1、PAGE 12 -復合改性小米淀粉Pickering乳液負載-胡蘿卜素性能研究Pickering乳液由于具有高度環境相容性、穩定性、控制釋放、抗聚集和脂質氧化等優勢，在食品、藥品及功能物質遞送體系被廣泛應用，成為當前食品膠體領域的研究熱點和挑戰1-3。植物化學成分-胡蘿卜素(-carotene，BC)、維生素E、維生素A、姜黃素、白藜蘆醇、花青素等在健康食品工業中具有非常重要的作用，但由于植物提取物大都容易受到空氣、溫度、光、pH值等的影響，而存在揮發性高、穩定性差、水中溶解性低等缺點，使其應用受到限制4-6。包埋可將生物活性物質包覆到具有保護作用的壁材中，有助于活性物質的延長釋放、穩定性提高

2、、保護或改善生物活性7-8。MAREFATI等9利用疏水改性藜麥淀粉穩定的Pickering乳狀液能以較高的包封率(80%)包封姜黃素。ABBAS等10利用超聲輔助制備單一改性辛烯基琥珀酸(octenylsuccinicacid，OSA)淀粉穩定納米乳液，并將其用于姜黃素的荷載，發現超聲輔助處理有利于姜黃素的穩定。陳金鳳等11研究了玉米淀粉納米顆粒穩定的Pickering乳液對活性成分的負載，制備得到BC荷載率穩定在45.17%的乳液。錢鑫12以-聚賴氨酸與淀粉納米晶復配作為固體乳化劑成功制備了包埋輔酶Q10的Pickering乳液。MARKU等13制備高含油量的淀粉基Pickering乳液，

3、并將其用于水楊酸甲酯的運載。Pickering乳液在封裝生物活性分子，提高活性物質穩定性和生物利用度方面具有巨大的潛力。本文采用OSA疏水改性協同球磨處理制備復合改性小米淀粉，以其為顆粒乳化劑構建負載BC的Pickering乳液，研究負載BC的Pickering乳液的鹽離子穩定性、pH穩定性、溫度及光照穩定性，并通過貯存實驗、被動釋放、體外模擬消化實驗研究BC在乳液中的負載率和保留率。1材料與方法1.1材料與試劑BC，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；透析袋(3500Da)、胃蛋白酶、脂肪酶、膽鹽、磷酸鹽緩沖液(pH7.0)，上海源葉生物科技股份有限公司；氫氧化鈉、鹽酸，國藥集團化學試劑有限公司

4、。1.2儀器與設備Malvern3000激光粒度儀，英國MALWERN公司；DS-Fi2多功能生物顯微鏡，日本Nikon儀器有限公司；BSG-250型光照培養箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；IKAT18高速分散機，德國IKA儀器設備有限公司。1.3實驗方法1.3.1復合改性小米淀粉的制備以小米淀粉為原料，參考MAREFATI等9的方法制備OSA小米淀粉(OSAmilletstarch，OSS)，測定取代度為0.0218。取5.0gOSA小米淀粉和25mL蒸餾水于球磨罐中，球磨轉速400r/min，鋼珠150g，溫度2532，球磨處理2h。球磨完畢后樣品于4000r/min離心15min，冷

5、凍干燥24h，過100目篩即得復合改性小米淀粉(ball-milledcompoundmodifiedmilletstarch，BMS)。1.3.2負載BC的Pickering乳液的制備將BC以1mg/mL的質量濃度添加到油相中鏈甘油三酯(mediumchaintriglycerides，MCT)中磁力攪拌過夜，以保證BC在油中進行最大程度溶解，將混合物以14000r/min離心10min去除未溶解的不溶物。通過紫外可見分光光度法測量油相中的BC濃度。將合適比例的溶有BC的油相和改性淀粉水溶液的水相進行混合，渦旋攪拌30s至混合均勻，室溫條件下，用高速剪切均質機以20000r/min的轉速，乳

6、化2min(分4次進行，每次處理30s，間隔60s)，制備負載BC的Pickering乳液。1.3.3BC的含量測定標準曲線的繪制：稱取10mgBC，用氯仿定容至100mL，得標準溶液(0.1mg/mL)。吸取標準溶液0.5、1、1.5、2、2.5、3mL分別置于50mL容量瓶中，用氯仿定容，得1、2、3、4、5、6g/mL的系列標準溶液，以氯仿做空白，在466nm測吸光值A，以為橫坐標，A為縱坐標，得標準曲線。油相中BC含量測定：通過向100mL氯仿中添加1mL的油相，使用分光光度計在466nm下測定吸光度，計算BC在MCT中的初始濃度。乳液中BC含量測定：取200L乳液樣品加入1.6mL氯

