1、表達腦源性神經營養因子的人多發性骨髓瘤小鼠模型的建立王雅丹，胡豫，張璐，黃靖，孫春艷【摘要】過去的研究證實腦源性神經營養因子BDNF在體外具有促進多發性骨髓瘤細胞增殖并誘導血管新生的才能。本研究討論BDNF/TrkB途徑是否為治療的潛在靶點，并比擬兩種途徑建立人ND/SID小鼠模型的優缺點，為深化探究治療的新靶點奠定基矗選擇糖尿病抵抗/重癥結合免疫缺陷ND/SID小鼠，通過皮下注射或尾靜脈注射人骨髓瘤細胞株RPI8226建立兩種異體移植動物模型。觀察荷瘤后小鼠的生長狀態，測量皮下瘤塊的體積；荷瘤后3周，每周經眼眶后靜脈叢采血，檢測血清中人源輕鏈含量、a2+濃度和血漿中人源BDNF濃度，并計數紅

2、細胞；小鼠死后，采用組織學方法觀察瘤細胞的形態特征，流式細胞術檢測小鼠外周血和骨髓中人源性D38細胞比例，采用計算機X線數字攝影觀察小鼠全身骨密度的改變和骨質破壞情況。結果說明：皮下注射模型的成瘤率高5/5，具有多種與漿細胞瘤相似的病理學特征，但其骨髓中未檢測到細胞，血清中鈣離子濃度不高，蛋白濃度升高不明顯且未發現溶骨性損害的組織學和影像學證據。尾靜脈注射模型成瘤率相對較低4/7，骨髓中可檢測到呈浸潤生長的人D38細胞；而且在荷瘤3周后，血清中即可檢測到人源蛋白；隨著腫瘤的生長，蛋白程度、鈣離子濃度逐漸升高，并有溶骨性損害的影像學證據。兩種模型血漿中人源BDNF的程度亦逐漸升高，9周時濃度分別

3、為7311pg/l和10518pg/l。結論：本研究成功建立了兩種高表達BDNF的荷瘤ND/SID小鼠模型，兩種模型互相結合應用，為探究治療的新靶點BDNF/TrkB提供了適宜的動物模型。【關鍵詞】多發性骨髓瘤EstablishentfultipleyelausedelsExpressingBrainDerivedNeurtrphiFatrKeyrdsultipleyela;anialdel;brainderivedneurtrphifatrJExpHeatl2022;15(5):967-972糖尿病抵抗/重癥結合免疫缺陷ND/SID小鼠是免疫缺陷小鼠品系中殘留免疫較少的品系之一，它缺乏功能性

4、的T/B細胞和循環補體，并且NK細胞和巨噬細胞功能也存在缺陷6，因此常被作為許多正常和惡性人源細胞的移植載體，包括細胞株和原代細胞7,8。國內有關動物模型的報道較少，多為皮下種植模型9。國外學者雖然應用ND/SID小鼠建立的模型較為成熟，但并未涉及BDNF的表達。在本研究中，我們將高表達BDNF的人細胞株RPI8226通過兩種途徑種植于ND/SID小鼠以建立動物模型，比擬兩種模型的優缺點，并檢測其體內BDNF的表達情況，為深化探究BDNF/TrkB途徑在中的作用奠定基矗材料和方法試劑兔抗人BDNF抗體和兔抗人D38抗體購于Santaruz生物技術公司，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG和FIT標

5、記的羊抗兔IgG為Piere公司產品。FIT標記的小鼠抗人D38或PerP標記的小鼠抗人D45單克隆抗體為BetnDikinsn公司產品。淋巴細胞別離液、RPI1640培養液購于Gib公司。BDNFELISA試劑盒購于RD公司。細胞培養人類細胞系RPI8226細胞購于中國醫學科學院根底醫學研究所，置于含有10%胎牛血清的RPI1640培養液中，在37、52及飽和濕度的培養箱中培養。取經臺盼藍染色鑒定細胞存活率大于95%并處于對數生長期的細胞進展實驗。ND/SID小鼠的飼養4-6周齡ND/SID雄性小鼠20只，購自上海斯萊克實驗動物研究所，飼養于SPF級實驗室中。飼料經60照射，飲用水及墊料均經

6、高壓消毒無菌處理。對小鼠的所有操作均在無菌層流條件下進展。模型的建立取6-8周齡ND/SID鼠，承受300Gy射線照射(放射源60劑量率172Gy)，照射后24小時內將3107個RPI8226細胞懸于200lPBS溶液中，并經過尾靜脈注射途徑輸注于ND/SID小鼠體內7只，以同體積的PBS溶液作陰性對照4只；或不經過照射，左后肢皮下注射2107個RPI8226細胞5只，同部位注射PBS溶液作陰性對照4只。每日監測小鼠的體重、皮毛、活動情況、有無麻木癱瘓病癥和感染跡象等。經皮下注射的小鼠還需測量皮下瘤塊的體積ab2/6，a為長徑，b為短徑。待小鼠自然死亡，生存時間以種植瘤細胞當天至死亡時的天數計

