1、益生菌的基礎乳酸菌的特征乳酸菌和健康益生菌的特點乳酸菌、腸道菌的分離乳酸菌種的鑒定菌種的保存瀬戸 泰幸雪印乳業(日本)技術研究所研究員（日本國際協力機構短期專家）酸奶的起源酸奶的歷史和家畜飼養一樣久遠牛公元前萬年地中海東部地區羊山羊公元前千年美索不達米亞北部公元前3000年的蘇美爾人的石版畫（美索不達米亞）酸牛奶是用牛奶和乳酸菌制作的乳蛋白質乳糖乳酸風味、芳香成分氨基酸乳酸菌乳酸菌的特征1.革蘭氏Gram染色2.過氧化氫酶Catalase3.氧的要求4.運動性5.芽孢陽性陰性不需要（兼性厭氧性）可是好氧培養也能發育。沒有不形成乳酸發酵分解葡萄糖、50%以上的變換成乳酸。乳的凝固酸牛奶的酸味革蘭

2、氏染色Gram染色結晶紫羅蘭色液（青紫） Crystal Violet路高爾氏液 Lugol甲醇脫色 Methanol藏紅液（紅） Safranin青紫色紅（革蘭氏陽性）（革蘭氏陰性）大腸菌E.coli嗜熱乳酸鏈球菌St. thermophilus乳酸菌的分類命名LactococcusStreptococcusLactobacillusLeuconostocPediococcusStreptococccus thermophilus （subsp.OOOO) SBTOOOO屬種（亞種）株學名代表的乳酸菌屬和對食品的應用干酪酸奶酸奶、泡菜干酪泡菜乳球菌屬鏈菌屬乳桿菌屬明串珠菌屬片球菌屬乳酸菌和健

3、康1Metinicof博士 (1845-1916) 的不老長壽說老化的原因是腸道菌的毒素嗎?常喝酸牛奶的保加利亞長壽人很多。為清除腸道有害菌、酸牛奶中活著的乳酸菌有效嗎? 我們知道保加利亞乳桿菌在腸道內是死絕的、Metinicof博士的學說被遺忘了。新生兒的糞便菌叢從出生到出生后第7天乳酸菌和健康3證明腸道乳酸菌及雙岐菌守衛人類的健康雙歧桿菌大腸菌葡萄球菌乳酸桿菌Clostridium梭狀芽孢桿菌益生菌的想法Fuller博士（1989）ProbioticsAntibiotics（抗菌素）用有益菌抑制有害菌。予防醫學的用藥劑有益菌和有害菌都殺死了。治療醫學的關注著存在于腸道內的乳酸菌及雙岐菌。改

4、善腸道的細菌比例、給與人體有益的影響人類能夠食用的、活著的微生物。代表的益生菌- 1Lactobacillus gasseri 腸道乳桿菌Lactobacillus屬gasseri, acidophilus, casei,reuteri, johnsonii主要在小腸內使奶發酵的能力弱需要促進發酵的酵母精等與普通的乳酸菌相比、（L.bulgaricus S.thermophilus）風味不好的很多3210101010101010456789181260101010101010456789嗜酸乳桿菌雙岐桿菌保加利亞乳桿菌嗜熱乳酸鏈球菌嗜酸乳桿菌雙岐桿菌活著到達腸道人工胃液耐性試驗（鹽酸）胃蛋白酶

5、處理人工腸液耐性試驗膽汁酸、胰蛋白酶處理活菌數活菌數処理時間（）処理時間（）益生菌的特點乳酸菌的分離出售的凍干菌（粉末）優點:輕便、安全、放心缺點:價格高、無個性、新產品開發難獨自菌株的分離 具有個性、能制作出多樣的產品、通過研究能找到獨特的生理效果有必要繼代培養。需要菌的培養技術。乳酸菌的分離源從發酵食品等、能分離出多樣的乳菌。牛奶泡菜面包起子糞便Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis, Lactobacillus bulgaricusLactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis, Leuco

6、nostoc mesenteroidesLactobacillus sanfranciscoLactobacillus acidophilus, Bifidobacterium longumEnterococcus faecalis, 腸道菌分離的問題點雙岐桿菌嗜酸乳桿菌在腸道易生存的乳酸菌從糞便分離菌（必要的技術）從多種菌中分離必須選擇培養基雙岐桿菌等、分離厭氧的菌需要厭氧培養法（注意點！）有可能染上糞便中的有害菌引起腹瀉等一定戴上手套、口罩等保護用具器材的準備均質機稀釋用水分離培養基各種吸管 Teflon制的均質器具各種厭氧培養器具消毒用酒精消毒用次氯酸防止污染用罩布其它、煤氣噴燈、試管攪

7、拌機滅菌用塑料袋、手套、口罩用Teflon均質器具均質化糞便稀釋用水均質化樣品1g9ml糞便混濁液的制作取糞便約1g放入容器中。加入約9ml的稀釋水。用均質機把糞便的塊好好碾碎。注意有害菌的感染！操作者的手等沒有傷口戴手套、口罩、眼鏡等的保護用具常備消毒藥。樣品的稀釋和涂抹按順序地稀釋混濁液、涂抹分離培養基。（分離培養基的種類）乳酸桿菌LBS瓊脂培養基雙岐桿菌TOS-丙酸瓊脂培養基BL瓊脂培養基抗生素添加）樣品的厭氧培養往密封的容器里放入脫氧劑和氧檢驗劑，37培養約3天。因為雙岐桿菌厭氧、注意盡快地厭氧培養。使用器具的處理將使用完了的一次性塑料器具放入滅菌袋，高壓蒸汽滅菌處理后扔掉。玻璃器具等

8、。用的次氯酸溶液消毒一晚后洗凈單株菌的分離成功失敗反復分離到單菌株為止。即使一次成功，為確認再做一次。單株菌分離的實例 （從酸奶分離出） 從酸牛奶、使用一般的乳酸菌分離培養基分離的從左側的培養基使用MRS培養基分離的菌的顯微鏡觀察Lb. bulgaricusBif. longumLb. gasseriSt. thermophilus乳酸菌屬的鑒定分離株長鏈桿菌球菌產生50%以上的乳酸、革蘭氏陽性、無運動性、Catalase（）、芽孢（）四聯同型發酵異型發酵LactobacillusPediococcusStreptococcusEnterococcusLactococcusLeuconosto

9、c乳酸菌種的鑒定糖碳源的利用方法用含有各種糖的培養基培養，確認用哪種糖能使菌發育。使用出售的檢測板（API, Biolog）很方便利用了DNA的方法16S-rDNA排列、DNA-DNA雜交其它的再確認、進行發酵形式、發育溫度、D,L乳酸比例、耐鹽性等的檢查。根據糖碳源的利用分類API50 CHLStreptococcus thermophilus 往基礎培養基里放入分離菌并混勻向No.150分注、培養23天變成黃色可利用碳源判定菌種在No.150的各試管中裝有不同種類的糖。按16S-rDNA排列分類細菌DNA16S-rDNA領域（占全部DNA的約2000分之1）DNA生物遺傳信息作用的分子。包含AdenineA, ThymineT,GuanineG, CytosineC 4種堿基構成,由其排列確定了生物的種類。同種類的生物，DNA排列也相似。16S-rDNA領域（含約1500堿基）因為全部的菌種在這個領域，所以比較這個領域的排列，可以對細菌分類。用PCR法、括增菌的16S-rDNA。按 16S-rDNA排列分類16S-rDNA領域電泳蛍光導入反應從菌中提取