7、仿溶劑使用渦旋儀渦旋5min，使活性成分被充分萃取。混合物以14000r/min離心10min以去除淀粉顆粒，取1mL上清液稀釋至10mL，以氯仿為空白，測定466nm處吸光度，使用標準曲線將吸光度測量值轉換為BC的濃度。BC的負載率計算如公式(1)所示：BC負載率(1)1.3.4Pickering乳液的穩定性分析(1)鹽離子穩定性：通過在制備后向乳液中加入不同體積的NaCl來檢查鹽離子對乳液穩定性的影響，乳液中NaCl濃度依次設置為0、50、100、150、200mmol/L，分別在貯存1、24h觀察乳液外觀和顯微結構，測定乳液粒徑及電位的變化。(2)pH穩定性：通過調節乳液pH值來檢查pH

8、對乳液穩定性的影響，乳液pH依次設置為2、4、6、8、10，分別在貯存1、24h觀察乳液外觀和顯微結構，測定乳液粒徑及電位的變化。(3)溫度及光照穩定性：將乳液在4、25、37、60避光以及25光照條件下貯存，期間分別測定多次乳液的粒徑及乳液中BC含量。1.3.5Pickering乳液的粒徑及電位測定乳液的粒徑大小通過馬爾文3000激光粒度儀測量，電位通過馬爾文Nanozs90Zeta電位儀測量，粒徑分布以及Zeta電位分別測量3次。1.3.6Pickering乳液的顯微結構觀察將乳液滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，用DS-Fi2多功能生物顯微鏡觀測乳液，在放大100倍數下拍照。1.3.7BC在乳液

9、中的釋放在透析袋(3500Da)中加入10mLPickering乳液，將該透析袋懸浮在1L蒸餾水中，25下進行透析釋放。每間隔6h從按照1.3.3建立的方法測量1次乳液中BC的濃度。每次測量后，透析過程中的水需要重新更換。1.3.8體外模擬胃腸消化模擬胃液(simulatedgastricfluid，SGF)的配制：2mg/mLNaCl、7mL/LHCl、3.2mg/mL胃蛋白酶，所有組分用超純水配制。模擬腸液(simulatedintestinalfluid，SIF)的配制：鹽溶液(36.7mg/mLCaCl2、218.7mg/mLNaCl，下同)、24mg/mL脂肪酶(下同)、54mg/m

10、L膽鹽(下同)、其中鹽溶液用超純水配制，脂肪酶和膽鹽用5mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0)配制。模擬SGF消化：取7.5mLSGF于37保溫5min，加入相同體積的乳液，調整體系pH至2.5，于37、100r/min恒溫搖床消化2h。期間每30min對乳液進行取樣(200L)，并使用前述方法測量乳液中的BC濃度。模擬SIF消化：將37預熱好的1.5mL鹽溶液、3.5mL膽鹽溶液和2.5mL脂肪酶液加入到pH調整為7.0的SGF消化液中，在37、100r/min消化2h，期間用0.1mol/LNaOH維持消化體系pH為7.0。每30min對乳液進行取樣(200L)，并使用前述方法測量乳液中的

11、BC濃度9,15。1.3.9數據分析采用Excel2022、SPSS22對數據進行統計及處理，采用OriginPro9.0繪制圖，圖表中誤差均為標準誤差，所有實驗均進行3次重復實驗。2結果與分析2.1Pickering乳液的光學顯微結構BMS和OSS穩定的負載及未負載BC的Pickering乳液的微觀結構如圖1所示，乳液液滴外觀均呈現球形，在負載BC之后呈現出黃色。OSS穩定的乳液液滴大小不一，且在負載BC之后乳液液滴明顯增大，說明OSS的乳化能力不足，在負載BC后存在一定程度的破乳現象。BMS穩定的乳液液滴粒徑較小且大小分布均一，負載BC之后液滴仍保持較為均勻的大小分布。球磨處理使OSA淀粉

12、的乳化能力得到改善，且乳液界面結構穩定，在BC的負載能力上表現出更為優良的特性16。這可能得益于球磨使OSA淀粉糊化，改變了淀粉形態結構及柔韌性，更有利于界面覆蓋和構象變化以形成致密的界面網絡結構，增強靜電和空間排斥的穩定性，從而表現出更加優良的乳化性和界面吸附性16-17。A-BMS穩定的負載BC的Pickering乳液；B-OSS穩定的負載BC的Pickering乳液；C-BMS穩定的未負載BC的Pickering乳液；D-OSS穩定的未負載BC的Pickering乳液圖1不同顆粒穩定的乳液光學顯微鏡圖Fig.1Opticalmicroscopeimageofemulsionsstabil

