1、中藥血清藥理學及其在腫瘤藥理中應用中藥血清藥理學及其在腫瘤藥理中應用中藥血清藥理學及其在腫瘤藥理中應用21概說2血清供體動物的選擇3動物給藥及采血方案的設計4血清的滅活5血清的添加6含藥血清的保存7實驗研究舉例 8血清藥理學研究中存在的問題9血清藥理學工作的發展趨勢中藥血清藥理學及其在腫瘤藥理中應用中藥血清藥理學及其在腫瘤藥1概說2血清供體動物的選擇3動物給藥及采血方案的設計4血清的滅活5血清的添加6含藥血清的保存7實驗研究舉例 8血清藥理學研究中存在的問題9血清藥理學工作的發展趨勢21概說6含藥血清的保存21概說 中藥血清藥理實驗方法是一種新的改良的中藥體外實驗方法。它將受試物（試驗樣品）經

2、口給與動物后，取其血清作為藥物源加入離體實驗體系中研究其藥理作用。 31概說 中藥血清藥理實驗方法是一種新的改良的中藥體外實驗方法關于血清藥理學的幾篇重要的文獻：Iwama H，Effcet of Shosaikoto（復方小柴胡湯），a Japanese and Chinese Triditional herbal medicinal mixture on the mitogenic activity of lipopolysaccharide，A new pharmacology testing method， J Ethnopharmacol，1987，211：45，田代真一，“血清藥理

3、學”“血清藥化學”漢方藥理學始藥物血中濃度測定新世界，TDM研究，1988，（5）：54張群豪、陳可冀：血清藥理學在中藥及復方研究中應用的評價，中國中西醫結合雜志，1996，16（3）：131 張群豪、鐘蓓、陳可冀，等：用血清藥理學方法觀察血府逐瘀濃縮丸對實驗性動脈粥樣硬化家兔主動脈平滑肌細胞增殖的影響，中國中西醫結合雜志，1996，16（3）：156 4關于血清藥理學的幾篇重要的文獻：Iwama H，Effce中藥血清藥理學實驗操作基本過程：確定供血清動物（種屬？生理或病理狀態？）給藥（劑量？次數？）采血（時間？）加入反應體系中實驗觀察（加入量？）分離血清（滅活？）保存（條件？時間？）5中藥

4、血清藥理學實驗操作基本過程：確定供血清動物給藥采血加入反2血清供體動物的選擇2.1動物的種屬實驗證實動物血清具有細胞毒作用，體外細胞實驗顯示，這種細胞毒性作用似與種屬親緣有關，與實驗體系中細胞親緣關系最接近的動物血清細胞毒性作用最輕，而親緣關系較遠的動物血清，較高濃度時就會影響細胞的生存。 62血清供體動物的選擇2.1動物的種屬6附表1 異種血清的細胞毒作用與10%小牛血清組比較，a p0.05， b p0.01。細胞毒性大小排隊（由小到大）：大鼠家兔豚鼠犬小牛人。 血清來源（滅活）3T3細胞（源于小鼠）增殖情況（OD值）10%血清加入量20%血清加入量小牛大鼠豚鼠家兔犬人1.3890.092

5、.1680.21 b1.5020.21 2.0010.26 b1.4260.211.1190.18 a1.8970.16 b1.2930.091.6400.08 b1.4340.050.9470.31 b7附表1 異種血清的細胞毒作用與10%小牛血清組比較，a p上述實驗動物在生物分類中的位置：哺乳綱（Mamalia）真獸亞綱（Eutheria）嚙齒目（Rodentia）： 鼠科（Muridae） 小鼠：小鼠屬（Mus）小家鼠（M.musculus）變種（M.n.albula）大鼠：大鼠屬（Rattus）褐家鼠（R.norregicus）變種（R.n.albus） 豚鼠科（Caviidae）

6、豚鼠：豚鼠屬（Cavia）豚鼠（C. porcellus）兔形目（Lagomorpha）（最初分類歸于嚙齒目） 兔科（Lepus） 家兔：真兔屬（Oryctolagus）兔（O. cuniculus） 8上述實驗動物在生物分類中的位置：哺乳綱（Mamalia）8上述實驗動物在生物分類中的位置：食肉目（Carnivora） 犬科（Canidae）犬：犬屬（Canis）家犬（C. familiaris）偶蹄目（Artiodactyla） 牛科（Bovidae）牛：牛屬（Bos）黃牛（Bos Taurus domesticus Gmelin） 水牛屬（Bubalus）水牛（Bubalus bubal

7、is Linnaeus）靈長目（Primates） 人科（Hominidae）人：人屬（Homo）智人（H. sapiens）中藥腫瘤血清藥理學研究中所用動物主要為小鼠、大鼠以及家兔 9上述實驗動物在生物分類中的位置：食肉目（Carnivora）2血清供體動物的選擇2.2動物的狀態依據實驗的具體情況供體動物可以選擇生理狀態下的動物，也可以選擇病理狀態（疾病模型）下的動物。中藥腫瘤血清藥理學研究中所用血清供體動物，主要選擇正常生理狀態下的動物，但亦有選擇荷瘤動物作為供體動物的。 102血清供體動物的選擇2.2動物的狀態103動物給藥及采血方案的設計3.1給藥劑量與次數A已知臨床用藥劑量給藥劑量=

