1、生物技術綜合試驗Comprehensive experiments of biotechnology 第1頁第1頁主要內容 Contents：一、課程簡介 核酸分離與純化 Isolation and Purification of Nucleic Acid二、電泳技術 Agarose Gel Elrctrophoresis and SDS 三、聚合酶鏈式反應技術 Polymerase Chain Reaction四、DNA序列測定 DNA Sequencing五、分子雜交技術 Molecular Hybridization Southern,Northern and Western Blot六

2、、基因文庫和cDNA文庫構建 Construction of cDNA Library and DNA Library 七、外源基因克隆與表示 Heterogenic Gene Cloning and Expression八、蛋白質分離、純化技術 Isolation and Purification of Protein第2頁第2頁1 表示蛋白質分離沉淀第3頁第3頁蛋白質分離搜集菌體洗滌破碎細胞等電沉淀鹽析沉淀高分子物質分級沉淀超聲破碎 化學法 溶菌酶上清液培養基第4頁第4頁1.1 凝膠過濾層析凝膠過濾又叫分子篩層析，其原因是凝膠小球含有網狀結構，小分子物質能進入其內部，而大分子物質卻被排除在

3、外部。當一混合溶液經過凝膠過濾層析柱時，溶液中物質就按不同分子量篩分開了。 第5頁第5頁凝膠過濾層析柱第6頁第6頁膠球大小-介質離子粗細影響流動(1) 膠球顆粒有一定大小，一般可分為 corse, medium, fine, super fine 四種粗細 (grade)；越粗膠體，流率越好，但分辨率越差。 因膠球外面緩沖液是由膠球表面向內擴散，樣本蛋白質也是以擴散方式進入膠球，再由中心向外擴散出來。膠球半徑越大，擴散距離越大，效果越差。(2) 下圖闡明這種擴散介質機制。 而近年來因材料科學進步，發展出通透性特強膠球，緩沖液可直接浸潤而進入膠球，不需通過擴散作用，是為dispersion彌散式

4、膠體，效果較好且快速。商品化稱為 perfusion chromatography。 第7頁第7頁膠球大小-介質離子粗細影響流動第8頁第8頁第9頁第9頁二、 離子互換層析 離子互換層析是在以離子互換劑為固定相，液體為流動相系統中進行。離子互換劑是由基質、電荷基團和反離子構成。離子互換劑與水溶液中離子或離子化合物反應主要以離子互換方式進行，或借助離子互換劑上電荷基團對溶液中離子或離子化合物吸附作用進行。第10頁第10頁第11頁第11頁兩大類離子互換介質由介質帶電基團不同，可分為兩大類： 介質帶電基團(counter ion)(1) 陽離子互換介質 (cation exchanger)： 載體-陰

5、離子基團 陽離子(2) 陰離子互換介質 (anion exchanger)： 載體-陽離子基團 陰離子 第12頁第12頁陽離子： 兩價陽離子 NH4+ K+ Na+ H+ Li+陰離子： I - Br - Cl - HCO3- CH3COO-, OH-第13頁第13頁四、 親和層析 親和層析原理與眾所周知抗原一抗體、激素一受體和酶一底物等特異性反應機理相類似，每對反應物之間都有一定親和力。在親和層析中是特異配體才干和一定生命大分子之間含有親和力，并產生復合物。實質上親和層析是把含有辨認能力配體L（對酶配體能夠是類似底物、克制劑或輔基等）以共價鍵方式固化到含有活化基團基質M（如活化瓊脂糖等）上，

6、制成親和吸附劑ML，或者叫做固相載體。而固化后配體仍保持束縛特異物質能力。第14頁第14頁第15頁第15頁第16頁第16頁特異性配體親和層析法與通用性配體親和層析法特異性配體親和層析法：配體普通為復雜生命大分子物質（如抗體、受體和酶類似底物等），它含有較強吸附選擇性和較大結合力。通用性配體親和層析法：配體則普通為簡樸小分子物質（如金屬、染料，以及氨基酸等），它成本低廉、含有較高吸附容量，通過改進吸附和脫附條件可提升層析分辨率。第17頁第17頁金屬螯合親和層析a. 許多蛋白分子上帶有金屬離子，則此蛋白質也許會吸附該金屬。b. 若把某金屬固定到固相載體上，則此載體將會專一性地吸附需要此金屬蛋白質。

7、c. 基因操作時，經常在表示蛋白質末端加上一段含有六個 His 片段；則此表示蛋白質，可以吸附到含有鎳吸著劑上，可以用咪唑流洗出來 。d. 這種載體上結合有某些可與金屬產生配位鍵基團 (如 nitrilotriacetic acid)，這些基團與金屬離子結合 (如鎳離子)后，即可成為親和吸附劑。第18頁第18頁第19頁第19頁疏水性層析法(1) 蛋白質分子表面有部份疏水性區域，若在一極性很強環境中，則會被吸附在非極性固定相載體上；若環境極性減少，則可被洗脫出來，即為 疏水性層析法 (hydrophobic interaction chromatography, HIC)。(2) HIC 沒有親

