物的結構；轉錄泡中的DNA螺旋前開、后合，RNA延長，不斷脫離DNA；RNA鏈的延伸速度不是恒定的，在模板富含GC的區域，轉錄就會減慢/停頓。 第31頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四17bp螺旋解開長度12bpDNA-RNA復合體長度第32頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四影響RNA延伸速度的因素： RNA pol； 暫停信號：導致轉錄速度突然出現變化的特殊序列。GC富集區：產物RNA不易釋放；IR：產物形成

17、莖環結構，妨礙上游的模板恢復雙鏈。 其他配基：ppNpp、NusA蛋白。第33頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四NusA protein ： 69 Kd, acid protein RNApol-attaching factor Impel RNApol. pausing in terminator for 1-15 and waiting for Rho factor to stop transcription of RNA After initiation substituting NusA + core E antitermination N protein util

18、ization substance第34頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四NusA binds to polymerase, and N binds to both NusA and box B of the nut site region of the transcript, creating a loop in the growing RNA. This complex is relatively weak and can cause antitermination only at terminators near the nut site (These conditi

19、ons exist only in vitro.). (Nut N binding site )antitermination N protein第35頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四三、原核生物轉錄的終止 轉錄的終止依賴于RNA產物的特定序列；原核和某些真核生物的終止子要求轉錄產物RNA 3端具有發夾的二級結構，莖部富有GC序列；終止子的分類： 根據終止反應是否需要蛋白第36頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四1、不依賴于因子的終止子（強終止子）結構特點：RNA具有一個發夾結構（富含GC）和隨后polyU片段。 作用機制：RNA pol + 發夾結構

20、轉錄暫停 后隨雜合分子不穩定的poly(U-dA) RNA容易從模板上脫落RNA-DNA-RNA pol 解聚 轉錄終止第37頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四第38頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四2、依賴于因子的終止子（弱終止子） 因子：55kD，六聚體。能夠利用水解ATP釋放的能量使RNA從三元復合物中釋放出來；結構：仍然具有莖環結構，但GC堿基對含量較少，下游也缺乏polyU結構。 第39頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四第40頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四1、2、3、第41頁，共67頁，2022年，5

21、月20日，7點4分，星期四第42頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四第四節 原核生物轉錄的調控基因表達的調控主要發生在轉錄水平；轉錄水平上的調控是最為經濟、靈活，又是最為重要、復雜的調控； 確定需要轉錄基因的起始位點； 精細調節基因表達的水平； cis factor 與 trans factor 嚴格又靈活的互作； 保證RNA pol的連續轉錄，準確終止。第43頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四一、原核轉錄調控的相關概念 （一）誘導和阻遏：誘導：酶的合成取決于特定物質（常為substrate）的存在。如培養基中乳糖的存在促進了E.coli的半乳糖苷酶的合成

22、；阻遏：當培養基中某種物質（常為product）含量較高，細胞就關閉合成這種物質的能力。如培養基中Trp的存在抑制了E.coli Trp的合成；第44頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四（二）調控的效應物調節蛋白 + 小分子物質 原核操縱子的誘導/阻遏。這些小分子是基因表達的調節物質-效應物。誘導物（inducer）：與調節蛋白結合，使其從DNA分子上脫落下來，RNA pol開始轉錄。 輔阻遏物（co-repressor）：與調節蛋白結合，可以提高調節蛋白與操縱基因的親和性，進而關閉結構基因的轉錄。第45頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四（三）正調控和負調

23、控 正調控：調節蛋白與操縱子結合后促進轉錄的進行。 負調控：調節蛋白與操縱子結合后抑制轉錄的進行。正、負調控都存在著誘導和阻遏。第46頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四positiveactiveinactiveInd.Rep. 正調控 + 誘導 調節蛋白無活性轉錄不進行 誘導物+調節蛋白有活性調節蛋白轉錄進行 正調控 + 阻遏 調節蛋白有活性轉錄進行 輔阻遏物+調節蛋白無活性調節蛋白轉錄不進行第47頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四negativeactiveinactive 阻遏蛋白有活性轉錄不進行 誘導物 + 阻遏蛋白無活性阻遏蛋白轉錄進行 負調控

24、 + 誘導 負調控 + 阻遏阻遏蛋白無活性轉錄進行 輔阻遏物 +阻遏蛋白有活性調節蛋白轉錄不進行Ind.Rep.Negative第48頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四二、操縱子理論（operon concept）定義：原核生物基因表達和調控的單元。包括： 結構基因：編碼控制某一代謝途徑的相關的酶； 調控元件：是調節結構基因轉錄的一段DNA序列，包括啟動子和操縱基因； 調節基因：其產物（調節蛋白）能夠識別并結合操縱基因，決定結構基因的轉錄與否。 第49頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四（一）lac操縱子（lactose operon）：1、lac操縱子的

25、結構調節基因（I）：編碼阻遏物（Repressor）。啟動子（Promoter，P）：RNA pol的結合位點；操縱基因（Operator，O）：進入結構基因的開關；結構基因：Z（-半乳糖苷酶）、Y（-半乳糖苷透過酶）、A（-半乳糖苷乙酰基轉移酶） ；第50頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四-半乳糖苷酶：水解含-半乳糖苷鍵的底物，如乳糖。-半乳糖苷透過酶：使外界的-半乳糖苷能透過E.coli細胞壁和原生質膜進入細胞內。-半乳糖苷乙酰基轉移酶：乙酰CoA+-半乳糖苷乙酰半乳糖。 當E.coli需要利用培養基里的乳糖時，前2種酶是必需的，而最后1種酶則是非必需的。第51頁，共6

26、7頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四 沒有乳糖lacI編碼的阻遏蛋白具有活性牢固結合到操縱基因O上結合在啟動區的RNA pol不能通過Z、Y、A不能轉錄（和表達）2、lac操縱子的負向調控機制 負調控 + 誘導第52頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四 加入乳糖乳糖（誘導物）與阻遏蛋白結合阻遏蛋白構象變化 阻遏蛋白從操縱基因上脫落 RNA pol開始Z、Y、A基因的轉錄表達乳糖被利用 第53頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四3、 lac操縱子CAP的轉錄激活作用 正調控CAP：二聚體，可同時與DNA、cAMP結合；G存在細胞內cAMPCAP二聚體

27、不能單獨與DNA結合lac 操縱子關閉G缺乏細胞內cAMP CAP與cAMP結合 CAP-cAMP復合物 + lac 操縱子啟動子上游 DNA鏈發生90o彎曲 增強RNA pol與啟動子的結合 lac 操縱子打開 Z、Y、A基因轉錄、表達第54頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四CAP第55頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四乳糖操縱子的協同調節(coordinate regulation)負向調節與正性向調節協同合作阻遏蛋白封閉轉錄時，CAP不發揮作用如沒有CAP加強轉錄，即使阻遏蛋白從lacO上s釋放仍無轉錄活性結論：lac操縱子強的誘導作用既需要乳糖又需缺乏葡萄糖第56頁，共67頁，2022年，5月20日，7點4分，星期四（二）trp操縱子Trp的合成：一系列酶促反應的結果（分支酸 鄰氨基苯甲酸 吲哚甘油磷酸 Trp）；1、trp操縱子的阻遏系統轉錄起始的調節有Trp：Trp結合并激活阻遏蛋白，阻斷轉錄；無Trp：阻遏蛋白無活性，操縱子基因開始轉錄。第57頁，共