8、臨床人用劑量動物等效劑量系數在體外實驗體系內的稀釋度。B已知動物藥效學實驗的有效劑量給藥劑量=動物藥效學實驗有效劑量動物等效劑量換算系數（更換動物時）在體外實驗體系內的稀釋度。 113動物給藥及采血方案的設計3.1給藥劑量與次數113動物給藥及采血方案的設計例如某中藥臨床人用劑量為10g/日，體重按50kg計算，則臨床人用為0.2g/kg；血清供體動物選擇大鼠，其等效劑量系數粗略的按照5來計算，在體外實驗體系中添加含藥血清的量按照20%進行（稀釋倍數為5），代入上式計算得到：供體動物給藥劑量=0.255=5g/kg123動物給藥及采血方案的設計例如某中藥臨床人用劑量為10g/日3動物給藥及采血

9、方案的設計3.2給藥次數在大多數情況下，多次給藥優于單次給藥。多次給藥優于單次給藥具有一定的理論依據，它的理論取決于以下兩個因素：其一、是藥物有無蓄積作用，文獻資料表明，大多數藥物具有一定的蓄積性的；其二、是多次給藥后，是否會在藥物的作用下機體產生自體活性物質，比如激素或免疫活性物質，以及這些活性物質在該藥效學實驗中作用的大小。 133動物給藥及采血方案的設計3.2給藥次數133動物給藥及采血方案的設計給藥次數大多為每日1次，連續3至7天，但也可以參照血清藥理學實驗通法，每日給藥2次（間隔12小時），連續給藥3天。另外，需要注意的是為了便于藥物吸收，有人主張采血前的最后一次給藥動物應予以禁食，

10、禁食時間一般認為以12 16小時為宜。 143動物給藥及采血方案的設計給藥次數大多為每日1次，連續3至73動物給藥及采血方案的設計3.3采血時間與方法3.3.1采血時間的確定在實際操作中，采血時間大多在給藥后1至2小時，也有縮短至0.5小時或延長至4小時的。3.3.2采血要求：采血必須在嚴格無菌的條件下進行。如果采用麻醉的話，建議采用乙醚吸入麻醉。靜置2小時以上，保證血液徹底凝固，得到真正的“血清”。離心（3000rpm）10至15分鐘，得到含藥血清。必要時，可以用0.22m微孔濾膜過濾除菌。153動物給藥及采血方案的設計3.3采血時間與方法153動物給藥及采血方案的設計3.4關于中藥血清藥理

11、學實驗通法資料：文獻載有口服給藥Tmax（血藥高峰時間）的藥物113個，文獻載有T1/2（半衰期）的藥物412個。基礎理論依據：（1）藥物多次給藥后，經過45個T1/2達到坪值，此后停止給藥，按一級動力學清除的藥物也要經過45個T1/2在體內基本消除，對少數按照零級動力學（按每單位時間消除恒定藥量使血漿濃度逐漸下降）消除的藥物則需要更長時間。（2）在一次給藥后，藥物尚未達到完全消除而接受第二次給藥，血藥濃度可因蓄積而積累。 163動物給藥及采血方案的設計3.4關于中藥血清藥理學實驗通法13動物給藥及采血方案的設計采血時間點確定：將已知口服給藥Tmax數據的113個藥物進行頻譜分析如下：附表3-

12、1 Tmax的分布范圍是15min 24h，符合正態分布，排列數據時0.5 1h按0.5h計算，1 2h按1h計算。Tmax在1h的有49個藥物，占43.4%（49/113），若加上30min 1h的10個藥，則比例高達52.2%（59/113），也就是說，口服藥物后1h血中藥物達到高峰濃度（Cmax）的機會（概率）是52.2%。Tmax 30min 30min 1h 2h 3h 4h 5h 5h樣品數量 2 10 49 25 15 3 1 8173動物給藥及采血方案的設計采血時間點確定：將已知口服給藥Tm藥物蓄積性分析：依據藥動學理論，一種藥物能否蓄積，取決于該藥T1/2的長短和服藥時間間隔

13、。如果藥物尚未完全消除而第二次給藥，即可產生蓄積。412個已知T1/2的藥品頻譜分析如下：附表3-2 T1/2（h）樣品數量0.490.5 1.0 2.0 3.0 4.0 8.0 24.0 4848192647444569954621T1/2分布范圍是12min 150h，符合正態分布，T1/23h的藥物有216個，占67%（216/412）。若每日給藥2次，間隔12h，那么T1/23h的藥物均可產生蓄積。18藥物蓄積性分析：依據藥動學理論，一種藥物能否蓄積，取決于該藥3動物給藥及采血方案的設計依據上述推論得到實驗通法。通法規定，口服給藥，每日2次，間隔12h，連續給藥3天，末次給藥后1h采血

14、，總體而言中藥成分中約67%可能具有蓄積作用，再加上無蓄積性但在其口服后1h在Tmax內的68個藥品，占412個藥品中的16.5%，兩者相加可達83.5%。 193動物給藥及采血方案的設計依據上述推論得到實驗通法。通法規定附表3-3 例：一項關于含藥血清藥理作用強度與體內給藥的量效、時效關系研究的結果 采血時間（min）給藥劑量45mg/kg給藥劑量90mg/kg給藥劑量180mg/kg給藥劑量360mg/kgLDH釋放量（U/L）抑制率（%）LDH釋放量（U/L）抑制率（%）LDH釋放量（U/L）抑制率（%）LDH釋放量（U/L）抑制率（%）空白血清30609012019.002.9746.

