1、 食品安全國家標準食品中煙酸和煙酰胺的測定范圍本標準規定了食品中煙酸和煙酰胺的測定方法。本標準第一法為微生物法，適用于各類食品包括以天然食品為基質的強化食品中煙酸和煙酰胺總量的測定；第二法為高效液相色譜法，適用于含量較高或強化食品中煙酸和煙酰胺的測定。第一法 微生物法原理煙酸是植物乳桿菌Lactobacills plantarm（ATCC 8014）生長所必需的營養素，在一定控制條件下，將植物乳桿菌液接種至添加試樣液的培養液中，培養一段時間后測定透光率，根據煙酸含量與透光率的標準曲線計算出試樣中煙酸的含量。試劑和材料除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規定的二級水。培

2、養基可購買符合測試要求的商品化培養基。試劑鹽酸（HCl）。氫氧化鈉（NaOH）。氯化鈉（NaCl）。濃硫酸（H2SO4）。溴麝香草酚藍（C27H28Br2O5S）：pH指示劑。乙醇（C2H5OH）。試劑配制鹽酸溶液（1 mol/L）：用量筒量取吸取83 mL鹽酸，于1000 mL燒杯中，加917mL水，混勻。鹽酸溶液（0.1 mol/L）：吸取3.2.1鹽酸溶液10mL，加水溶解至100mL。氫氧化鈉溶液（1 mol/L）：稱取40 g氫氧化鈉于1000 mL燒杯中，加水溶解并稀釋至1000 mL，混勻。氫氧化鈉溶液（0.1 mol/L）：吸取3.2.3氫氧化鈉溶液10mL，加水溶解至100m

3、L。生理鹽水（0.9%）：稱取9g氯化鈉（NaCl），溶解于1000ml水中，分裝10mL于試管中，121滅菌15min，備用。乙醇溶液（25%）：量取200 mL無水乙醇與800 mL水混勻。硫酸溶液（1 mol/L）：于2000mL燒杯中先注入700mL水，用量筒量取56mL硫酸沿燒杯壁緩慢倒入水中，用水稀釋到1000mL。培養基乳酸桿菌瓊脂培養基：稱取光解胨15g，葡萄糖10g，磷酸氫二鉀2g，聚山梨糖單油酸酯1g，瓊脂10g于1000 mL燒杯中，加入番茄汁100mL，加900mL蒸餾水溶解，混勻，調pH6.80.2（25），分裝10mL于試管中，121高壓滅菌15min，備用。乳酸桿

4、菌肉湯培養基：稱取光解胨15g，葡萄糖10g，磷酸氫二鉀2g，聚山梨糖單油酸酯1g，于1000 mL燒杯中，加入番茄汁100mL，加900mL蒸餾水溶解，混勻，調pH6.80.2（25），分裝10mL于試管中，121高壓滅菌15min，備用。煙酸測定用培養基：維生素測定用酪蛋白氨基酸12g，葡萄糖40g，乙酸鈉20g，L-胱氨酸0.4g，DL-色氨酸0.2g，鹽酸腺嘌呤20mg，鹽酸鳥嘌呤20mg，尿嘧啶20mg，鹽酸硫胺素200g，泛酸鈣200g，鹽酸吡哆醇400g，核黃素400g，p-氨基苯甲酸100g，生物素0.8g，磷酸氫二鉀1g，磷酸二氫鉀1g，硫酸鎂0.4g，氯化鈉20mg，硫酸亞

5、鐵20mg，硫酸錳20mg。加蒸餾水至1000mL，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液（3.2.4）調pH至6.70.2（2025）。注：自行配制煙酸測定培養基時，所有試劑不得含有煙酸。標準品（C19H19N7O6）：純度99 .5%。標準溶液的配制煙酸標準儲備液（0.1mg/mL）：精確稱取50.0 mg煙酸標準品，用乙醇溶液（3.2.5）溶解并移至500 mL容量瓶中，定容，混勻于24冷藏。此溶液每mL相當于100g煙酸。煙酸標準中間液（10g/mL）：準確吸取10.0mL 煙酸標準儲備液（3.5.1）置于100 mL棕色容量瓶中，用乙醇溶液（3.2.5）稀釋并定容至刻度，混勻于24冷藏。此