7、算。血液學指標的測定荷瘤3周后，每周經眼眶后靜脈叢采血350l，單周時不加抗凝劑，4000r/in離心5分鐘，取血清于-20儲存備用，采用比濁法檢測血清中人源輕鏈的含量和鈣離子濃度；雙周時肝素抗凝，計數紅細胞后，1500r/in離心5分鐘，取血漿，-20儲存備用，采用ELISA法檢測血漿中BDNF濃度，剩余血細胞用于流式細胞術分析。流式細胞術分析取上述剩余血細胞50l，參加熒光標記的抗人D38抗體3.5l，4避光孵育1小時；參加紅細胞裂解液1l，混勻，避光常溫下裂解15分鐘；1500r/in離心5分鐘，棄上清；用PBS1l洗滌，1000r/in離心5分鐘，棄上清；用300lPBS重懸，24小時

8、內上機檢測。皮下瘤塊取一部分切碎、研磨、用70細胞濾網過濾，制成單細胞懸液，分別與FIT標記的小鼠抗人D38或PerP標記的小鼠抗人D45抗體孵育后進展流式細胞術分析。組織學和細胞學分析計算機X線攝影待小鼠死后，進展計算機X線數字攝影PHILIPSptius65型，觀察全身骨密度的改變和骨質破壞情況。統計分析實驗結果以平均值標準誤表示。組間差異分析采用Studentst檢驗，定義p值小于0.05為具有顯著性差異。結果ND/SID小鼠種植瘤細胞后的生存情況皮下注射組，種植瘤細胞27天內14-27天，所有小鼠均可在注射部分檢測到皮下腫瘤，隨后出現明顯的體重下降，沒有明顯的感染或癱瘓征象；荷瘤37天

9、開場有小鼠死亡，61天后所有小鼠均死亡；瘤塊的平均體積約為410.53(239.3-632.73)。尾靜脈注射組荷瘤后22天，5只小鼠出現體重下降、豎毛、弓背病癥體征；31天開場有小鼠死亡，60天時死亡5只。相應對照組小鼠存活時間均大于80天。組織學和細胞學特征皮下瘤塊的組織學分析顯示，腫瘤呈侵襲性生長，侵及周圍骨骼肌組織。瘤細胞具有典型的惡性漿細胞的形態特征：核形態不規那么，核仁明顯，胞漿豐富，可見有絲分裂像；未見壞死區和纖維結締組織浸潤。進一步的流式細胞術分析顯示，瘤細胞的表型與RPI8226細胞相似D38+D45+并且表達BDNF抗原過去的研究證實RPI8226細胞高表達BDNF3隨后，

10、我們應用流式細胞術檢測外周血中和骨髓中單個核細胞人源性D38抗原的表達，結果顯示靜脈注射組4只小鼠的骨髓中檢測到人D38+細胞，表達率為12.2-20.4圖2B，而兩組的外周血中和皮下注射組的骨髓中均未檢測到，此結果說明在靜脈注射的小鼠骨髓中存在人源性細胞的生長。骨髓細胞甩片證實了這一結論，可以見到瘤細胞聚集成團，胞核偏向一側，核旁有淡然區，胞漿豐富，人D38表達陽性。如圖2、D。股骨骨髓形態學分析顯示，瘤細胞浸潤整個骨髓腔，骨皮質變薄，大部分的骨小梁被破壞和吸收圖2F。在小鼠的肝、脾、腎、肺和心未發現明顯的損害。荷瘤小鼠X線攝影小鼠死后進展計算機X線數字攝影，可以觀察到：皮下注射組小鼠左后肢

11、可見瘤塊組織影，全身骨骼的密度與對照組相比無明顯差異，并且未見骨質破壞的影像學表現圖3B；靜脈注射組4只檢測到細胞骨髓內生長的小鼠中2只可疑全身骨密度降低，1只的右側股骨和左側脛骨可觀察到局限性的溶骨損害：骨皮質變薄，髓腔密度降低圖3。血液學指標的結果荷瘤3周后隔周檢測小鼠外周血中紅細胞數量和血清中輕鏈和鈣離子濃度。對照組小鼠外周血中紅細胞計數RB波動于(7.6-11.8)1012/L之間。皮下注射組荷瘤4周，RB為9.41.11012/L，隨著腫瘤的生長緩慢下降，8-9周時下降明顯，從(7.61.7)1012/L降至(4.51.5)1012/L。靜脈注射組RB的降低較皮下注射組更為顯著，從4

12、周時的7.91.21012/L降至9周時的2.80.61012/L圖4。Figure4.RBuntsfperipheralbldinND/SIDie.ntrlgrup，n=84-9eeks.Subutaneuslyinjetedgrup，n=54eeks,n=46eeks,n=38eeks,n=29eeks.TailvEin-injetedgrup,n=74eeks,n=66eeks,n=58eeks,n=39eeks.*p0.01,paredithntrlgrup.對照組小鼠血清中鈣離子濃度為2.19-2.37l/L，皮下注射組血清中鈣離子濃度為2.26-2.32l/L，與對照組比擬差異無顯