15、3310.5220.678.298.171.94 b9.331.53 a-143.84-8.7957.0050.8918.333.5013.502.26 a14.336.0210.332.58 b15.674.2326.3521.8043.6414.5136.5020.1634.6716.0629.1312.64 a28.6612.64 a32.117.276.8420.2021.4712.0394.3311.9980.6713.7182.509.7776.3319.98 a93.6719.3314.4512.5119.080.67注：與空白血清組比較，a p0.05， b p0.001。 n

16、（每組復空數）=8，含藥血清加入量10%。實驗方法：大鼠灌胃給以待測樣品，劑量為45、90、180、360mg/kg，1/d，5d，末次給藥后30、60、90、120分鐘采血，制備含藥血清，作用于缺氧復氧損傷的乳鼠心肌細胞，通過測定LDH釋放量及其抑制率來評價藥物血清對心肌損傷的保護作用。 20附表3-3 例：一項關于含藥血清藥理作用強度與體內給藥的4血清的滅活4.1血清滅活的原因與目的附表4-1滅活與非滅活正常（空白）血清對細胞生長的影響 與非滅活血清比較a p0.05， b p0.01血清來源：大鼠；細胞系：小鼠3T3細胞株。 血清添加量細胞生長情況（OD值）非滅活血清滅活血清10%20%

17、40%80%100%1.8570.061.7770.071.7580.051.3270.061.0230.092.1680.21 a1.8970.16 b1.8370.08 b1.6250.05 b1.7370.10 b214血清的滅活4.1血清滅活的原因與目的血清添加量細胞生長情況4血清的滅活附表4-2滅活與否對含藥血清生物活性的影響（一）某藥物含藥血清對病毒致細胞病變作用的影響 血清來源：家兔細胞系：Hep-2人喉癌細胞株病毒：副流感病毒-型組別時-效曲線下面積下降率（%）滅活前滅活后正常血清4.3863.4124.5322.1753.7212.4121.5692.2611.2622.12

18藥血清4.6535.1322.8764.1983.6522.5832.1551.5242.5432.5284458473831224血清的滅活附表4-2組別時-效曲線下面積下降率（%）滅活前附表4-3滅活與否對含藥血清生物活性的影響（二）某藥物含藥血清對小鼠離體子宮收縮的影響 空白血清各組均與未處理組比較 a p0.05， b p0.01采用同一處理方法空白血清組與含藥血清組比較 p0.01。血清來源： 小鼠組別血清處理方式血清加量子宮收縮率空白血清未處理加熱滅活醇沉滅活加熱后醇沉滅活醇沉后加熱滅活20微升20微升20微升20微升20微升1.500.611.420.59

19、0.960.420.180.10 b0.120.09 b含藥血清未處理加熱滅活醇沉滅活加熱后醇沉滅活醇沉后加熱滅活20微升20微升20微升20微升20微升1.440.461.410.241.400.43 1.380.23 1.380.23 催產素0.007u/ml3.121.30 a23附表4-3滅活與否對含藥血清生物活性的影響（二）空白血清各組4血清的滅活4.2血清滅活的方法加熱滅活法：加熱56，維持30分鐘。（最常用的方法）丙酮滅活法：在血清中加入4至5倍量的丙酮，混勻，3000rpm離心，取上清液水浴，揮干丙酮即可。乙醇滅活法：處置方法同丙酮滅活法。將丙酮更換成乙醇即可。 244血清的滅

20、活4.2血清滅活的方法245血清的添加決定藥物血清添加量多少主要取決于以下兩點：血清本身具有生物活性，其中包括細胞毒活性。中藥成分的復雜性決定了藥血清藥理學量效關系往往不明確。255血清的添加決定藥物血清添加量多少主要取決于以下兩點：25附表5 不同血清添加量對細胞（3T3）生長的影響 血清添加量（大鼠血清）細胞生長情況（OD值）非滅活血清滅活血清10%20%40%80%100%1.8570.061.7770.071.7580.051.3270.061.0230.102.1680.211.8970.161.8370.081.7370.101.6250.05另外，含藥血清也可以制備成凍干粉直接加

21、入實驗體系中。對于抗腫瘤中藥血清藥理學實驗而言，含藥血清的添加量一般多為10% 20%。26附表5 不同血清添加量對細胞（3T3）生長的影響 血清添加6含藥血清的保存在4環境下，一般不宜超過5天，低溫條件下，可以適當延長保存時間。276含藥血清的保存在4環境下，一般不宜超過5天，低溫條件下，7實驗研究舉例 287實驗研究舉例 28例1 【樣 品】中藥腸安泰（組方：大黃 藤梨根 薏苡仁 木香等8味）【研究目的】觀察腸安泰及其主要成分藥物（大黃、藤梨根）的含藥血清對腫瘤細胞的殺傷能力。【腫瘤細胞】Co26lu大腸癌細胞株【動 物】Wistar大鼠，30010g。 29例1 【樣 品】中藥腸安泰（組

