1、獸用疫苗生產與質量控制張淵魁福州大北農生物技術有限公司第1頁第1頁主要內容1.獸用生物制品簡介2.疫苗定義和分類3.疫苗生產工藝簡介4.疫苗生產質量控制5.疫苗研究發展趨勢第2頁第2頁一、獸用生物制品簡介獸用生物制品概念獸用生物制品分類第3頁第3頁1、獸用生物制品概念概念：系用天然或人工改造微生物、寄生蟲、生物毒素或生物組織及代謝產物等為材料，采用生物學、分子生物學或生物化學等相應技術制成一類生物活性制品，用于預防、治療和診斷畜禽等動物疾病獸用生物制品學科：是一門涉及各種學科領域應用科學（微生物學、免疫學、生物化學、試驗動物學、細胞學、分子生物學、制冷學、生物工程學、管理學等）第4頁第4頁2、

2、獸用生物制品分類按生物制品性質分類疫苗（vaccine）：接種動物后能產生自動免疫和預防疾病一類生物制劑稱為疫苗。類毒素（toxoid）：又稱脫毒毒素，是指細菌生長繁殖過程中產生外毒素，經化學藥物（如甲醛）處理后成為無毒性但保留免疫原性生物制劑，接種動物后也能產生自動免疫，產生抗毒素血清。第5頁第5頁診斷制品（diagnostic preparation）：利用微生物、寄生蟲及其代謝產物，或動物血清、組織等，依據免疫學和分子生物學原理制備，用于疫病診斷、免疫監測和病原鑒定一類生物制劑。抗病血清（antiserun）：或高免血清，為含有高效價特異性抗體血清，能用于治療或緊急預防相應病原體所致疾病

3、。第6頁第6頁微生態制劑（probiotics）：又稱活菌制劑，是用非病原微生物如乳酸桿菌、雙歧桿菌等活菌制劑，口服治療畜禽腸道正常菌群失調引起下痢。副免疫制品（paraimmunity preparation）： 這類物質能通過刺激機體，提升特異性和非特異性免疫，從而使動物機體對其它抗原物質特異性免疫力更強更持久，如脂多糖、多糖、緩釋微球、細胞因子，免疫刺激復合物等。第7頁第7頁普通制品：指用普通辦法制備、未經濃縮和純化處理，或僅按毒（效）價原則稀釋制品。如既有國內大部分老式疫苗均為普通制品。精制生物制品：將普通制品（原制品）經濃縮和純化處理，清除無效成份，毒（效）價高于普通制品效力更加好，

4、如精制破傷風毒素和精制結核菌素等。第8頁第8頁液狀制品：濕性制品。一些滅活疫苗如兔病毒性出血癥滅活疫苗 ，診斷制品如血清、抗原等為液狀制品。多數既不耐高溫和陽光，又不宜低溫凍結和重復凍融，不然其效價會受到影響，只能在低溫冷暗處保留，保留時間較短。干燥制品：液狀制品加入適當穩定劑或凍干保護劑經冷凍真空干燥處理，將96%以上水分除去后剩留疏松海綿狀物質，為干燥制品，生物制品經干燥后能較長時間保護活性和抗原效價。佐劑制品：為了增強疫苗制劑誘導動物機體免疫應答反應，提升免疫效果，在疫苗制備過程中加入適量佐劑，如氫氧化鋁膠、油佐劑等，這類制品稱為佐劑制品。第9頁第9頁二、疫苗定義和分類疫苗定義疫苗分類第

5、10頁第10頁1、疫苗定義由特定細菌、病毒、立克次體、衣原體等微生物及寄生蟲制成，接種動物后能產生自動免疫和預防疾病一類生物制劑均稱為疫苗，制劑主要成份為微生物或寄生蟲。第11頁第11頁2、分類按微生物分類細菌類疫苗病毒類疫苗寄生蟲類疫苗第12頁第12頁按疫苗抗原性質和制備工藝分類活疫苗（live vaccine）弱毒活疫苗基因缺失疫苗基因工程活載體疫苗病毒抗體復合疫苗：特異性高免血清與適當百分比相應病毒構成，其特點是能夠延緩病毒釋放，提升疫苗安全性和免疫效果。第13頁第13頁活疫苗特點可在體內繁殖系統免疫反應和局部免疫反應免疫力持久，產量高，成本低有毒力增強和反祖危險抗原干擾現象保留條件苛刻