13、著性p0.05。在靜脈注射組4只檢測到細胞骨髓內生長的小鼠血清中，鈣離子濃度高于對照組p0.05，且隨時間遷移而增加，9周時為2.860.11l/L圖5。Figure5.Serua2+nentratinfND/SIDie.ntrlgrup，n=83-9eeks.Subutaneuslyinjetedgrup，n=53eeks,n=55eeks,n=47eeks,n=29eeks.Tailvein-injetedgrup,n=73eeks,n=65eeks,n=57eeks,n=39eeks.*p0.05,paredithntrlgrup.RPI8226細胞分泌輕鏈，故我們用比濁法檢測血清中輕鏈

14、的濃度。該檢測方法的檢測下限為40g/l。由圖6可見，靜脈注射組荷瘤3周時，血清中輕鏈程度為455g/l，其濃度隨著腫瘤的生長迅速增加，荷瘤9周濃度為784g/l。皮下注射組荷瘤7周、9周輕鏈濃度分別為446g/l、505g/l；而荷瘤7周前，血清中未檢測到輕鏈，可能因為此時輕鏈的濃度低于檢測的下限。對照組血清中始終無輕鏈。Figure6.SerunentratinfprteininND/SIDie.Subutaneuslyinjetedgrup，n=53eeks,n=55eeks,n=47eeks,n=29eeks.Tailvein-injetedgrup,n=73eeks,n=65eeks

15、,n=57eeks,n=39eeks.*p0.05,paredithntrlgrup.RPI8226分泌BDNF，故我們用ELISA法檢測血漿中BDNF的濃度。檢測方法的檢測下限為20pg/l。由圖7可見，靜脈注射組荷瘤4周時，血漿中可以檢測到BDNF濃度為546pg/l，其濃度隨著腫瘤的生長迅速增加，荷瘤9周濃度為10518pg/l。皮下注射組荷瘤4周時BDNF濃度為4512pg/l，9周時濃度為7311g/l，明顯低于靜脈注射組p0.05。對照組血清中始終無輕鏈。討論是一種惡性漿細胞克隆性疾病，漿細胞在骨髓內異常增殖并分泌單克隆免疫球蛋白蛋白，同時伴有破骨細胞的激活而導致相應的溶骨性損害。

16、臨床上表現為蛋白升高、骨髓中瘤細胞浸潤、高鈣血癥、溶骨性損害和貧血10。本研究首先在ND/SID小鼠體內建立了一種人骨髓瘤細胞株RPI8226皮下種植的動物模型。此模型荷瘤前不需給予射線照射，骨髓瘤細胞皮下種植的成瘤率高，且腫瘤表現出漿細胞瘤的多種病理學特征：浸潤周圍的肌肉組織，具有惡性漿細胞的典型形態特征，并且與源細胞表型相似均高表達D38、D45和BDNF。但疾病早期并非為一種實體瘤，僅在疾病的晚期部分患者可開展為髓外漿細胞瘤10；并且根底研究和前臨床研究均說明細胞與宿主骨髓微環境的互相作用在的發病機制中發揮著主導作用11。但此皮下種植模型的骨髓中未檢測到細胞、血清中鈣離子濃度不高、蛋白濃

17、度升高不明顯且未發現溶骨性損害的組織學和影像學證據，因此該模型不能真實地反映發病的病理生理過程。隨后，我們通過尾靜脈注射的途徑種植細胞。少數ND/SID小鼠有滲漏現象，即具有低程度的功能性NK細胞。因此在尾靜脈注射的模型中，荷瘤前給予低劑量的射線照射，以減少對建立腫瘤模型的影響。4只小鼠骨髓中可檢測到人D38細胞，說明靜脈注射的細胞通過血液循環可成功歸巢于小鼠骨髓，并呈浸潤生長。而且在荷瘤3周后，血清中即可檢測到人源蛋白；隨著腫瘤的生長，蛋白程度、鈣離子濃度逐漸升高，并伴進展性貧血。較之皮下注射模型，靜脈注射模型能更好地模擬的發生開展過程；但其操作過程較復雜，技術要求較高，且成瘤率較低，評估腫

18、瘤生長狀態的指標檢測要求條件高。值得注意的是，兩種模型血漿中均存在有人源BDNF的高表達，且與腫瘤負荷親密相關，考慮為小鼠體內增殖的RPI8226細胞分泌BDNF進入血液循環。此結果與我們過去在患者體內的發現相符2。且人源性BDNF與小鼠BDNF具有較高的同源性12，說明在此兩種模型的根底上可以對BDNF/TrkB信號途徑進展深化探究。另外，臨床上骨病變主要表現為骨質疏松和溶骨性損害，常見于顱骨、盆骨、脊柱、股骨、肱骨等處，X線檢查為其常規檢查手段13。但適用于人類的X線攝像參數不太合適于小鼠，加之小鼠骨骼的體積比人類小得多，微小的骨損害或輕度的骨質疏松不易被發現，故應用X線檢測小鼠骨病變的敏感性較低。本研究中，4只骨髓中檢測到人D38細胞浸潤的小鼠，在影像學檢查方面其中2只可疑全身骨密度降低，在1只的右側股骨和左側