1、方法學(xué)驗(yàn)證方法內(nèi)容提要：（方法學(xué)驗(yàn)證的應(yīng)用、依據(jù)、類型、一般參數(shù)、要求）驗(yàn)證應(yīng)用：方法驗(yàn)證是對測定方法的評價，是建立新方法的研究內(nèi)容和依據(jù)。（新建方法、已建立方法的修訂驗(yàn)證、已建方法的復(fù)現(xiàn)）驗(yàn)證依據(jù)：方法應(yīng)用領(lǐng)域?qū)Ψ椒?yàn)證要求的“指導(dǎo)原則”驗(yàn)證類型：全部驗(yàn)證 Fall validation、部分驗(yàn)證 Partial validation、交叉驗(yàn)證 cross validationFull validation：第一次新建方法；一個已建方法，但增加分析對象（精密、回收）。Partial validation： （已建方法的部分改變）1）分析方法改變（檢測器改變）；2）生物樣品（抗凝劑改變）；3）

2、基質(zhì)改變（血一尿）；4）前處理方法改變；5）生物樣品種屬改變（rat大鼠一mouse小鼠）；6）儀器改變工作軟件改變；7）稀有生物樣品，取樣量有限。Cross validation :樣品分析在不同場所或?qū)嶒?yàn)室進(jìn)行時，不同實(shí)驗(yàn)室需進(jìn)行加樣生物樣品或 實(shí)際樣品分析，建立實(shí)驗(yàn)室間的重現(xiàn)性數(shù)據(jù)。當(dāng)分析數(shù)據(jù)由不同檢測技術(shù)產(chǎn)生時LC-MS vs ELSD需交叉驗(yàn)證部分驗(yàn)證：準(zhǔn)確度，精密度（都做）交叉驗(yàn)證：加樣準(zhǔn)確度，實(shí)際樣品分析（任一）一般參數(shù)：精密度 precision:同一勻質(zhì)樣品的一組測量值，彼此符合的程度。1）SD 標(biāo)準(zhǔn)偏差 standard deviation2）%RSD相對標(biāo)準(zhǔn)偏差relat

3、ive SD，CV變異系數(shù)n8標(biāo)準(zhǔn)差SD=開方（求和（xi-x均值）/ （n-1）% RSD = SD/x 均值 X100 %日內(nèi)精密度（intraday precision）:同一次測定，710份，按方法做。測定，SD值，RSD 限度（生物制品5%，藥品2%）。日間精密度（interday precision）:不同一次測定，710份，按方法做。測定，SD值，RSD 限度（生物制品15%，藥品5%）。準(zhǔn)確性 accuracy：結(jié)果與真值的接近程度，表示分析方法測定的正確性，通常用回收率實(shí)驗(yàn)表示（加樣回收率）。 回收率=(測定液測定值一原樣液含測值)/加入量值X100% 靈敏度：檢測限(lim

4、it of detection LOD)：分析方法能從背景信號中區(qū)分出藥物，所需樣品中藥物 的最低濃度,LOD反映方法與儀器的靈敏度和噪音也表明樣品經(jīng)處理后本底值的高低S/N3定量限(limit of quantitation LOQ)在保證具有一定可靠性(一定準(zhǔn)確度和精密度)分析方 法能夠測定出樣品中藥物的最低濃度。反映分析方法測定含藥物的低濃度樣品時的可靠性。選擇性(selectivity )：分析方法從其他成分中區(qū)分并定量目標(biāo)成分的能力專屬性(specificity):指一種方法僅對一種分析成分產(chǎn)生唯一信號選擇性(selectivity):指一種方法可對多種成分產(chǎn)生不同響應(yīng)，主要成分響應(yīng)

5、可與其他成 分區(qū)分選擇性的區(qū)分選擇內(nèi)容：化藥：雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、相關(guān)化合物、制劑輔料(可通過空白比較和添加法所得分析結(jié) 果比較確定)體內(nèi)藥物：內(nèi)源性物質(zhì)、代謝物、分解產(chǎn)物、分析中的相伴物、內(nèi)源性代謝物體內(nèi)藥分的選擇性內(nèi)容：空白生物樣品(血尿、膽汁等)、至少六個來源的生物樣品(非 MS方法)、每個空白樣品均測定干擾和LOQ。線性(liner )：給定范圍內(nèi)獲取與樣品中供試物濃度成正比的試驗(yàn)結(jié)果的能力線性范圍是指利用一種方法取得精密度、準(zhǔn)確度均符合要求的試驗(yàn)結(jié)果，而且呈線性的供試 物濃度的變化范圍其最大、最小量間的間隔。濃度范圍包括5-8個濃度點(diǎn)，標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)覆蓋樣品濃度范圍。藥物一般80-120%

6、(但低限不低于LOQ)體內(nèi)藥物、濃度上線高于樣品最高濃度，下限為LOQ相關(guān)系數(shù)(r)表示了線性度r沱0.9900重現(xiàn)性(Repeatibility)相同方法在正常條件下多次重復(fù)測定同一勻質(zhì)樣品所得分析結(jié)果的重現(xiàn)程度。穩(wěn)定性(Stability)生物樣品中藥物的穩(wěn)定性涉及儲存條件、藥物理化性質(zhì)、基質(zhì)、容器系統(tǒng)。Stability評價包括：樣品收集與前處理、短期儲存、長期儲存、凍融、處理后穩(wěn)定性。穩(wěn)定性試驗(yàn)要求Stability考察條件應(yīng)反映實(shí)際測定過程的實(shí)驗(yàn)條件。應(yīng)包括Stocking solution穩(wěn)定性的考察凍融穩(wěn)定性至少高、中、低三個濃度、三個凍融過程在真實(shí)實(shí)驗(yàn)條件下保存樣品，室溫化 凍

7、，至少保存24小時，第二、三次相同條件下至少保存12-24小時，在第三個circle時分析。如果樣品不穩(wěn)定，應(yīng)在-70C下保存短期穩(wěn)定性：樣品化凍后室溫4-24小時考察穩(wěn)定性長期穩(wěn)定性：應(yīng)包括第一樣品一 最后樣品分析結(jié)束的全過程(三個濃度、足夠樣品)處理后穩(wěn)定性 分析過程一個方法經(jīng)建立、驗(yàn)證、正常應(yīng)用后進(jìn)行分析。分析包括：標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、分析法與過程建立、驗(yàn)證后方法應(yīng)用與建立分析結(jié)果認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)。藥物定量方法：LC、GC、生化免疫、同位素標(biāo)示。驗(yàn)證要求：標(biāo)準(zhǔn)曲線至少6個點(diǎn)，包括LLOQ （標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度）、ULOQ （最高濃度）Upper limit of quantification精密度precision和準(zhǔn)確度accuracy:三個濃度，每個濃度進(jìn)樣5次，測定與理論差W 15%、LLOQ 外 W20%。三個濃度的分布要求：lowQC sample=3*LLOQ middleQC=中間 點(diǎn)highQC接近曲線最高點(diǎn)穩(wěn)定性：2個濃度的三次凍融（每個2次？）生物樣品的室溫穩(wěn)定性、處理后的穩(wěn)定性。分析數(shù)據(jù)的可接受標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)曲線除LLOQ, CV在15%以內(nèi)QCsample在分析過程中合理分布QCsample 至少 67%- 15%可接受每樣品周期中QC樣品至少5%中藥指紋圖譜方法驗(yàn)