13、izedbydifferentparticles2.2負載BC的Pickering乳液的穩定性分析2.2.1pH穩定性不同pH條件下乳液的粒徑及電位如圖2所示。乳液在不同pH環境下無相分離現象，pH2的乳液粒徑為38.9m，隨pH增大，粒徑急劇減小，并在pH410基本維持穩定。BMS顆粒與阿拉伯膠、環糊精、纖維素等生物高聚物穩定的Pickering乳液的pH穩定性具有相似的結果18-19。不同pH的乳液在放置24h后粒徑僅出現較小程度變化，表明乳液在不同pH環境下均具有較好的貯存穩定性。不同乳液的電位值均為負值，因為BMS顆粒上的羧基帶負電荷。pH26，電位隨pH的增大而顯著減小，可能是由于B

14、MS在堿性條件下制備，淀粉顆粒表面連接了羧基而帶有負電荷，pH在26變化，BMS顆粒表面的羧基基團發生去質子化，增加了油水界面的負電荷數，表現出更低的電位值20。A-粒徑；B-電位圖2不同pH對乳液粒徑及電位的影響Fig.2EffectofdifferentpHonemulsionparticlesizeandpotential由圖3乳液的光學顯微鏡圖可以看出，pH2時，乳液中出現了數量較多的大液滴，這可能來源于該pH值下乳液負電荷數最少，影響了BMS顆粒的疏水性，導致其在油水界面的靜電相互作用降低，表現出乳液穩定性不足，油滴之間發生聚結形成緊密堆積的聚合物，乳液粒徑尺寸相對更大21。pH41

15、0，體系負電荷數明顯增多，導致它們之間更強的靜電排斥，顆粒更容易吸附到油水界面而增加乳液的穩定性，從而表現出分布更加均一的乳液光學顯微結構和良好的聚集穩定性2。A-pH2；B-pH4；C-pH6；D-pH8；E-pH10圖3pH對乳液光學顯微結構及粒徑分布的影響Fig.3EffectofpHontheopticalmicrostructureandparticlesizedistributionofemulsion2.2.2鹽離子穩定性遞送體系可用于不同水平鹽濃度的商業產品，因此對乳液的鹽離子穩定性進行表征具有重要的實際意義。圖4顯示了乳液粒徑及電位的變化，當不存在鹽離子時，乳液粒徑為29.1

16、m，隨鹽離子濃度增大，粒徑僅呈現出較小幅度的增大，表明了乳液具備高度的鹽離子穩定性。乳液的光學顯微結構如圖5所示，在較高濃度鹽離子的存在下乳液液滴之間出現了一定程度的聚集，表現為乳液粒徑的增大。乳液在24h后粒徑均較1h時表現出一定程度的增大，這表明在油相比例為30%時，乳液中存在較多的水相，使得乳液液滴之間相互碰撞的概率較大，在短時間內表現出粒徑的增大。隨鹽離子的加入乳液電位呈現增大的趨勢，這表明乳液體系負電荷數顯著下降，放置不同時間后電位值基本保持不變，電位增大可能是鹽離子對淀粉酯表面的負電荷產生了靜電屏蔽。乳液在鹽離子存在下出現了輕微的析水現象，可能與電位的變化有關，Na+和帶負電的CO

17、O-互相吸引，使得凈電荷降低，乳液的穩定狀態發生了改變，從而出現分層22。A-粒徑；B-電位圖4鹽離子濃度對乳液粒徑及電位的影響Fig.4Influenceofsaltionconcentrationonemulsionparticlesizeandpotential2.2.3貯藏穩定性不同貯存溫度和光照條件下Pickering乳液在15d內粒徑的變化，如圖6所示。貯存在437避光條件下，各組乳液在放置后粒徑僅呈現較小程度的波動。60避光條件下乳液粒徑在7d內急劇增大，表明負載BCPickering乳液在37以內具有較高的溫度穩定性，而溫度繼續升高至60，BMS喪失維持界面穩定的作用。E組25

18、光照和B組25避光貯存，乳液在粒徑上未呈現明顯的差異，說明貯存的光照環境對乳液的粒徑影響不大。對照組F代表的OSS穩定的負載BCPickering乳液，初始粒徑93.7m，在貯存后15d后粒徑增大到206.0m，說明單一改性的淀粉顆粒穩定的乳液在荷載BC后貯存過程中容易發生聚集、絮凝等現象，相比BMS而言不具備優良的貯存穩定性。A-鹽離子濃度0mmol/L；B-鹽離子濃度50mmol/L；C-鹽離子濃度100mmol/L；D-鹽離子濃度150mmol/L；E-鹽離子濃度220mmol/L圖5鹽離子濃度對乳液光學顯微結構及粒徑分布的影響Fig.5Influenceofsaltionconcent