6、溶液每mL相當于10g煙酸。煙酸標準中間液（1g/mL）：準確吸取1.0mL 煙酸標準儲備液（3.5.1）置于100 mL棕色容量瓶中，用乙醇溶液（3.2.5）稀釋并定容至刻度，混勻于24冷藏。此溶液每mL相當于1g煙酸。煙酸標準工作液（100ng/mL）：準確吸取5.00 mL煙酸標準中間液（3.2.2）置于50 mL容量瓶中，用水稀釋定容至刻度，混勻于24冷藏。此溶液每mL相當于100ng煙酸。煙酸標準工作液（40ng/mL）：準確吸取0.4mL 煙酸標準中間液（3.5.2）置于100 mL棕色容量瓶中，用乙醇溶液（3.2.5）稀釋并定容至刻度，混勻于24冷藏。此溶液每mL相當于40ng煙

7、酸。儀器和設備天平：感量分別為0.1g和0.1 mg。均質設備：用于試樣的均質化。恒溫培養箱：361。漩渦振蕩器。壓力蒸汽消毒器：121（0.10 mPa0.12 mPa）。離心機：轉速2000 rpm。pH計：精度0.01。分光光度計。超凈工作臺。超聲波振蕩器。微孔板酶標儀菌種的制備與保存菌種：植物乳桿菌Lactobacills plantarm（ATCC 8014）。儲備菌種的制備將菌種植物乳桿菌Lactobacills plantarm（ATCC 8014）轉接至乳酸桿菌瓊脂培養基中，在361恒溫培養箱中培養20 h24 h，取出后放入24冰箱中保存。每月至少傳種一次，作為儲備菌株保存。

8、實驗前將儲備菌株接種至乳酸桿菌瓊脂培養基中，在361恒溫培養箱中培養20 h24 h以活化菌株，用于接種液的制備。保存數周以上的儲備菌種，不能立即用作接種液制備，實驗前宜連續傳種23 代以保證菌株活力。 接種液的制備試驗前一天，從乳酸桿菌瓊脂培養基移取部分菌種于滅菌的10mL乳酸桿菌肉湯培養基（3.3.2）中，于361恒溫培養箱中培養6 18h。在無菌條件下離心該培養液15min，傾去上清液。加入10mL已滅菌的生理鹽水（3.1.3）重新分散細胞，于旋渦混合器上快速混合均勻，離心15min，傾去上清液。重復離心和清洗步驟三次。以第三次細胞分散液中吸取1mL加入10mL已滅菌的生理鹽水（3.1.

9、3），使其充分混合均勻制成混懸液，備用。用721分光光度計，在550nm波長下，以0.9生理鹽水為參比，讀取該菌懸液的濁度值透光值（T），用0.9生理鹽水或第三次細胞分散液調整透光值，使其范圍在6080之間。立即使用。試管法所有操作均需避光進行。試樣制備谷薯類、豆類、堅果（去殼）等試樣需粉碎、研磨、過篩（篩板孔徑0.3 mm0.5 mm）；乳粉、米粉等試樣混均；肉、蛋、魚、動物內臟等用打碎機制成食糜；果蔬、半固體食品等試樣需勻漿混勻；液體試樣用前振搖混合。4冰箱保存，1周內測定。試樣提取準確稱取約含煙酸0.1mg的試樣，一般乳類、新鮮果蔬試樣2 g5 g（精確至0.0001g）；谷類、豆類、堅

10、果類、內臟、生肉、干制試樣0.2 g1 g（精確至0.0001g），液態試樣5g；乳粉、米粉等準確稱取適量試樣2 g（精確至0.0001g）；一般營養素補充劑、復合營養強化劑0.1 g0.5 g；食品0.2 g1 g；液體飲料或流質、半流質試樣5 g10 g于100 mL錐形瓶中，加入硫酸溶液（3.2.6），加入被檢驗物質干重10倍的硫酸溶液（3.2.6）。在121下，水解30min后冷卻至室溫。用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液（3.2.4）調pH至6.06.5，再用0.1 mol/L鹽酸調pH至4.50.1（3.2.2），用水定容至100mL，用無灰濾紙過濾，濾液備用。稀釋根據試樣中煙酸含量

11、用水對試樣提取液進行適當稀釋（f），使稀釋后試樣提取液中煙酸含量在50.0 ng 500.0 ng 范圍內。測定系列管制備標準系列管取試管分別加入煙酸標準工作液0.00 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、4.0 mL和5.00mL，補水至5.0 mL，相當于標準系列管中煙酸含量為0. 0 ng、50 ng、100 ng、150ng、200ng、250ng、300ng、400 ng、500 ng。加5.0 mL煙酸測定用培養基，見表1?；靹?。每個標準點應制備3管。表1標準曲線管的制作試管號（No.）12345678910蒸餾水（mL） 554