6、第14頁第14頁死疫苗（killed vaccine）滅活疫苗：由完整病毒或細菌經滅活劑滅活后制成，即要使病原體充分死亡，喪失感染性或毒性，又要保留其免疫原性。 亞單位疫苗：是指將病原體經物理或化學方法處理，除去無效物質，提取其有效抗原部分制備一類疫苗，經提取、純化，經過化學合成，制成不同亞單位疫苗。第15頁第15頁基因工程重組亞單位疫苗：利用DNA重組技術，將編碼病原微生物保護性基因 導入原核或真核細胞，使其在受體細胞中高效表示，分泌保護性抗原肽鏈，提取肽鏈加入佐劑制成。該類疫苗安全性好，副反應小（有害反應原少），穩定性好，便于保留和運送，但研發、生產成本高，免疫原性較差，需多次免疫才干得到

7、有效保護。第16頁第16頁死疫苗特點不能在體內繁殖有助于制備多價或多聯疫苗比較安全，不發生全身性副反應，無毒力反祖現象受外界影響小，有助于保留運送免疫劑量大，需多次免疫，成本高只能誘導機體產生體液免疫通常需要用佐劑或攜帶系統來增強其免疫效果第17頁第17頁基因疫苗（genetic vaccine）： 包括DNA疫苗和RNA疫苗，是將編碼某種抗原蛋白基因置于真核表示元件控制下，構成重組表示質粒DNA或RNA，將其直接注入動物體內，通過宿主細胞轉錄翻譯系統合成抗原蛋白，從而誘導宿主產生抗原蛋白免疫應答。第18頁第18頁單價疫苗（univalent vaccine）：利用同一個微生物（菌）毒株或同一

8、個微生物中單個血清型（菌）毒株增殖培養物制備疫苗。多價疫苗（polyvalent vaccine）：利用同一個微生物（菌）毒株或同一個微生物中多個血清型（菌）毒株增殖培養物制備疫苗多聯疫苗（mixed vaccine）：利用不同微生物增殖培養物，按免疫學原理和方法組合而成疫苗。接種動物后能取得對應疾病免疫保護，一針多防，可降低勞動力和動物應激。第19頁第19頁按疫苗病原菌（毒）株起源分類同源疫苗：采取同種、同型或同源微生物制備，應用于同類動物免疫接種疫苗。異源疫苗：采取不同種微生物（菌）毒株制備疫苗，接種動物后能使其取得對疫苗中未含有病原體產生抵抗力，如犬在接種麻疹疫苗后，能產生對犬瘟熱抵抗力

9、。或采取同一個中一個型微生物（菌）毒株制備疫苗，接種動物后能使其取得對異型病原體抵抗力。第20頁第20頁三、疫苗生產工藝簡介疫苗生產基本條件疫苗生產工藝流程生產中影響疫苗質量關鍵環節疫苗抗原制造技術簡介疫苗檢查疫苗保留第21頁第21頁1、疫苗生產基本條件產品同意文號菌（毒）種疫苗制造及檢查規程GMP廠房、設施和儀器設備第22頁第22頁產品同意文號農業部頒發同意文號GMP證書(具備該疫苗生產線)產品復核檢查(具備生產該疫苗能力)標簽、闡明書樣稿審查(符合規程要求)省級文號？第23頁第23頁菌 （毒）種菌（毒）種是疫苗生產必備原材料，國家對菌（毒）保管和使用有嚴格要求和限制（生物安全問題）。生產疫

10、苗菌（毒）種起源：中國獸醫藥物監察所或新獸藥轉讓單位。菌（毒）種保管和使用：基礎種毒由中國獸醫藥物監察所或其委托保管單位進行生產、鑒定和保管，生產用種子批由公司生產、鑒定和保管。第24頁第24頁菌 （毒）種分類 菌（毒）種分強毒和弱毒強毒：通常指從得病動物體內分離到致病毒株，只能用于制造滅活疫苗和檢查用弱毒：通常是采用人工辦法用強毒致弱而成，普通于制造活疫苗第25頁第25頁菌 （毒）種質量原則生物學特性明顯、歷史清楚：形態、培養特性、生化特性及血清免疫學特性等明顯，易于判別；人工感染動物引起穩定一致臨床癥狀和病理改變特性；原始細菌或病毒株起源地域、動物品種流行資料清楚；分離鑒定資料完整；傳代、