22、方：大黃 藤梨根 薏例1【給藥方案】腸安泰（干膏）、大黃（干膏）、藤梨根（干膏），ig，0.6mlkg-1d-1。劑量分別為腸安泰0.8gkg-1（相當于人用劑量的8倍），大黃0.8gkg-1，藤梨根0.8gkg-1。兩種方案， 一日給藥和三日給藥，前者給藥一次，1小時后采血，后者連續給藥三日，每日一次，末次給藥后1小時采血。給藥前均禁食6 12小時。 30例1【給藥方案】腸安泰（干膏）、大黃（干膏）、藤梨根（干膏）例1【血清處置】56，30分鐘滅活，-20保存備用。 【試驗體系】腫瘤細胞1106個/ml，加入96孔板，90l/孔。【血清加量】10%、30%、50%。【評價方法】MTT法 31

23、例1【血清處置】56，30分鐘滅活，-20保存備用。 3例1【評價指標】OD值、腫瘤生長抑制率。 【實驗過程】動物給藥， 采血， 分離血清， 加入試驗體系， 37，5%CO2培養24小時， 加入MTT，4小時， 比色， 測定OD值， 計算腫瘤生長抑制率。【實驗結果】詳見附表32例1【評價指標】OD值、腫瘤生長抑制率。 32例1實驗結果附表與模型組相比，P0.05，P0.01。 組別 用藥時間10%30%50%OD值 抑制率（ %）OD值 抑制率（ %）OD值 抑制率（ %）模型組 腸安泰血清組 1d 3d 大黃血清組 1d 3d藤梨根血清組 1d 3d5-Fu血清組 1d0.8960.043

24、0.6850.021 23.60.6410.051 28.50.7220.015 19.40.6980.024 22.10.7580.018 15.40.7330.005 18.20.6150.013 31.40.9320.087 0.6760.034 27.50.6260.027 32.80.7040.029 24.50.7110.004 23.70.7700.018 17.40.7410.033 20.50.5720.019 38.60.9650.123 0.7060.013 26.80.6450.036 33.20.7350.016 23.80.7280.022 24.60.7880.0

25、26 18.30.7560.029 21.70.5390.037 44.133例1實驗結果附表與模型組相比，P0.05，P0.0例1【實驗結論】腸安泰具有抑制腫瘤細胞增殖的活性，并呈劑量依賴性，且復方的抗腫瘤活性優于單味藥。王文萍，等：中藥腸安泰體外對Co26lu大腸癌細胞的血清藥理學研究，中華中醫藥研究，2006，21（4）：21334例1【實驗結論】腸安泰具有抑制腫瘤細胞增殖的活性，并呈劑量依例2 【樣 品】參葵湯（苦參 龍葵 山慈菇 墓頭回 莪術 黃芪 女貞子 當歸 甘草等12味）【研究目的】研究參葵湯對卵巢癌細胞增殖的影響【腫瘤細胞】Tyk-nu卵巢癌細胞株，人新鮮的卵巢癌組織分離細胞

26、。【動 物】SD大鼠，30010g。 35例2 【樣 品】參葵湯（苦參 龍葵 山慈菇 墓頭例2 【給藥方案】灌胃給藥，3.27、6.54、13.08g / 300g（等于10.9、21.8、43.6g / kg，相當于臨床人用的等效劑量、2及4倍等效劑量），每日1次， 連續10日， 末次給藥后1小時采血 【血清處置】56，30分鐘滅活。36例2 【給藥方案】灌胃給藥，3.27、6.54、13.08g例2 【實驗體系】腫瘤細胞5105個/ml，加入96孔板，190l/孔，3復孔。【血清加量】20%，配置培養基時加入。【評價方法】3H-TdR摻入法、流式細胞術、胎盤蘭染色計數、細胞集落形成。【評價

27、指標】同位素放射脈沖量（cpm）、細胞增殖指數（PI）、細胞活力、集落形成率、 37例2 【實驗體系】腫瘤細胞5105個/ml，加入96孔板，例2 【實驗過程】動物給藥， 采血， 分離血清， 加入培養基中，分離腫瘤組織，制備新鮮及傳代培養的腫瘤細胞的懸液，37，5%CO2，100%濕度，分別培養60、72、48、72小時供cpm、PI、細胞活力、集落形成率等測定。【實驗結果】詳見附表38例2 【實驗過程】動物給藥， 采血， 分離血清， 加入培養基例2實驗結果附表（一）含藥血清對新鮮卵巢癌腫瘤組織細胞增殖的影響組別鼠數cpm值空白血清組低劑量含藥血清組中劑量含藥血清組高劑量含藥血清組393939

28、39528.6536.05459.0638.69392.2739.26321.0533.03與空白血清組比較P0.01；與低濃度含藥血清組比較P0.01；與中濃度含藥血清組比較P0.05。39例2實驗結果附表（一）含藥血清對新鮮卵巢癌腫瘤組織細胞增殖的（二）藥血清對Tyk-nu卵巢癌細胞增殖的影響組別鼠數PI細胞活力（%）細胞集落形成率（%）空白血清組低劑量含藥血清組中劑量含藥血清組高劑量含藥血清組666625.990.8024.810.4923.540.5821.400.4895.002.0186.122.3173.104.0259.214.5390.123.2781.093.1869.28

