1、關(guān)于人類細(xì)胞質(zhì)的提取第1頁，共29頁，2022年，5月20日，18點43分，星期四人類細(xì)胞質(zhì)RNA提取第2頁，共29頁，2022年，5月20日，18點43分，星期四 真核細(xì)胞質(zhì)總RNA主要由rRNA（80-85%）、tRNA和核內(nèi)小分子RNA(10-15%)、mRNA（1-5%）組成，其中rRNA、tRNA和mRNA位于細(xì)胞質(zhì)中。第3頁，共29頁，2022年，5月20日，18點43分，星期四分離提純RNA的目的分析不同發(fā)育時期基因的表達(dá)狀況獲得新基因研究基因的拼接分析相應(yīng)的蛋白產(chǎn)物第4頁，共29頁，2022年，5月20日，18點43分，星期四RNA的不穩(wěn)定性 由于核糖殘基的2和3位置帶有羥基，

2、RNA易于被RNA酶切割水解 RNA酶含量豐富，加熱后仍能夠正確折疊恢復(fù)活性，不易失活。 所以需要RNA酶抑制劑來抑制RNA酶的活性。第5頁，共29頁，2022年，5月20日，18點43分，星期四3、分離高質(zhì)量RNA RNA的質(zhì)量決定了你能夠轉(zhuǎn)錄到cDNA上的序列信息量的最大值。（1）常用的RNA酶抑制劑焦碳酸二乙酯（DEPC）：是一種強(qiáng)烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性。第6頁，共29頁，2022年，5月20日，18點43分，星期四異硫氰酸胍：目前被認(rèn)為是最有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時也使RNA酶失活。它既可破壞

3、細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有強(qiáng)烈的變性作用。氧釩核糖核苷復(fù)合物：由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物，它和RNA酶結(jié)合形成過渡態(tài)類物質(zhì)，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結(jié)合，使其失活。其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。第7頁，共29頁，2022年，5月20日，18點43分，星期四 （2）RNA提取的一般步驟RNA提取的一般步驟是：破碎組織分離RNA沉淀RNA洗滌RNA融解RNA保存RNA第8頁，共29頁，2022年，5月2

4、0日，18點43分，星期四破碎組織和滅活RNA酶可以同步進(jìn)行可以用鹽酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎組織 加入-ME可以抑制RNA酶活性分離RNA一半用酚、氯仿等有機(jī)溶劑，加入少量異戊醇，經(jīng)過此步，離心，RNA一般分布于上層，與蛋白層分開。沉淀RNA一般用乙醇、3M NaAc（pH-5.2）或異丙醇。第9頁，共29頁，2022年，5月20日，18點43分，星期四洗滌RNA使用70乙醇洗滌，有時，為避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗滌之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能過于干燥，否則不易溶解。融解RNA一般使用TE。保存RNA應(yīng)該盡量低溫。為了防止痕量RNase的污染，從富含RN

5、ase的樣品（如胰臟、肝臟）中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質(zhì)量的RNA，對于長期貯存也應(yīng)該如此。第10頁，共29頁，2022年，5月20日，18點43分，星期四 由于RNA的種類來源很多，因而提取制備方法各異。本次介紹的是Trizol法制備RNA。第11頁，共29頁，2022年，5月20日，18點43分，星期四Trizol法提取RNA TRIzol是一種新型總RNA抽提試劑，可以直接從細(xì)胞或組織中提取總RNA。其含有苯酚、異硫氰酸胍等物質(zhì)，能迅速破碎細(xì)胞并抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶。在破碎和溶解細(xì)胞時能保持RNA的完整性，因此對純化RNA及標(biāo)準(zhǔn)化RNA的生產(chǎn)十分有用。第12頁，共29頁，

6、2022年，5月20日，18點43分，星期四 Trizol試劑主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的蛋白，核酸物質(zhì)解聚得到釋放。 苯酚雖可有效地變性蛋白質(zhì)，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中還加入了8羥基喹啉、異硫氰酸胍、-巰基乙醇等來抑制內(nèi)源和外源RNase（RNA酶）。 Trizol試劑裂解細(xì)胞并釋放出RNA,酸性條件使RNA與DNA分離,加入氯仿后離心，樣品分成水樣層和有機(jī)層。RNA存在于水樣層中。收集上面的的水樣層后，RNA可以通過異丙醇以沉淀的方式還原。在除去水樣層后，乙醇能沉淀析出中間層的DNA，在有機(jī)層中加入異丙醇能沉淀出蛋白。第13頁，共29頁，202

7、2年，5月20日，18點43分，星期四【試劑】 DEPC(焦碳酸二乙酯),氯仿，異丙醇，無水乙醇，0.050.1DEPCH2O，75乙醇，TE緩沖液，瓊脂糖。【配制】1.DEPC水： 1ml1000ml雙蒸水1 DEPC水，1000ml容量瓶中靜置4小時。2.75%乙醇：無水乙醇+DEPC水，-20保存（DEPC水需先高壓）實驗用品第14頁，共29頁，2022年，5月20日，18點43分，星期四基本過程 一、抽提 二、分相 三、RNA沉淀 四、RNA清洗第15頁，共29頁，2022年，5月20日，18點43分，星期四一、抽提細(xì)胞抽提1. 組織取材后用滅菌的錫箔紙包好保存于液氮。實驗時，在液氮中

