1、關于酶工程酶分子定向進化第一張，PPT共七十三頁，創作于2022年6月酶分子定向進化 酶分子定向進化又稱為酶分子體外進化，屬于蛋白質的非理性設計，是蛋白質工程的新策略，是在試管中模擬達爾文進化的過程，利用分子生物學手段在分子水平創造分子的多樣性，結合靈敏的篩選技術，迅速得到理想的突變體。與傳統的理性設計相比，它不需事先了解蛋白質的空間結構、活性位點、催化機制等因素，而是人為地創造特殊的進化條件，模擬自然進化機制（隨機突變、基因重組和自然選擇），在體外改造酶基因，產生基因多樣性，并結合定向篩選（或選擇）技術，獲得具有某些預期特征的改構酶。 第二張，PPT共七十三頁，創作于2022年6月 生物的自

2、然進化進化過程： 突變自然選擇遺傳后代進化結果： 基因多樣性：為完成同一功能所表現出的 多個 基因或同一個基因(同源性) 代謝途徑的多樣性：同樣產物，多條途徑 代謝產物的多樣性：同一底物，不同產物 生物多樣性：整個生態系統中的生物第三張，PPT共七十三頁，創作于2022年6月酶的定向進化酶分子的合理設計(rational design)酶分子的定向進化(directed evolution)第四張，PPT共七十三頁，創作于2022年6月酶的合理設計第五張，PPT共七十三頁，創作于2022年6月體外定向進化的意義理論上，蛋白質分子蘊藏著很大的進化潛力，很多功能有待于開發，這是酶的體外定向進化的基

3、本先決條件。所謂酶的體外定向進化，又稱實驗分子進化，屬于蛋白質的非合理設計，它不需事先了解酶的空間結構和催化機制，通過人為地創造特殊的條件，模擬自然進化機制(隨機突變、重組和自然選擇)，在體外改造酶基因，并定向選擇出所需性質的突變酶。酶的體外定向進化技術極大地拓展了蛋白質工程學的研究和應用范圍，特別是能夠解決合理設計所不能解決的問題，為酶的結構與功能研究開辟了嶄新的途徑，并且正在工業、農業和醫藥等領域逐漸顯示其生命力。第六張，PPT共七十三頁，創作于2022年6月定向進化的原理在待進化酶基因的PCR擴增反應中，利用Taq DNA聚合酶不具有3-5校對功能的性質，配合適當條件，以很低的比率向目的

4、基因中隨機引入突變，構建突變庫，憑借定向的選擇方法，選出所需性質的優化酶(或蛋白質)，從而排除其他突變體。定向進化的基本規則是“獲取你所篩選的突變體”。定向進化=隨機突變+選擇。前者是人為引發的，后者雖相當于環境，但只作用于突變后的分子群，起著選擇某一方向的進化而排除其他方向突變的作用，整個進化過程完全是在人為控制下進行的第七張，PPT共七十三頁，創作于2022年6月DNA改組和外顯子改組DNA改組（DNA shuffling）又稱有性PCR(sexual PCR)，原理。 該策略的目的是創造將親本基因群中的突變盡可能組合的機會，導致更大的變異，最終獲取最佳突變組合的酶。通過DNA改組, 不僅

5、可加速積累有益突變，而且可使酶的2個或更多的已優化性質合為一體。外顯子改組（exon shuffling）類似于DNA改組，兩者都是在各自含突變的片段間進行交換，前者尤其適用于真核生物。在自然界中，不同分子的內含子間發生同源重組，導致不同外顯子的結合，是產生新蛋白質的有效途徑之一。與DNA改組不同，外顯子改組是靠同一種分子間內含子的同源性帶動，而DNA改組不受任何限制，發生在整個基因片段上。第八張，PPT共七十三頁，創作于2022年6月定向進化的選擇策略1、定向進化中，突變具有隨機性，但通過選擇特定方向的突變限定了進化趨勢，加之控制實驗條件，限定突變種類， 降低突變率，縮小突變庫的容量，這不僅