29、2.6954.362.52與空白血清組比較P0.05；與低濃度含藥血清組比較 P0.01；與中濃度含藥血清組比較 P0.05 P0.05 40（二）藥血清對Tyk-nu卵巢癌細胞增殖的影響組別鼠數PI細例2 【實驗結論】含參葵湯大鼠血清可抑制卵巢癌新鮮實體瘤細胞及卵巢癌細胞株Tyk-nu細胞增殖。 張軍，等：參葵湯對卵巢癌患者新鮮實體瘤細胞及細胞株Tyk-nu細胞增殖的影響，中醫雜志， 2005，46（3）：219 41例2 【實驗結論】含參葵湯大鼠血清可抑制卵巢癌新鮮實體瘤細胞例3 【樣 品】三物白散加味方（含10%油的巴豆霜 貝母 桔梗 地鱉蟲 莪術 參三七 生薏苡仁 全蝎 木香 炒白芍藥

30、 甘草等）（注：三物白散方 自傷寒論【研究目的】在臨床治療胃癌有效的基礎上， 觀察藥物對胃癌細胞腫瘤相關基因表達的影響【腫瘤細胞】胃癌SGC-7901細胞株。【動 物】日本大耳白，2.50.2kg，/，每劑量組2只。 42例3 【樣 品】三物白散加味方（含10%油的巴豆霜 例3 【給藥方案】灌胃給藥，0.21、0.63、2.1g/只，1次/日，連續3日，末次給藥后2小時， 心臟采血， 分離血清。 【血清處置】56，30分鐘滅活，0.22m微孔過濾除菌， -20保存。 【實驗體系】腫瘤細胞數量無記載。【血清加量】100%。 （？）【評價方法】單抗試劑盒， 流式細胞術【評價指標】多藥耐藥基因MDR

31、43例3 【給藥方案】灌胃給藥，0.21、0.63、2.1g/只例3 【實驗過程】胃癌SGC-7901細胞株傳代培養， 胰酶消化，分瓶，待細胞貼壁后加入三個劑量組的血清，作用10小時， 免疫標記，流式細胞儀測試。【實驗結果】三物白散加味方含藥血清對胃癌腫瘤細胞多藥耐藥基因表達具有抑制作用，并呈量效關系。 44例3 【實驗過程】胃癌SGC-7901細胞株傳代培養， 胰酶三物白散加味方對MDR基因表達率的影響組 別MDR基因表達率陰 性 對 照 組三物白散加味方小劑量組三物白散加味方中劑量組三物白散加味方大劑量組27.3922.2524.769.07 與陰性對照組相比P0.01。 例3實驗結果附表

32、45三物白散加味方對MDR基因表達率的影響組 例3 【實驗結論】三物白散加味方對胃癌腫瘤細胞多藥耐藥基因表達有抑制作用。徐力，等：三物白散加味方影響多藥耐藥基因表達實驗研究，上海中醫藥雜志，2005，39（8）：5946例3 【實驗結論】三物白散加味方對胃癌腫瘤細胞多藥耐藥基因表例4 【樣 品】黃連解毒湯（黃連 黃芩 黃柏 梔子組成）【研究目的】評價黃連解毒湯的抗腫瘤活性。【腫瘤細胞】結腸癌Swille、肺腺癌SPC-A-1、胃癌SGC-7901、乳腺癌MCF-7細胞株。【動 物】荷瘤（H22肝癌）小鼠，昆明種，18 22g，每組11 12只。47例4 【樣 品】黃連解毒湯（黃連 黃芩 黃柏

33、梔例4【給藥方案】灌胃給藥， 黃連解毒湯49.5、16.5、5.5g/kg（相當于臨床人用劑量的9、3、1倍），1次/日，連續8日，末次給藥后1小時摘眼球取血，分離并合并動物血清。同期給以陽性對照藥環磷酰胺，25mg/kg。【血清處置】（不滅活），0.22m微孔過濾除菌， -20保存。【實驗體系】4種腫瘤細胞配置濃度均為1105個/ ml，接種于96孔板，每孔100l，每組10復孔。【血清加量】20%。【評價方法】MTT法。【評價指標】細胞生長抑制率。48例4【給藥方案】灌胃給藥， 黃連解毒湯49.5、16.5、5例4【實驗過程】動物接種腫瘤細胞，分組，給藥，給藥結束，采血，分離合并血清，結腸

34、癌Swille等腫瘤細胞體系中加入含藥血清，培養72小時，加入MTT，培養4小時，比色， 測定吸光度，計算細胞生長抑制率。 【實驗結果】詳見附表。黃連解毒湯對H22小鼠肝癌實體瘤有一定的體內抗腫瘤活性，并具劑量依賴性；其含藥血清體外對4種人的腫瘤細胞也有一定的抑制作用。【實驗結論】黃連解毒湯體內、體外均有抗腫瘤活性，結果具有一致性且呈明確的量效關系。孫健，等：黃連解毒湯抗腫瘤作用的實驗研究，中國中藥雜志，2006，31（17）：146149例4【實驗過程】動物接種腫瘤細胞，分組，給藥，給藥結束，采血例4實驗結果附表黃連解毒湯20%含藥血清體內、外腫瘤抑制作用 與對照組相比， 2）P0.01，3

35、）P0.001。組 別劑量g/kg抑 制 率（%）SwilleMCF-7SPC-A-1SGC-7901H22(小鼠體內)對 照 組環磷酰胺組黃連解毒湯0.02549.516.55.534.212.623）30.162.343）29.383.463）5.127.4228.624.023）36.143.513）25.163.763）17.586.402）48.692.633）49.373.793）48.514.843）20.722.662）34.606.873）45.602.333）38.203.943）22.404.372）67.213）45.453）28.732）17.1850例4實驗結果附表