8、和層析析法那么強專一性，較似離子互換法，但所依據作用力，則是非極性基團間疏水性引力。 第20頁第20頁反相層析法(1) 是 HIC 及離子互換法綜合體，但屬于一個 partition 層析；可使用離子互換 (或類似 HIC) 介質。(2) 混合極性及非極性溶液為流動相，當流動相通入介質后，介質表面可固定其中極性溶液 (若使用 HIC 介質則固定非極性者)，樣本分子會在此二相中進行 partition 分離。(3) 因固定相及流動相極性剛好相反，故名 reverse phase。第21頁第21頁第22頁第22頁第23頁第23頁離子互換層析第24頁第24頁樹脂材質 疏水性：聚苯乙烯-苯二乙烯親水性

9、：纖維素（cellulose）、葡聚糖凝膠（Sephadex gel）和瓊脂糖凝膠（Sepharose） 特性是含有親水性和較大表面積，對生物活性物質而言，是一個較為溫和環境，同時也是大分子所合用分離純化材質 第25頁第25頁第26頁第26頁離子互換劑選擇 保持欲分離物質生物活性。已知等電點物質，在高於等電點pH條件下，因帶有負電荷，應采用陰離子子交換，在低於等電點pH下，則采用陽離子交換。未知等電點物質，在一定pH條件下進行電泳，向陽極移動較快物質，在同樣條件下可被陰離子交換劑吸附，向陰極移動較快物質可被陽離子交換劑吸附。第27頁第27頁第28頁第28頁 緩衝液選擇緩衝液離子以不干擾分離物活

10、性測定、不影響待測物溶解度、不發生沉澱為原則；使用陰離子交換纖維時要選用低於交換劑離子 pK值緩衝液，若欲分離物質屬於酸性，則緩衝液pH值要高於該物等電點；用陽離子交換纖維時要選用高於 pK值緩衝液，目的物屬於鹼性物質話，緩衝液要低於該物等電點pH值。所使用緩衝液 pH 只要比樣本蛋白質 pI 稍高或低 1 pH 單位即可 。第29頁第29頁Donnan Effect 與 pH 變化離子交換介質表面 微環境 會比緩衝液高或低一個 pH 單位。第30頁第30頁離子交換樹脂前處理 離子交換樹脂使用前，先以蒸餾水除去其內之雜質 ，並以NaOH和HCl處理樹脂，使其上官能基完全露出。再以水清洗至pH

11、7.0，最後用欲使用緩衝液浸泡。第31頁第31頁(1) 離子交換介質與蛋白質結合量有一定程度，稱為該交換介質 容量 (capacity)；若超過此一容量，多出樣本會直接流出。(2) 交換介質結合容量大小，受層析條件不同、蛋白質種類不同、緩衝液不同、pH 或離子濃度不同等，有很大差異。 如 DEAE-Sepharose CL-6B 每 100 mL 可結合 11 克白蛋白，但對 ferritin 只有 0.4 克。介質容量有限 第32頁第32頁可用 pH 或 鹽 梯度洗脫方式有： 連續梯度 (continuous gradient) 及 階段梯度 (stepwise gradient)。洗脫第3

12、3頁第33頁第34頁第34頁第35頁第35頁離子互換法操作要點1膠體平衡：用過膠體要再生完全平衡在緩沖液中；2洗脫方式：通常都以氯化鈉進行連續梯度洗脫；3濃度體積：高下限洗脫液濃度及體積第36頁第36頁離子互換層析應用制備、純化生命物質測定蛋白質等電點第37頁第37頁凝膠過濾層析第38頁第38頁凝膠分類1）葡聚糖凝膠2）瓊脂糖凝膠3）聚丙烯酰胺凝膠第39頁第39頁凝膠過濾法應用脫鹽和濃縮分離生命物質去熱源物質（糖蛋白）測定分子量第40頁第40頁親和層析第41頁第41頁親和層析法基質選擇抱負基質：1）極低非特異吸附性；2）高度親水性3）較好理化穩定性4）含有大量化學基團，能有效活化，易和配體結合；5）含有適當多孔性 第42頁第42頁 纖維素、聚丙烯酰胺、交聯葡聚糖、瓊脂糖、交聯瓊脂糖、多孔性玻璃珠； 用在蛋白質，仍以 聚糖類 為最佳。 以 Sepharose為例，可自行用 CNBr 活化，使糖分子接上 -O-CN (cyanate ester) 基，再與配體上胺基反應。 有些親和層析法使用 spacer arm 來減少配體立體障礙第43頁第43頁第44頁第44頁第45頁第45頁影響親和層析原因樣品體積和流速溫度第46頁第46頁親和層析法應用 1. 核酸純化：單股DNA與纖維素（cellulose）組合凝膠，已成為分