12、.543.532.5210標準溶液*（mL）000.511.522.5345培養基（mL）5555555555 *試管 No.12中不添加標準溶液；2中滴加菌液； No.310中添加標準品溶液的濃度依次增高。3個重復。試樣系列管取4支試管，分別加入1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL試樣提取液，補水至5.0 mL，加入5.0 mL 煙酸測定用培養液，見表2。混勻，每個濃度做3個重復。表2試樣管的制作試管號（No.）1234蒸餾水（mL）4321樣品（mL）1234培養基（mL）5555滅菌：將所有的標準系列管和試樣系列管測定管塞好棉塞，于121（0.100.12 mPa）高壓

13、滅菌5 min。滅菌完成后，迅速冷卻，備用。培養接種：在無菌操作條件下，將接種液轉入無菌針管，向每支測定管接種一滴。培養：將加完菌液的試管置于361恒溫培養箱中培養16h24h，直至獲得最大混濁度，即再培養2 h 透光率無明顯變化。另準備一支標準0管（含0.0 ng煙酸）不接種作為0對照管。透光率的測定用厚度為1 cm比色杯，在波長550 nm條件下讀取透光值，將培養好的測定管用漩渦混勻器混勻。以未接種0對照管調節透光率為100%，然后依次測定標準系列管、試樣系列管的透光率。如果0對照管有明顯的細菌增長；或與0對照管相比，標準管透光率在90%以下，、說明可能有雜菌或不明來源煙酸混入，需重做實驗

14、。取出最高濃度標準曲線管振蕩5s，測定透光值，放回重新培養。2h后同等條件重新測該管的光密度，如果兩次光密度的絕對差結果2%，則取出全部檢驗管測定標準溶液和試樣的光密度。標準曲線的繪制以標準系列管煙酸含量為橫坐標，透光率為縱坐標，繪制標準曲線，也可對各個標準點做擬合曲線。各個標準點3管之間的透光率的相對標準偏差應小于10%，如果某一標準點3支試樣管中有2支煙酸含量落在50 ng500 ng范圍內，且該兩管之間折合為每mL試樣提取液中煙酸含量的偏差小于10%，則該結果可用，如果3支試樣管中煙酸含量的相對標準偏差大于10%，則該點舍去，不參與標準曲線的繪制。 結果表述試樣結果計算：從標準曲線查得試

15、樣系列管中煙酸的相應含量（c），按式（1）進行結果計算。測定液濃度按式（1）計算： （1）式中：X 試樣中煙酸含量，單位為毫克每百克（mg/100 g）；c 試樣系列管折合為試樣提取液中煙酸濃度平均值，單位為納克每毫升（ng/mL）；V1試樣提取液定容體積，單位為毫升（mL）；f 試樣提取液稀釋倍數；m 試樣質量，單位為克（g）；折算成每百克試樣中煙酸毫克數的換算系數。以重復性條件下獲得的兩次獨立測XX果的算術平均值表示，結果保留兩位有效數字。注：所用試管使用前洗刷干凈，用蒸餾水煮沸30 min，瀝干后放入鹽酸水溶液（1：50）中浸泡2h，經170烘3h后使用。精密度普通食品在重復性條件下獲得

16、的兩次獨立測XX果的絕對差值不得超過算術平均值的15%；強化食品在重復性條件下獲得的兩次獨立測XX果的絕對差值不得超過算術平均值的5%。96孔微孔板法原理利用微生物法，定量檢測食品中的煙酸總量，將稀釋了的樣品提取液和煙酸檢測培養基與植物乳桿菌混勻后加入微孔中，該菌的生長狀況取決于煙酸的含量并會一直生長直至煙酸被消耗殆盡，細菌生長時新陳代謝的強度和煙酸的含量形成關系并繪制標準曲線，最后通過微孔板酶標儀在630nm讀取結果。樣品前處理試樣制備同6.1。試樣提取準確稱取約含煙酸0.1mg的固態試樣1g（精確至0.0001g）或液態試樣5g（精確至0.0001g）于50mL三角燒瓶中，加入蒸餾水40m

17、L充分溶解，相當于對樣品進行了40倍稀釋，該稀釋倍數包含在標準曲線內。在115下處理10min后冷卻至室溫。吸取1mL于1.5mL離心管在8000rpm離心10min，根據樣品種類的不同取上清液進行稀釋，備用。標準曲線的制作制備標準曲線，將煙酸標準工作液（3.5.5）按表3添加標準品和水（需要將40倍稀釋包含在標準曲線內），使各標準曲線中煙酸終含量0.162.0g ，充分混勻后吸取150L到96微孔板（3個重復），同時加入150L培養基，樣品稀釋到適當濃度后，同樣加入96微孔板培養4448h，于630nm波長下測定透光率，以標準品煙酸含量為橫坐標，透光率為縱坐標，繪制標準曲線。如圖1所示。表3