36、 與對照組相比， 2）P0.01，3例5【樣 品】黃連解毒湯（黃連 黃芩 黃柏 梔子組成）【研究目的】對比黃連解毒湯及其含藥血清的抗腫瘤作用，進行化學成分分析。【腫瘤細胞】肺癌NCI-H446、肝癌Bel-7402細胞株。【動 物】Wistar大鼠，250 300g，8只/組。【給藥方案】灌胃給藥， 黃連解毒湯21、10.5、5.25g/kg，2次/日，連續3日，末次給藥（灌藥前禁食16小時）后2小時，乙醚麻醉，腹主動脈采血，無菌分離血清，同組血清合并。【血清處置】56，30分鐘滅活，0.22m微孔濾膜過濾除菌， -20保存。 51例5【樣 品】黃連解毒湯（黃連 黃芩 黃柏 梔子例5【實驗體系

37、】兩種細胞懸液濃度均為2.5104個/ml，接種于96孔板，每孔100l，每組6復孔。【血清加量】20%。【評價方法】MTT法。【評價指標】細胞生長抑制率。【實驗過程】在觀察黃連解毒湯含藥血清對腫瘤細胞作用的同時， 同步觀察黃連解毒湯樣品對腫瘤細胞生長的影響。 采用 HPLC梯度洗脫對比分析了黃連解毒湯及其含藥血清化學成分的異同。 52例5【實驗體系】兩種細胞懸液濃度均為2.5104個/ml，例5【實驗結果】黃連解毒湯及其含藥血清對腫瘤細胞生長的影響詳見附表。結果發現，它們對2株腫瘤細胞的生長均有抑制作用，HPLC檢測結果顯示， 黃連解毒湯含藥血清與空白血清對比發現，口服黃連解毒湯的吸收入學的

38、成分較多，經過黃連解毒湯樣品與其含藥血清進行對比分析，初步確定了10個來源于復方的原型成分，同時還有幾個代謝產物，但原方劑中的主要成分并未在血清中檢測到。 53例5【實驗結果】黃連解毒湯及其含藥血清對腫瘤細胞生長的影響詳例5實驗結果附表黃連解毒湯的腫瘤生長抑制作用劑量（mg/L）抑制率（%）Bel-7402NCI-H44605010015020025030035018.733.091）25.745.212）31.693.613）57.545.843）73.267.903）85.784.303）90.246.703）0.435.073.175.874.356.4027.574.002）36.97

39、5.333）60.646.373）83.076.273）與0劑量組比較，1）P0.05，2）P0.01，3）P0.001 54例5實驗結果附表抑制率（%）Bel-7402NCI-H44620%黃連解毒湯含藥血清的腫瘤生長抑制作用組別劑量g/kg抑制率（%）Bel-7402NCI-H446空白血清環磷酰胺血清黃連解毒湯血清00.032110.55.2540.672.472）36.413.152）28.372.212）16.554.421）35.682.272）35.243.412）26.695.022）15.412.651）與空白血清組比較：1）P0.01，2）P0.001。5520%黃連解毒湯

40、含藥血清的腫瘤生長抑制作用劑量抑制率（%）B例5【實驗結論】黃連解毒湯及其含藥血清對2種瘤株抑制程度變化的原因可能是黃連解毒湯中各主要成分吸收入血后含量變化造成的。對其進行深入研究，將有助于闡明黃連解毒湯抗腫瘤的有效成分及作用機制。孫健，等：黃連解毒湯及其含藥血清的化學成分及抗腫瘤作用對比研究，中國中藥雜志，2006，31（18）：152656例5【實驗結論】黃連解毒湯及其含藥血清對2種瘤株抑制程度變化例6【樣 品】復方斑蝥膠囊（國藥準字Z19993409）。【研究目的】考察該藥含藥血清對肝癌腫瘤細胞蛋白質組的影響，從分子水平探討其抗腫瘤的作用機制。【腫瘤細胞】肝癌SMMC-7721細胞株。【

41、動 物】新西蘭大耳白兔，2.50.2kg，/兼用。 57例6【樣 品】復方斑蝥膠囊（國藥準字Z19993409例6【給藥方案】按下述公式計算動物給藥劑量：動物給藥劑量=臨床用量等效劑量系數培養體系血清稀釋度式中：等效劑量系數（按體表面積計算）=S兔/S人lgS = 0.8762 + 0.698 lgW（動物 體表面積和體重之間的關系式）S = 體表面積（cm2）W = 體重（g）計算得到家兔給藥劑量為3倍臨床等效劑量。以PBS將復方斑蝥膠囊配置成混懸液，連續灌胃3日，末次給藥后3小時心臟采血，收集血清，同組血清合并。58例6【給藥方案】按下述公式計算動物給藥劑量：58例6【血清處置】56，30

42、分鐘滅活，0.22m微孔過濾除菌， -20保存。【實驗體系】（略）【血清加量】10%。【評價方法】雙向電泳，圖像分析，質譜鑒定。【評價指標】含藥血清作用后差異蛋白的表達情況及質譜鑒定。【實驗過程】含藥血清作用于腫瘤細胞72小時，分離，清洗，收集細胞；細胞裂解，提取蛋白質；蛋白質雙向電泳，染色，圖像分析，選取具有2倍以上量變的蛋白質（差異蛋白質）；質譜分析及數據庫檢索，鑒定蛋白質點。59例6【血清處置】56，30分鐘滅活，0.22m微孔過濾除例6【實驗結果】結果詳見附表。【實驗結論】發現4種與腫瘤的增殖、免疫、凋亡相關的差異表達蛋白質，為進一步研究藥物作用機制提供了線索。血清藥理學與蛋白質組學相