11、保藏和生物學特性檢查辦法明確。遺傳學上相對純一與穩定：菌毒種在傳代增殖過程中一些遺傳形狀會發生改變和分離，如形態特性、毒力、反應原性、免疫原性等方面，因此要求制造生物制品菌（毒）種這種改變和分離越小越好，應經常進行挑選，純化和克隆。第26頁第26頁反應原性和免疫原性優良：反應原性高，即使微量量抗原物質進入機體內既能產生強烈免疫反應，血清學上會出現很高特意性；優良免疫原性物質能使免疫動物產生完善免疫應答，從而取得堅強免疫力毒力應在要求范圍以內：用于制造弱毒疫苗菌毒種，毒力應盡也許弱一些；用于制造抗血清、滅活疫苗和疫苗效力檢測菌（毒）種毒力應強，且抗原性要盡也許高第27頁第27頁菌（毒）種篩選程序

12、和內容細胞EID50ELD50TCID50穩定性試驗凍干、冷凍或冷藏保留反應原性免疫原性血清學試驗攻毒保護試驗病毒分離純正性試驗致病性試驗抗原性試驗原動物LD50篩選出毒力強、抗原性好、生長穩定、純凈毒株，用于制備疫苗、診斷液和治療用抗體或疫苗效力檢查用試驗動物雞胚細胞反應原性純正性試驗抗原性試驗原動物致病性試驗病毒分離第28頁第28頁弱毒菌（毒）種選育弱毒菌（毒）種選育自然弱毒株分離人工誘變致弱同源動物（如NDVLaSota株）異源動物（HVTFC126株）化學路徑物理路徑生物路徑亞硝基胍醋酸坨洗衣粉高溫紫外線適應非易感動物或細胞雜交減毒第29頁第29頁疫苗制造及檢查規程任何一個疫苗都有其制

13、造及檢查規程，它是國家法定原則。疫苗生產必須嚴格按規程要求辦法進行生產和檢查，若要改變辦法，則要提供研究材料證實是可行，并報農業部評審同意，形成新規程才干進行生產。規程起源中華人民共和國獸用生物制品規程（常規疫苗）轉讓單位（新獸藥）第30頁第30頁廠房、設施和儀器設備GMP證書是疫苗生產準入證， 疫苗生產必需擁有與生產工藝相符合生產線 GMP 生產車間設計要求功效區：抗原制備區、成品生產區、洗滌區、辦公區。各區域和功效間以潔凈走廊相連，嚴格按人流物流分開原則進行設計。潔凈度：按各功效間潔凈度、壓力、壓差要求設計施工。有10萬級區、萬級區和局部百級區。六大系統：供電、供水、供汽、污水處理、凈化、

14、監控。第31頁第31頁廠房、設施和儀器設備檢查設施質檢室檢查動物舍（應配備有符合各類試驗動物級別飼養設施）倉儲設施原輔材料庫半成品庫成品庫第32頁第32頁廠房、設施和儀器設備滅菌設備：高壓蒸氣滅菌柜、干熱箱、鍋爐等；凈化設備：凈化機組、無菌室、超凈工作臺等；微生物培養設施設備：溫室、孵化器、細胞培養轉瓶機、各種罐體、生化培養箱等；乳化設備：各種罐體、膠體摸、高壓勻漿機等；凍干設備：凍干機；灌裝設備：洗烘連動線、自動灌裝加塞聯動機；包裝設備：扎蓋機、帖標機；冷藏冷凍設施設備：冷庫、冷柜、液氮罐等；污水廢棄物處理設施設備：滅菌柜、消毒罐、污水處理站；檢查儀器設施設備：各種顯微鏡、水分測定儀、二氧化

15、碳培養箱、生物安全柜、動物房等。第33頁第33頁福州大北農公司總體布局圖主廠房大動物房小動物房質檢樓鍋爐房污水處理站脾林苗倉儲辦公區大門生活區第34頁第34頁第35頁第35頁第36頁第36頁疫苗生產工藝流程 菌（毒）種 培養物（培養基、動 物、禽胚或細胞等） 收獲抗原（培養液、含毒組織、胚液或細胞液等） 配苗 分裝 凍干成活疫苗或滅活后制成滅 活疫苗。第37頁第37頁細菌疫苗制造流程蛋白胨、肉浸液等原料培養基配制、滅菌菌種生產用種子培養菌液菌苗原液配苗分裝凍干、扎蓋帖簽活疫苗原料佐劑滅活菌液配苗乳化分裝、扎蓋、帖簽滅活疫苗滅活檢查配制、滅菌保護劑原料配制、滅菌第38頁第38頁病毒性細胞疫苗制造