6、減少了工作量，更重要的是加快了酶在某一方向的進化速度。2、通常,篩選方法必須靈敏,至少與目的性質相關。另有一些其他的篩選方法，如加入能產生可見光信號的底物或利用綠色熒光蛋白的熒光性質等。高通量的篩選體系第九張，PPT共七十三頁，創作于2022年6月酶性質突變方法枯草桿菌蛋白酶E有機相活性/穩定性易錯PCR-內酰胺酶總活力/底物專一性DNA改組枯草桿菌蛋白酶BPN穩定性 盒式誘變對硝基苯酯酶底物專一性/有機相活性易錯PCR/DNA改組 胸腺嘧啶核苷激酶底物專一性盒式誘變-半乳糖苷酶底物專一性DNA改組綠色熒光蛋白熒光DNA改組核酶底物專一性易錯PCR/DNA改組天冬氨酸酶活性與穩定性隨機/定位誘

7、變藥物和疫苗活性/專一性/最佳表達DNA改組酶的體外定向進化應用實例回本章目錄第十張，PPT共七十三頁，創作于2022年6月分子進化工程的種類第十一張，PPT共七十三頁，創作于2022年6月人工獲取新基因的方法常規的基因工程方法 生物功能 蛋白質 基因新基因的理性設計和人工合成 根據已有基因的序列和功能進行設計基因的直接進化（directed evolution) 可使已有基因獲得新的特性 可獲得自然界中不存在的基因 可解決許多新的理論和應用問題第十二張，PPT共七十三頁，創作于2022年6月基因直接進化的用途提高酶活性天門冬氨酸氨基轉移酶活性提高30倍改變底物特異性和對映異構體選擇性 酯酶可

8、水解非天然酯類改善酶的工藝性冷適應和熱適應酶改變酶的拓撲結構二體酶變為單體酶獲取許多新的理論知識第十三張，PPT共七十三頁，創作于2022年6月基因直接進化的用途提改變酶的特性-多功能或單功能酶高酶活性-天門冬氨酸氨基轉移酶活性提高30倍改變底物特異性和對映異構體選擇性-酯酶可水解非天然酯類改變酶的工藝性-冷適應和熱適應酶改善酶的穩定性-二體酶變為單體酶或單體酶變為二體酶獲取許多新的理論知識第十四張，PPT共七十三頁，創作于2022年6月TLPs 的失活曲線第十五張，PPT共七十三頁，創作于2022年6月TLP-ste突變蛋白的三維結構第十六張，PPT共七十三頁，創作于2022年6月酶拓撲結構

9、的變化第十七張，PPT共七十三頁，創作于2022年6月蛋白質的耐熱機制天然耐熱蛋白質特性： 減少內腔體積；引入鹽橋束；減少表面積/體積比；除去氧化還原活性基；埋藏暴露的疏水基；除去-支鏈氨基酸；除去能脫氨基的氨基酸。 所有耐熱蛋白質的氨基酸同源性低至36%，最高不超過75%。分子進化耐熱蛋白質特性： 鄰-硝基苯酯酶（p-nitrobenzyl esterase）突變體8g8的了穩定性提高了17C，但突變的氨基酸數僅有13個，與天然酯酶同源性高達97%。第十八張，PPT共七十三頁，創作于2022年6月基因直接進化的步驟突變 基因突變庫的建立篩選 基因突變庫的活體或離體篩選基因復制與遺傳第十九張，

10、PPT共七十三頁，創作于2022年6月建立基因突變庫的方法定向誘變： 點突變堿基刪除、增補和替換隨機誘變： 易錯PCR法(Error-prone PCR) 降低一種dNTP的量（降至5-10） 加入dITP來代替被減少的dNTP 緩沖液中另加0.5mmol/L Mn2+第二十張，PPT共七十三頁，創作于2022年6月第二十一張，PPT共七十三頁，創作于2022年6月易錯PCR 第二十二張，PPT共七十三頁，創作于2022年6月同序法（consensus approach）對一組同源蛋白質的氨基酸序列進行比較，以一定的標準程序計算出各氨基酸序列的共有序列；人工合成同序基因后重組表達。 Marti

11、n Lehmann等（20002002）把這種方法應用在真菌植酸酶家族設計合成了同序植酸酶基因，并表達出具熱穩定性的同序植酸酶。第二十三張，PPT共七十三頁，創作于2022年6月真菌植酸酶aa序列的同序比較 第二十四張，PPT共七十三頁，創作于2022年6月 同序植酸酶-1的最適溫度為71，而親代植酸酶的最適溫度為45-55，增加了16-26, 同序植酸酶-1Tm為78，比親代植酸酶增加了15-22，而催化性質與大多數親本植酸酶相似。 第二十五張，PPT共七十三頁，創作于2022年6月DNA Shuffling:外顯子、單基因和基因家族的重組裝隨機引物延伸法交錯延伸法隨機片段活體突變: 線狀基