43、結合能夠有效的展示與藥物作用相關蛋白質，可以作為研究復方藥理的一個初步技術平臺。曹永艷，等：復方斑蝥膠囊血清誘導人肝癌SMMC-7721細胞蛋白質組差異表達分析，中國中藥雜志，2007，32（9）：831 60例6【實驗結果】結果詳見附表。60例6實驗結果附表質譜鑒定的差異表達蛋白質點點號數據庫ID匹配肽段等電點相對分子量序列覆蓋率蛋白質名稱25912P64241P08758P11142-01-00-00P32119-00-00-007/1411/1211/156/195.084.945.625.671691835783535982191858482939真核翻譯起始因子5A膜聯蛋白A5熱休克

44、70103蛋白硫氧還蛋白過氧化酶2真核翻譯起始因子5A（eIF-5A）：表達下調。抗腫瘤作用的重要靶標，在低分化、12/13密碼子K-ras突變、p53核蓄積的腫瘤中高表達。膜聯蛋白A5（Annexin ）：表達上調。一種抗腫瘤增殖的蛋白質。熱休克70103蛋白（HSP70）：表達上調。與腫瘤細胞凋亡相關的蛋白質。硫氧還蛋白過氧化酶（PRDX2）2：表達下調。一種作用于Bcl-2上游的抗凋亡蛋白。 61例6實驗結果附表點號數據庫ID匹配肽段等電點相對分子量序列覆例7【樣 品】多羅清泰顆粒（女貞子 黃芪 靈芝 蒲公英 紅景天 藏紅花 半支蓮 蛇舌草 茯苓 葛根等組成）【研究目的】在證實多羅清泰顆

45、粒體內實驗對小鼠肝癌有抑制作用的基礎上，以血清藥理學方法和基因芯片技術觀察藥物對人肝癌細胞信號轉導基因表達的影響。【腫瘤細胞】肝癌SMMC-7721細胞株。【動 物】SD大鼠，30030g，30只，隨機分為3組。【給藥方案】灌胃給藥，8、16g/kg（相當于生物等效劑量的4倍和8倍），1次/日，連續10日，末次給藥前禁食12小時，給藥后1小時摘眼球取血，無菌分離血清。 62例7【樣 品】多羅清泰顆粒（女貞子 黃芪 靈芝 例7【血清處置】56，30分鐘滅活，0.22m微孔濾膜過濾除菌， -20保存。【實驗體系】肝癌SMMC-7721細胞株常規培養。【血清加量】10%。【評價方法】基因芯片技術。【

46、評價指標】基因轉錄相對豐度分析。【實驗過程】含藥血清與腫瘤細胞共同培育48小時， 收集，清洗，裂解細胞；提取并鑒定DNA，制備探針，雜交，化學發光檢測，數據分析；RT-PCR驗證基因芯片檢測結果。63例7【血清處置】56，30分鐘滅活，0.22m微孔濾膜過例7【實驗結果】多羅清泰顆粒含藥血清對所檢測的99條信號轉導基因中的68條基因表達具有顯著影響，占所測基因的69%，其中，上調基因為36條，下調基因為36條，不同劑量組之間的基因表達存在相當大的差異。【實驗結論】多羅清泰顆粒能顯著抑制肝癌細胞的生長，能顯著影響肝癌細胞信號轉導基因的表達。謝佐福，等：多羅清泰顆粒對人肝癌細胞株信號轉導基因表達的

47、影響，中草藥，2007，38（5）：72064例7【實驗結果】多羅清泰顆粒含藥血清對所檢測的99條信號轉導例8【樣 品】半夏瀉心方全方（半夏 干姜 黃芩 黃連 人參 大棗 甘草組成）以及6個不同的配伍方（辛開 苦降 辛苦 甘補 辛甘 苦甘組方）。【研究目的】研究半夏瀉心方全方及不同配伍方含藥血清對胃癌細胞凋亡的影響及作用機制。【腫瘤細胞】胃癌BGC-823細胞株【動 物】家兔，2.0 2.5kg，2只/組。【給藥方案】全方及6種配伍方給藥劑量分別為52、20.8、10.4、31.2、20.8、39、31.2g/kg（相當于臨床人用劑量的10倍）。 連續灌胃3次， 第1、2次間隔20小時， 第2

48、、3次間隔4小時，實驗前禁食12小時。末次給藥后2小時無菌條件下心臟采血， 分離血清。 65例8【樣 品】半夏瀉心方全方（半夏 干姜 黃芩 例8【血清處置】56，30分鐘滅活， -20保存。經培養證實沒有微生物生長。【實驗體系】傳代培養胃癌BGC-823細胞，以培養液懸浮成細胞懸液，接種于96孔板，每孔1104個細胞，每濃度設3個復孔。【血清加量】5%和10%。【評價方法】MTT法（細胞毒作用評價）、DNA凝膠電泳（細胞凋亡檢測）、S-P免疫組化法（Bcl-2基因表達）。【評價指標】細胞存活率，DNA“梯狀帶”顯示，基因表達陽性細胞率。 66例8【血清處置】56，30分鐘滅活， -20保存。經