18、 96微孔板法煙酸測定標準品添加標準品（g）標準品（L）水（L）0010000.161009000.322008000.644006000.966004001. 288002001.6050002.005000圖1煙酸標準曲線 結果表述從標準曲線的公式查得對應試樣煙酸的相應含量，對照該樣品的稀釋倍數和樣品稱重，可以求得試樣的煙酸含量（mg/100g）。按式（2）進行結果計算， （2）式中：X 試樣中煙酸含量，單位為毫克每百克（mg/100 g）；c 試樣提取液中煙酸的濃度，毫克每百克（mg/100 g）；f 試樣提取液稀釋倍數；m 試樣質量，單位為克（g）或（mL）其他本標準試管法線性范圍50

19、 ng 100 ng；96微孔板法線性范圍0.1620.0g，按樣品種類將待測試樣稀釋到線性范圍內再對樣品進行測試和計算，96微孔板法的稀釋倍數一般較試管法低。第二法 高效液相色譜法原理高蛋白樣品經沉淀蛋白質，高淀粉樣品經淀粉酶酶解，在弱酸性環境下超聲波振蕩提取，果蔬等天然食品經提取后凈化濃縮，以C18 色譜柱分離，在紫外檢測器檢測261 nm波長處檢測，根據色譜峰的保留時間定性，外標法定量，計算試樣中煙酸和煙酰胺含量。試劑和材料注：除非另有規定，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規定的一級水。 試劑鹽酸（HCl），優級純。氫氧化鈉（NaOH），優級純。高氯酸（HClO4）：體積

20、分數為60%，優級純。甲醇（CH3OH）：色譜純。異丙醇（C3H8O）：色譜純。庚烷磺酸鈉（C7H15NaO3S）：色譜純。淀粉酶：酶活力1.5 /mg。氨水（NH3H2O）：含量25%28%，優級純。試劑配制鹽酸（5.0 mol/L）：用量筒量取吸取415mL鹽酸（3.1.1），于1000 mL燒杯中，加585mL水，混勻。鹽酸（0.1 mol/L）：用量筒量取吸取8.3 mL鹽酸（3.1.1），于1000 mL燒杯中，加991.7mL水，混勻。氫氧化鈉（5.0 mol/L）：稱取200 g氫氧化鈉（3.1.2）至1000 mL 容量瓶中，加水溶解并稀釋至1000 mL，混勻。氫氧化鈉（0.

21、1 mol/L）：稱取4.0 g氫氧化鈉（3.1.2）至1000 mL 容量瓶中，加水稀釋定容至刻度，混勻。氨水甲醇溶液（1%）：移取1mL氨水（3.1.8）至100 mL 容量瓶中，用甲醇（3.1.4）稀釋定容至刻度，混勻。流動相：甲醇（3.1.4）70mL，異丙醇（3.1.5）20mL，庚烷磺酸鈉（3.1.6）1g，用910mL水溶解并混勻后，用高氯酸（3.1.3）調pH值至2.10.1，經0.45m膜過濾。煙酸和煙酰胺標準溶液煙酸（C6H5NO2）和煙酰胺（C6H6N2O）：純度99 %煙酸和煙酰胺標準儲備液（1.000 mg/mL）：準確稱取煙酸及煙酰胺標準品各0.05g（精確到0.1

22、mg），分別置于100mL容量瓶中，用水溶解，定容至刻度，混勻（4冰箱中可保存1個月）。煙酸和煙酰胺標準混合中間液（100.0 g/mL）：準確吸取煙酸和煙酰胺標準儲備液各10.0 mL 于100 mL 容量瓶中，加水定容至刻度，混勻。臨用前配制。煙酸和煙酰胺標準混合工作液：分別準確吸取標準混合中間液1.0 mL，2.0 mL，5.0 mL，10.0 mL，20.0 mL于100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，混勻，得到濃度分別為1.0 g/mL，2.0 g/mL，5.0 g/mL，10.0 g/mL，20.0 g/mL的標準混合工作液。臨用前配制。儀器和設備天平：感量0.1 mg。恒箱培養箱