16、工藝流程健康動物（或胚胎）組織原料細胞懸液生長細胞病毒液配苗分裝凍干、扎蓋帖簽活疫苗基礎種毒生產用種毒原料保護劑配制滅菌細胞培養液傳代細胞滅活病毒液配苗（混勻、乳化）分扎蓋帖簽裝滅活疫苗檢查原料佐劑配制滅菌滅活檢查配制培養收獲第39頁第39頁病毒性組織疫苗制造工藝流程感染動物或胚胎分裝、扎蓋、貼簽健康動物或SPF雞胚等健康動物或SPF雞胚等動物或SPF雞胚等基礎種毒生產用種毒收獲感染組織或胚液純化配制成含毒懸液配苗分裝凍干活疫苗保護劑原料配制檢查滅活病毒液配苗、乳化滅活疫苗原料佐劑配制滅活檢查第40頁第40頁影響疫苗質量關鍵環節活疫苗生產用菌（毒）種制備是否優良制苗用抗原制備（微生物增殖）是否

17、高效凍干保護劑選擇和凍干曲線制定是否合理滅活疫苗生產用菌（毒）種制備是否優良制苗用抗原制備（微生物增殖）是否高效抗原滅活是否徹底乳化工藝是否先進第41頁第41頁疫苗抗原制造技術簡介細菌類疫苗抗原增殖技術（培養基增殖）細菌培養是指細菌在動物體外人工培養基上以及人工控制環境中（通慣用培養罐進行培養）生長繁殖過程。細菌性疫苗都是利用培養基制造，首先通過度離培養，取得單個菌落，制備細菌種子，然后逐層培養進行規模化生產。第42頁第42頁細菌類疫苗抗原增殖技術（關鍵控制點）培養基質量：培養細菌類疫苗抗原培養基普通是人工制備一個液體培養基，它含有培養相應細菌所需營養成份，包括水、氮源、碳源、無機源和生長因子

18、等它好壞直接影響到產菌量和檢查結果。第43頁第43頁生產用菌種菌落挑選符合細菌培養特性活菌含量符合要求純凈無污染代次按要求控制工藝穩定性培養條件工藝技術（各種參數如種子接種量、培養時間、收獲時間等）第44頁第44頁老式病毒類疫苗抗原增殖技術動物增殖禽胚增殖細胞增殖第45頁第45頁5、疫苗檢查活疫苗物理性狀（凍干苗） 無菌檢查（純正檢查）判別檢查：特異性血清中和檢查。外源病毒檢查（病毒類疫苗）：中和法檢查。活菌計數（細菌類疫苗）：平板計數。病毒含量測定（病毒類疫苗） ：EID50、ELD50或TCID50。第46頁第46頁安全檢查：動物或雞胚（劑量幾倍至幾十倍）效力檢查：攻毒保護或微生物含量測定

19、。水份測定（凍干苗）：4%以內。真空度測定（凍干苗）：白色、粉色或紫色輝光。第47頁第47頁滅活疫苗滅活檢查：半成品檢測：EID50、ELD50或TCID50 。物理性狀：外觀、劑型、穩定性、粘度檢查。無菌檢查：培養基檢測安全檢查：動物檢查效力檢查：攻毒保護或測抗體。滅活劑含量測定：化學分析第48頁第48頁6、疫苗保留疫苗對溫度極為敏感，保留不妥會使效價嚴重受損（尤其是活疫苗）或劑型破壞，并造成疫苗失效，因此應嚴格在要求條件下保留。第49頁第49頁7、豬瘟活疫苗產品簡介種類：豬瘟活疫苗依據抗原制備路徑不同又分為：豬瘟活疫苗（成兔脾淋源）豬瘟活疫苗（乳兔源）豬瘟活疫苗（細胞源）豬瘟活疫苗（牛體源