19、rationontheopticalmicrostructureandparticlesizedistributionofemulsion2.3BC在Pickering中的穩定性乳液在不同條件貯存后BC負載率的變化如圖7所示，BC在BMS和OSS穩定的Pickering乳液中的初始負載率分別為92.92%和82.44%，且各組乳液隨放置時間的延長，BC負載率均發生了不同程度的下降。60避光貯存24h，BC負載率急劇降低到36.72%，降解率達到50%(半衰期)以上。避光環境下4、25、37貯存15d后BC負載率71.71%(4避光)62.60%(25避光)51.97%(37避光)，說明低溫環境

20、更有利于BC的活性保留。貯存相同時間，光照環境下BC的負載率始終低于避光環境下的負載率。在25光照環境下貯存，OSS穩定的Pickering乳液15d后BC降解率達72%，表明OSS僅對BC的降解起到輕微的保護作用。而BMS穩定的Pickering乳液相同貯存條件下BC降解率僅23%，保留率提升了約49%。A-負載BC的BMS穩定Pickering乳液4避光貯存；B-負載BC的BMS穩定Pickering乳液25避光貯存；C-負載BC的BMS穩定Pickering乳液37避光貯存；D-負載BC的BMS穩定Pickering乳液60避光貯存；E-負載BC的BMS穩定Pickering乳液25光照

21、貯存；F-負載BC的OSS穩定Pickering乳液25光照貯存圖6負載BCPickering乳液的粒徑Fig.6ParticlesizeofPickeringemulsionloadedwith-carotene圖7不同貯存條件下乳液中BC的含量變化Fig.7Changesof-carotenecontentinemulsionunderdifferentstorageconditions綜上所述，高溫和光照環境對乳液BC的荷載是不利的，BMS表現出較為優良的負載BC的性能，其原理可能是由于BMS可在油滴外部形成更加致密和更厚的界面層，對氧、促氧化劑、自由基等的擴散提供了空間屏蔽作用，在提升

22、乳液貯存穩定性的同時，減緩活性物質發生降解7,23。2.4Pickering乳液中BC的釋放圖8顯示了Pickering乳液在過量水透析過程中BC隨時間變化的累計釋放。在最初的12h內，BMS穩定的乳液中BC釋放量為16.07%，累計釋放長達80h后，約42.53%的BC從乳液中釋放。作為對照組的OSS穩定的Pickering乳液中，BC不同時間釋放量均顯著高于BMS，說明BMSPickering乳液相較單一改性OSA淀粉Pickering乳液而言，可有效減緩BC釋放速率。圖8Pickering乳液中BC的釋放Fig.8Releaseof-caroteneinPickeringemulsion

23、不同的包封系統對活性物質的封裝效果存在差異，因此也會表現出不同的活性物質釋放速率。王麒15的研究中以糖基化蛋白-多酚納米復合物穩定Pickering乳液包埋BC和姜黃素，在54h內2種活性物質釋放量分別達40%和46%。SHMARAKOV等23的研究中顯示，約50%姜黃素在8h內快速地從二氧化硅納米顆粒Pickering乳液中釋放，36h后釋放量超過80%。綜上，將BMS穩定的Pickering乳液與其他包封系統相比，在負載活性物質、降低活性物質釋放速率方面有較為優良的潛力。2.5模擬體外胃腸消化BC由于其抗氧化活性，在降低患癌癥和心臟病的風險方面發揮著重要作用23-24。由于BC的水溶性有限

24、、化學不穩定性和在人體內的生物利用度低，因此將其納入商業食品中存在一些挑戰7。為了克服這些缺陷，已經開發了多種類型的遞送系統，研究表明當膳食類胡蘿卜素與脂質一起食用或與脂質賦形劑共同攝入時，可以增強對其吸收25-26。因此，確定BC包封對其在模擬消化期間的穩定性和保留率是重要的。表1顯示了乳液在模擬消化過程中粒徑的變化，乳液初始D4,3和D3,2分別為29.0和19.3m，在經過SGF后粒徑略微增大，這是由于SGF過程中，較低的pH值和高離子強度導致乳液液滴出現了一定程度的絮凝和聚合等失穩現象。SIF是油脂和淀粉消化的主要場所，也是脂溶性功能因子被吸收利用的場所27，乳液經SIF后粒徑顯著減小。乳液在消化過程中，BC從乳液中釋放并與消化液中的膽鹽、游離脂肪酸和甘油單酯等自組裝形成混合膠束或囊泡，繼而被小腸上皮細胞吸收轉運15,28。圖9顯示了BC在SGF和SIF中的釋放