23、：30-80。超聲波振蕩器。pH計：精度0.01。高效液相色譜儀：帶紫外檢測器?；旌闲完栯x子交換固相萃取柱:MCX（3cc，60mg）柱，或相當者。固相萃取裝置。氮吹儀。一次性微孔濾頭：帶0.45m微孔濾膜。分析步驟試樣制備非粉狀固態試樣（蔬菜、水果、大米、面條、即食谷物、面包和餅干）粉碎并混合均勻；液態試樣搖勻。 強化食品試樣測定液的制備淀粉類和含淀粉的食品（即食谷物、面包、餅干、面條、小麥粉和雜糧粉等制品）稱取混合均勻固體試樣約5.0g（精確到0.1mg），加入約25mL4550的水，稱取混合均勻液體試樣約20.0g（精確到0.1mg）于150mL錐形瓶中，加入約0.5g淀粉酶（3.1.7

24、），搖勻后向錐形瓶中充氮，蓋上塞，置于5060的培養箱內培養約30min，取出冷卻至室溫。注：如果條件允許，建議酶解時采用55 5水浴振搖。不含淀粉的食品（調制乳、調制乳粉、飲料類、固體飲料類、豆粉和豆漿粉等制品）稱取混合均勻固體試樣約5.0g（精確到0.1mg），加入約25mL4550的水，稱取混合均勻液體試樣約20.0g（精確到0.1mg）于150mL錐形瓶中，置于超聲波振蕩器中振蕩約10min以上充分溶解，靜置5min10min，并冷卻至室溫。提取 待試樣溶液降至室溫后，用5.0 mol/L鹽酸溶液（3.2.2）和0.1 mol/L鹽酸溶液（3.2.1）調節試樣溶液的pH值至1.70.1

25、，放置約2min后，再用5.0 mol/L氫氧化鈉溶液（3.2.4）和0.1 mol/L氫氧化鈉溶液（3.2.3）調節試樣溶液的pH值至4.50.1，置于50水浴超聲波振蕩器中振蕩10min以上充分提取，冷卻至室溫后轉至100mL容量瓶中，用水反復沖洗錐形瓶，洗液合并于100mL容量瓶中，用水定容至刻度后混勻，經濾紙過濾。濾液再經0.45m微孔濾膜加壓過濾，用樣品瓶收集，即為試樣測定液。注：必要時，試樣測定液用水進行適當的稀釋（f），使試樣測定液中煙酸和煙酰胺濃度在1 g/mL20 g/mL范圍內。 天然食品試樣測定液的制備淀粉類和含淀粉的食品（大米、面粉、小麥粉和雜糧粉等）稱取混合均勻固體試

26、樣約5.0g（精確到0.1mg），加入約25mL4550的水，稱取混合均勻液體試樣約20.0g（精確到0.1mg）于150mL錐形瓶中，加入約0.5g淀粉酶（3.1.7），搖勻后向錐形瓶中充氮，蓋上塞，置于5060的培養箱內培養約30min，取出冷卻至室溫。注：如果條件許可，建議酶解時采用55 5水浴振搖。不含淀粉的食品（蔬菜和水果等）稱取混合均勻固體試樣約5.0g（精確到0.1mg），加入約25mL4550的水，稱取混合均勻液體試樣約20.0g（精確到0.1mg）于150mL錐形瓶中，置于超聲波振蕩器中振蕩約10min以上充分溶解，靜置5min10min，并冷卻至室溫。提取 待試樣溶液降至室

27、溫后，用5.0 mol/L鹽酸溶液（3.2.2）和0.1 mol/L鹽酸溶液（3.2.1）調節試樣溶液的pH值至1.70.1，放置約2min后，再用5.0 mol/L氫氧化鈉溶液（3.2.4）和0.1 mol/L氫氧化鈉溶液（3.2.3）調節試樣溶液的pH值至4.50.1，置于50水浴超聲波振蕩器中振蕩10min以上充分提取，冷卻至室溫后轉至100mL容量瓶中，用水反復沖洗錐形瓶，洗液合并于100mL容量瓶中，用水定容至刻度后混勻，經濾紙過濾備用。凈化濃縮 依次用6mL甲醇、6mL水活化好固相萃取柱，再準確吸取濾液1040mL至活化好的固相萃取柱中，控制樣液以1-2mL/min的速度穩定滴下。上樣完畢后，用3mL水淋洗，抽干固相萃取柱，加入3mL1%氨水甲醇（3.2.5）洗脫，控制流速為12mL/min，收集洗脫液。在40下用氮氣緩緩吹至近干，用水定容至1.0mL，渦旋30s溶解殘留物，0.45m濾膜過濾，用樣品瓶收集，即為試樣測定液。參考液相色譜條件色譜柱：C18（