20、）疫苗研究和發展歷史背景第50頁第50頁3.6豬瘟活疫苗產品簡介生產和使用對比疫苗類型使用種毒抗原制備辦法質量原則生產成本臨床使用豬瘟活疫苗（成兔脾淋源）豬瘟兔化弱毒接種成兔，采集兔體脾淋組織150個RID高非特異免疫強抗原含量高過敏率低豬瘟活疫苗（乳兔源）豬瘟兔化弱毒接種乳兔，采集乳兔肌肉組織150個RID較高無非特異免疫抗原含量較低過敏率高豬瘟活疫苗（細胞源）豬瘟兔化弱毒接種牛睪丸細胞，收貨細胞培養液750個RID（新原則7500 RID）低無非特異免疫，抗原含量高，過敏率較高豬瘟活疫苗（牛體源）豬瘟兔化弱毒接種犢牛，采集犢牛脾淋組織150個RID較底非特異免疫強抗原含量高過敏率低第51頁

21、第51頁豬瘟活疫苗質量控制要素菌毒種純凈（細菌和外源性病毒污染）含毒量高于國家原則代次控制在5代以內原材料選擇組織苗家兔選擇（兔種、年齡、體重、健康情況等）乳兔選擇（日齡、體重、健康情況等）細胞苗細胞選擇（無污染外原病毒等）第52頁第52頁豬瘟活疫苗質量控制要素生產環境控制 組織苗動物飼養條件控制接毒后動物反應觀測與判斷生產線功效間潔凈級別要求 細胞苗細胞檢測（BVDV等）健康細胞和接毒后細胞觀測與判斷生產線功效間潔凈級別要求半成品檢測成品檢測第53頁第53頁四、疫苗生產質量控制質量控制意義質量控制要求質量控制確保辦法（獸藥GMP管理）疫苗質量評價第54頁第54頁1、質量控制意義國家強制要求

22、禽流感事件，人血白蛋白事件公司本身要求 品牌、效益、責任 生物制品特殊性表現在在生產和使用過程中人和動物安全性（污染、混毒、人畜共患）對環境安全性群體性危害第55頁第55頁2、質量控制要求安全性：毒副作用、殘留、環境、人類有效性：有效成份達到要求，療效確切均一性：批間、最小單元間、貯存運送后等穩定性：貯存期穩定，有較長有效期以便性：給藥方式、路徑經濟性：在確保質量前提下，改進生產工藝，提升效力，減少成本第56頁第56頁3、確保辦法獸藥GMP管理 GMP是英文Good Manufacturing Practice for Drugs縮寫，直譯為“優良產品生產實踐”。我國獸藥GMP是藥物生產質量管

23、理規范簡稱。 獸藥GMP是在獸藥生產過程中，用科學、規范化條件和辦法來確保生產優良獸藥整套科學體系。它實行目的就是對獸藥生產全過程進行質量控制，以確保生產獸藥質量是合格優良。 第57頁第57頁3、確保辦法獸藥GMP背景 GMP是從藥物生產實踐中取得經驗教訓總結。人類社會經歷了12次藥物劫難，尤其是20世紀出現藥物劫難“反應停”事件后，公眾要求制定嚴格監督法律；最早GMP是由美國坦普爾大學6名專家編寫制定；1963年美國頒布第一部GMP，美國FDA通過實行；1975年WHO正式公布GMP，開始向組員國推薦，并擬定為WHO法規之一，迄今為止有100多個國家實行了GMP；我國醫用藥物從1982年開始

24、頒布GMP，農業部于己于1989年頒布并決定實行GMP，要求至12月31日未取得GMP合格證公司，不得進行藥物生產。第58頁第58頁3、確保辦法控制要求生產、管理人員廠房、設施、設備原料、包裝材料生產辦法檢查、監控售后服務經檢查合格通過驗證可靠完善經驗證適當訓練有素GMP基本控制要求影響質量原因完善管理文獻第59頁第59頁3、確保辦法控制要求在GMP管理要求中，3條主線貫穿全過程生產處處防污染：原材料或產品被微生物或外來物攙雜、玷污、混雜、失真、漏掉、任意等造成產品質量問題，生產過程對環境和人員安全性：事物件件有驗證：能證實任何程序、生產過程、設備、物料、活動或系統能造成預期結果，有文獻證實行動。但凡須問個為何？怎么樣？好不好？行不