49、培養例8【實驗過程】將含藥血清加入到對數生長期的腫瘤細胞實驗體系中，分別培育24、48、72小時，爾后，以MTT法測定吸光度，計算細胞存活率。取以含藥血清作用48小時的腫瘤細胞進行DNA提取及瓊脂糖凝膠電泳。將細胞濃度為2104個/ml的細胞懸液加入到直徑為5厘米的培養皿中，并在皿中放置小塊玻片先培養24小時，加入含藥血清，孵育48小時，取出玻片，清洗，固定，干燥，免疫組化染色。 67例8【實驗過程】將含藥血清加入到對數生長期的腫瘤細胞實驗體例8【實驗結果】樣品全方及不同配伍方對細胞生長的影響結果詳見附表。DNA瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，全方、甘補、辛甘、苦甘組含藥血清在凝膠電泳中未能見到典型的

50、“梯狀帶”。辛苦、辛開、苦降組10%含藥血清作用的細胞，其凝膠電泳中可見典型的“梯狀帶”。免疫組化結果顯示，未經處理腫瘤細胞的Bcl-2基因產物高表達，在樣品全方及不同配伍方含藥血清的作用下，Bcl-2的表達受到程度不等的抑制，其中辛苦、辛開、苦降組作用明顯，并以辛苦組作用最佳。 68例8【實驗結果】樣品全方及不同配伍方對細胞生長的影響結果詳見例8【實驗結論】半夏瀉心方中辛開、苦降的配伍形式具有抑制BGC-823細胞增殖，誘導細胞凋亡作用，辛開、苦降配伍后（辛苦）有顯著協同增效趨勢，而其他配伍藥群可能存在拮抗作用。提示辛開苦降法可能是中醫藥防治胃癌的主要治則治法之一。劉喜平，等：半夏瀉心方配伍

51、與誘導BGC-823 細胞凋亡關系血清藥理學研究，中醫雜志，2006，47（2）：134 69例8【實驗結論】半夏瀉心方中辛開、苦降的配伍形式具有抑制BG例8實驗結果附表 半夏瀉心方及配伍藥組含藥血清對BGC-823細胞生長的影響組 別劑量（%）24小時48小時72小時吸光度細胞存活率（%）吸光度細胞存活率（%）吸光度細胞存活率（%）空白組全方組辛開組苦降組辛苦組甘補組苦甘組辛甘組5-Fu (g/ml)05105105105105105105101000.780.070.760.050.640.110.450.040.400.080.660.040.570.050.180.030.170.05

52、0.770.060.750.280.660.020.660.010.520.070.350.060.110.0496.0691.1370.7463.2284.3780.9927.6127.2498.0395.3494.9094.0673.7868.0616.730.790.100.760.070.530.070.200.040.110.010.640.050.490.100.120.070.120.040.630.080.400.100.750.070.490.160.500.040.400.100.050.0395.2882.9828.2415.8680.4177.0214.9114.358

53、9.9056.9095.0969.5672.3556.908.370.800.150.710.030.580.050.200.090.160.060.790.020.580.100.130.020.120.070.780.060.610.160.610.110.590.060.590.070.480.080.01088.4271.9228.8823.4097.0481.9816.4714.9197.0076.4175.7573.3073.3557.000.52與空白組同項目比較，P0.05，P0.01；與辛苦組同項目比較，P0.05；與苦降組同項目比較，P0.05；與辛開組同項目比較，P0.0

54、5。70例8實驗結果附表 劑量24小時48小時7例9【樣 品】川芎嗪【研究目的】觀察川芎嗪含藥血清對人肝癌細胞Hep G2增殖的影響。【腫瘤細胞】肝癌Hep G2細胞株。【動 物】SD大鼠，250 300g，10只/組。【給藥方案】川芎嗪143.0、71.5mg/kg，腹腔注射，1次/日，連續7日，末次給藥后0.5小時于無菌條件下經股動脈采血，分離血清，同組合并。【血清處置】0.45m微孔濾膜過濾除菌， 分裝，-20保存。【實驗體系】以1104個/ml濃度的Hep G2腫瘤細胞懸液接種于96孔板，200l/孔，每組6復孔。 71例9【樣 品】川芎嗪71例9【血清加量】20%、10%、5%。【評

55、價方法】MTT法，RP-HPLC法。【評價指標】腫瘤細胞生長抑制率，含藥血清中川芎嗪的含量。【實驗過程】在經過24小時細胞培養的96孔板中加入濃度不等的含藥血清及空白對照血清，孵育48小時， MTT法測定每孔的吸光度，計算細胞生長抑制率。另一部分高劑量組含藥血清將被用來測定川芎嗪的含量。【實驗結果】含藥血清對腫瘤細胞生長抑制作用的結果詳見附表。川芎嗪含量測定表明，高劑量組大鼠含藥血清中其含量為381.5g/ml。 72例9【血清加量】20%、10%、5%。72例9實驗結果附表川芎嗪含藥血清對人肝癌細胞的抑制作用組 別血清加量（%）吸光度抑制率（%）空白對照生理鹽水川芎嗪143.0mg/kg川芎嗪71.5mg/kg20105