12、因和隨機片段共轉化酵母細胞第二十六張，PPT共七十三頁，創作于2022年6月基因突變庫的篩選方法Screening the Library and Selecting the Right Clone 平板分析使抗生素失效的酶類(如頭孢菌素酶，b -乳糖酶）提高耐熱性易于觀察的菌落表型（如菌落顏色等）營養缺陷型的輔助篩選 第二十七張，PPT共七十三頁，創作于2022年6月噬菌體展示、細胞表面展示 根據所需要的特性，對經Shuffling后的DNA文庫在噬菌體或細菌細胞表面（細菌、纖毛蟲細胞表面）的表現特征進行篩選，獲得提高目的底物親和力的突變子。減少篩選工作量 突變文庫大的突變子庫小的突變子庫單

13、克隆第二十八張，PPT共七十三頁，創作于2022年6月噬菌體表面展示(phage surface display) 將外源基因或隨機序列的DNA分子群與噬菌體外殼蛋白基因相連接，使外源DNA所編碼的蛋白質以融合蛋白形式表達在噬菌體外殼表面的方法。易于用免疫反應或配體特異性結合等方法篩得目的克隆。 第二十九張，PPT共七十三頁，創作于2022年6月噬菌體展示篩選模式第三十張，PPT共七十三頁，創作于2022年6月DNA Shuffling技術DNA ShufflingDNA改組DNA洗牌DNA攪亂重排1994年，Stemmer等，用DNA Shuffling技術體外快速進化蛋白有性PCR法199

14、7年 ，France Aronld研究組將DNA Shuffling技術做了改進交錯延伸法第三十一張，PPT共七十三頁，創作于2022年6月What happens after DNA shuffling Generation of a large library of novel genes (chimeras) Selection for improved/desired bio-functions crossovers, deletions, insertions, inversions, point mutationsDarwinian EvolutionNatural selecti

15、on of existing mutationsDirected Evolution Targeted selection of created mutationsWhat is DNA shuffling?DNA Shuffling的內涵第三十二張，PPT共七十三頁，創作于2022年6月DNA Shuffling：指DNA分子的體外重組，是基因在分子水平上進行有性重組(Sexual Recombination)。通過改變單個基因(或基因家族，gene family)原有的核苷酸序列，創造新基因，并賦予表達產物以新功能。DNA Shuffling的內涵第三十三張，PPT共七十三頁，創作于202

16、2年6月項目進化速度進化對象進化周期影響對象突變效率常規定向進化緩慢進化整個基因組多年完整基因組高DNAShuffling快速進化特定基因/操縱子/病毒幾天部分基因組低DNA Shuffling與常規定向進化的比較第三十四張，PPT共七十三頁，創作于2022年6月How DNA shuffling works - 1How DNA shuffling is done in the tube Random fragmentation of a pool of related genes; Self-priming polymerase reaction and template switchin

17、g (causing crossovers); PCR amplification with primers of reassembled products 第三十五張，PPT共七十三頁，創作于2022年6月How DNA shuffling works - 2Similar mutants generated byerror-prone PCR, random and site-directed mutagenesis . . . . .Single gene shufflinglibrary of point mutantsFamily gene shufflinglibrary of c

18、himerasGenerating chimeras with crossovers of large blocks of sequences第三十六張，PPT共七十三頁，創作于2022年6月DNA 重組裝的過程第三十七張，PPT共七十三頁，創作于2022年6月隨機引物PCR和重組裝第三十八張，PPT共七十三頁，創作于2022年6月第三十九張，PPT共七十三頁，創作于2022年6月連續易錯PCR (sequential error prone PCR)策略即將一次PCR擴增得到的有用突變基因作為下一次PCR擴增的模板，連續反復地進行隨機誘變。 第四十張，PPT共七十三頁，創作于2022年6月易