8、將組織研磨成粉末，趁液氮未揮發(fā)將粉末轉(zhuǎn)移到EP管，室溫5000rpm離心去上清。每50-100mg組織，加入1ml Trizol，反復(fù)抽吸均勻。第16頁，共29頁，2022年，5月20日，18點43分，星期四二、分相3.在裝有裂解物的離心管中加入0.2ml的氯仿(為Trizol總體積的1/5),振蕩 混勻30秒，室溫下靜置5分鐘.4. 12000 rpm離心15分鐘4C,分相為三層。上層：RNA(約為Trizol的 60%)；中間：DNA；下層:蛋白質(zhì)(酚-氯仿)。5.小心吸取上清液，轉(zhuǎn)移到另一EP管中。1ml裂解物產(chǎn)生的上清液體積 約為0.40.6 ml。有機(jī)相和中間層含有DNA和蛋白質(zhì),避

9、免觸及。三、RNA沉淀6.上清液加入約0.5ml的異丙醇,振蕩30秒混勻。室溫下靜置10分鐘。7.4C，離心12000rpm 10分鐘。8. RNA沉淀將在離心底的側(cè)面形成。小心吸棄上清液,注意避免吸棄RNA 沉淀。第17頁，共29頁，2022年，5月20日，18點43分，星期四四、RNA清洗9.離心管加入1ml 預(yù)冷的75%乙醇(1mlTrizol至少用1ml乙醇清洗DNA),振蕩混勻30秒，使沉淀振蕩起來，室溫離心12000rpm12分鐘。盡可能吸棄上清液,防止RNA沉淀丟失。重復(fù)以上清洗步驟一次。在75%乙醇中，RNA在4至少可以保存1周，20至少可以保存1年。10.室溫選擇流動性小，倒

10、置離心管于濾紙上，干燥RNA，但不能完全干燥(510分鐘)。用DEPC水15l溶解沉淀，55-60孵育1015分鐘。11.測量OD值后，樣品放置70保存，一個月第18頁，共29頁，2022年，5月20日，18點43分，星期四RT-PCR第19頁，共29頁，2022年，5月20日，18點43分，星期四 RT-PCR：逆轉(zhuǎn)錄PCR，或者稱反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的一種廣泛應(yīng)用的變形。在RT-PCR中，一條RNA鏈被逆轉(zhuǎn)錄成為互補DNA，再以此為模板通過PCR進(jìn)行DNA擴(kuò)增。應(yīng)用 RT-PCR的指數(shù)擴(kuò)增是一種很靈敏

11、的技術(shù)，可以檢測很低拷貝數(shù)的RNA。廣泛應(yīng)用于遺傳病的診斷，并且可以用于定量監(jiān)測某種RNA的含量。第20頁，共29頁，2022年，5月20日，18點43分，星期四oligo: 多聚體，相當(dāng)于mRNA引物AMV RT：禽類成髓細(xì)胞瘤病毒逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV RT：莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶dNTPs：脫氧核苷酸RNase：RNA水解酶PCR Buffer：RT-PCR緩沖液MgCl2：2價鎂離子第21頁，共29頁，2022年，5月20日，18點43分，星期四基本過程 由一條RNA單鏈轉(zhuǎn)錄為互補DNA(cDNA)稱作“逆轉(zhuǎn)錄”，由依賴RNA的DNA聚合酶即逆轉(zhuǎn)錄酶來完成。 隨后，DNA的另一條鏈通過脫

12、氧核苷酸引物和依賴DNA的DNA聚合酶完成，隨每個循環(huán)倍增，即通常的PCR。 原先的RNA模板被RNA酶 H降解，留下互補DNA。第22頁，共29頁，2022年，5月20日，18點43分，星期四 RT-PCR的關(guān)鍵步驟是在RNA的反轉(zhuǎn)錄，要求RNA模版為完整的且不含DNA、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。常用的反轉(zhuǎn)錄酶有兩種，即鳥類成髓細(xì)胞性白細(xì)胞病毒（avian myeloblastosis virus,AMV）反轉(zhuǎn)錄酶和莫羅尼鼠類白血病病毒（moloney murine leukemia virus,MMLV）反轉(zhuǎn)錄酶。第23頁，共29頁，2022年，5月20日，18點43分，星期四第24頁，共29頁，2022年，5月20日，18點43分，星期四瓊脂糖凝膠電泳第25頁，共29頁，2022年，5月20日，18點43分，星期四 瓊脂糖凝膠電泳主要是應(yīng)用瓊脂糖凝膠作為支持物的電泳法，借助瓊脂糖凝膠的分子篩作用，核酸片段因其分子量或者分子形狀的不同，電泳速度有差異而分離，這種技術(shù)是基因操作中常用的一種方法。 與其他支持物電泳最主要區(qū)別是：它兼有“分子篩”和“電泳”的雙重作用。第26頁，共29頁，2022年，5月20日，18點43分，星期四PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上的電泳檢測 在基因組DNA的提取中，用蒸餾水溶解提取出的DNA，在1.0%的瓊脂糖膠進(jìn)行電泳