1、離子交換層析純化蛋白質的工藝開發離子交換層析分離蛋白的原理是基于其帶電性的不同，通過蛋白質與帶電荷的層析填料之間的靜電作用力進行分離ANB Jlfof p H Pro pl 0 5 3* * P滯述的髦睜電礴離子交換箋析整仃質閘*白陽EC毘商館合.嚴睹Vv.-MJ :HPifIEX有以下三類：陰離子交換層析(填料帶正電荷，與帶負電的蛋白質相結合)；陽離子交換層析(填料帶負電，與帶正電的蛋白質相結合)。復合型離子交換(填料配基基團中帶有苯環，以離子交換作用為主，同時有一定 的疏水作用力)理論上來說，只要緩沖液pH值調節合適，所有的蛋白質都可以與陽離子交換柱和陰離子交換 柱結合。但是，蛋白質純化過

2、程中，選擇純化條件和層析柱類型時最重要的考慮因素就是要保持蛋 白質的穩定，性。因此，選擇哪一種離子交換層析和選擇什么樣的條件會影響蛋白質穩定性和活性是 必須要考量的。蛋白質與IEX的結合必須采用較寬pH值范圍的溶液進行多次嘗試以獲得最合適的蛋白質保留 pH值oIEX的固定相是由惰性瓊脂糖或者高分子基質與帶電基團共價結合組成。介質微粒有很多尺寸，可以無孔，也可以有多種不同尺寸的孔。介質的選擇主要根據所需的結合能力、分辨率和流速 要求來決定。介質顆粒尺寸越小，分辨率越高，但相應的流速也越低，分離時間也更長。多孔介質KMC 6FFWP-fiFFRjyW 比tt 爭.W-SfTll fISSP-AFF

3、 Ibl門閉r f俺主A-皇山4iiR擺油i：律犠咿平殛 /0L05I ffiStM * &25H 】. pH IT-fi4）i址硒I搏憂feCi, pH仃 歡屮抗転aK丄tal/mnEX中最常用的4種帶電官能團如下所示。它們根據離子交換能力的強弱分類，強離子交換基 團可離子化的pH范圍比弱離子交換基團的范圍更大。陰離子交換（固定相帶正電）：季錢（Q）強陰離子交換基團二乙氨乙基（DEAE） 弱陰離子交換基團陽離子交換（固定相帶負電）：磺酸甲酯（S） 強陽離子交換基團竣甲基（CM） 弱陽離子交換基團因為強離子交換基團的活性基團在很大的pH范圍內均可保持帶電，它可以在蛋白質結合所需pH值 是特別強

4、的酸性或堿性的情況下使用（假設該pH值下蛋白質穩定性仍得以保持）。有些蛋白質在弱離子交換上的保留較弱，使得它們可以用較低的離子強度洗脫。由于 高離子強度會影響部分蛋白質的穩定性，而弱離子交換不需要在極端的pH值條件下進行蛋白質的結合，因此可能對蛋白質更合適。離子交換色譜的固定相首先用低離子強度的緩沖液平衡，然后將蛋白質樣品用和平衡過程相同 離子強度的緩沖液上樣到固定相。結合的蛋白質在用更高離子強度或pH值不同的緩沖液洗脫前先淋洗一段時間。洗脫緩沖液中的抗衡離子與帶電的固定相相互作用，取代了柱上的蛋白質。在離子交換層析中，某些鹽類代替結合蛋白和保持蛋白質穩定性的能力，可能比 其他種類的鹽可能更有

5、效。NaCI或KCI是洗脫液中最常用的鹽類，其中Na+或K+是陽離子交換層析中的抗衡離子，CI是陰離子交換層析中的抗衡離子。另 一方面，還可以通過調節緩沖液的pH值來減少蛋白質的電荷并破壞其與固定相之間的相互作用。對于結合到陽離子交換固定相上的蛋白質，增加緩沖液pH值會使蛋白質所帶正電荷減少，因此可將其從柱上洗脫下來。對于結合到陰離子交換固定相上的蛋白 質，降低pH值可減少蛋白質所帶負電荷將其從柱上洗脫下來。同時，還可以調節緩沖液的pH值使目標蛋白質不與離子交換固定相相結合，而與此同時雜蛋 白與固定相結合。如此，可在穿透液中收集目標蛋白質，而雜蛋白通過與固定相結合得以去除。與 其他層析方法相比

6、，離子交換層析在確定蛋白質結合、洗脫和獲得足夠高的分辨率的最佳條件時可 能需要解決更多的問題。離子交換層析純化蛋白質工藝開發過程層析填料一一吸附層析工藝幵發運用DOE實豔設計法快速鳥逸歸選:快建祎選野合適的繞合填科嘴罡制步的結合雜件中試跤大闔定因素：填料里號 吁呂戎蠱肚屮過擰線 葉建大氐素：條容DOE 冋吹梓綁席蠟合載亞等層析填料一一吸附層析過程填料裝壌及測甘致洗棹課存蔽去熱原轟裝柱和課先用純水或者低濃度緩鄧謹即 可也可在裝柱麗潭冼后再脫氣裝柱DO曲竽I維持良好的皓合條供株品卻料味搔煥并箱臺洗出對慶未皓舍養物待將單杭從柱底：法辰卞來恢卻康有功龜淮掉柱床中再生液 使用蕓獨水Y：純度.收率,處理渭

7、莓用W MaOH.保 iA20*Z,fl|/10mM MEOHJ 四玉出醇*氓穿擺式洗脫時可不用拉梯度大多數蛋白可依據pl快速選擇離子交換填料緩沖液pH目的蛋白pl 0.5-3個單位選擇弱陰離子交換填料(DEAE)緩沖液pH目的蛋白pl 3個蛋白以上選擇強陰離子交換填料(Q)緩沖液pHW目的蛋白pl 0.5-3個單位選擇弱陽離子交換填料(CM)緩沖液pHW目的蛋白pl 3個單位以上選擇強陽離子交換填料(SP)緩沖液中含有較高離子強度時選擇復合型離子交換填料(MMC/MMA)根據pl選擇只能做為參考，不能完全依據pl選擇，因為蛋白是局部電荷和離子交換填料以靜電力的形式結合。根據離子交換填料的粒徑分布選擇，原則上粒徑越小分辨率越高。快速捕獲選擇流速大的(BB 165-300um)初步純化選擇粒徑適中的(FF45-165