19、錯PCR方法 第四十一張，PPT共七十三頁，創作于2022年6月交錯延伸PCR突變法第四十二張，PPT共七十三頁，創作于2022年6月磷脂酶熱穩定催化活性的分子進化（Jae Kwang Song等，2000）DNA Shuffling技術的應用第四十三張，PPT共七十三頁，創作于2022年6月枯草桿菌蛋白酶E熱穩定性的分子進化（Huimin Zhao等，1999）第四十四張，PPT共七十三頁，創作于2022年6月進化后的枯草桿菌蛋白酶E正面反面第四十五張，PPT共七十三頁，創作于2022年6月耐熱p-硝基苯酯酶的分子進化(Lori Giver等，1998）第四十六張，PPT共七十三頁，創作于2

20、022年6月-葡糖苷酶耐熱性的提高(Mara Jesu s Arrizubieta等，2000）第四十七張，PPT共七十三頁，創作于2022年6月部分DNA Shuffling技術的研究成果類 型示 例特 性活性增加倍數潛在應用領域蛋 白綠色熒光蛋白熒光強度45基礎研究重組蛋白RecA重組率100基礎研究抗 體人源抗體親和性400生物制藥酶天冬氨酸轉氨酶催化特異性10，000生物制藥 -內酰胺酶抗生素抗性32，000抗生素枯草桿菌蛋白酶E耐熱性65耐熱時間17200工業酶細胞因子人類干擾素抗病毒285，000基因治療腫瘤抑制因子P5337半衰期12基因治療代謝途徑砷酸鹽代謝途徑砷酸鹽解毒40生

21、物制藥汞代謝途徑汞解毒12生物制藥第四十八張，PPT共七十三頁，創作于2022年6月綠色熒光蛋白 （green fluorescence protein;GFP;green fluorescent protein ）從水母(Aequorea victoria)體內發現的發光蛋白。分子質量為26kDa，由238個氨基酸構成，第6567位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成發光團，是主要發光的位置。其發光團的形成不具物種專一性，發出熒光穩定，且不需依賴任何輔因子或其他基質而發光。綠色熒光蛋白基因轉化入宿主細胞后很穩定，對多數宿主的生理無影響，是常用的報道基因。 第四十九張，PPT共七十三頁，創作于

22、2022年6月 2008年諾貝爾化學獎得主2008年的諾貝爾化學獎授予了從事有關“綠色熒光蛋白質的發現,表達和發展”并取得重要成就的三位科學家:下村修、馬丁查爾菲和錢永健。 第五十張，PPT共七十三頁，創作于2022年6月熒光蛋白在三大領域“發光”目前，熒光蛋白在很多領域都發揮著重大作用，包括有毒物質檢測、神經生物分析及轉基因動物研究等。比如，可用熒光蛋白檢測水井中是否含有砷(俗稱砒霜)。砷中毒問題在東南亞地區較為嚴重，常使很多人集體中毒。研究人員已經研發出帶有熒光蛋白的抗砷性細菌，只要水中含有砷，細菌就會發出熒光并被儀器檢測到，提醒人們不要飲用。GFP還可用作檢測TNT(一種烈性炸藥)、重金

23、屬等。熒光蛋白在神經生理學上的應用也很受人關注，在它的幫助下，研究人員能看到以前所不能見的新世界，包括大腦神經細胞的發育過程和癌細胞的傳播方式等。熒光蛋白的另一種重要應用就是轉基因動物。近年來，美國、韓國、日本等國曾多次培養出“發光的動物”，我國也在去年12月首次培養出綠色熒光轉基因豬。轉基因動物是指，將一種動物基因在另一種動物體內表達的過程，在遺傳研究、器官移植、特種改良等領域具有重大意義。熒光蛋白由于結構簡單可作為“報告基因”(一種編碼可被檢測的蛋白質或酶的基因)，大大簡化了轉基因動物的培養過程。第五十一張，PPT共七十三頁，創作于2022年6月Random-priming recombi

24、nation(RPR)隨機引物重組法第五十二張，PPT共七十三頁，創作于2022年6月隨機挑取枯草桿菌蛋白酶RPR庫中10個克隆序列第五十三張，PPT共七十三頁，創作于2022年6月DNA重組裝原理圖(DNA shuffling)1. DNaseI產生隨機片段；2. 隨機片段變性；3. 隨機片段復性；4. 延伸 反復重復2-4步后，可獲得全長DNA片段 第五十四張，PPT共七十三頁，創作于2022年6月隨機挑取枯草桿菌蛋白酶DNA重組裝庫中10個克隆序列第五十五張，PPT共七十三頁，創作于2022年6月Table 1 Frequency of active clones obtained after DNA shuffling under different conditionsa As suggested in