1、關(guān)于酶組織化學(xué)總論第一張，PPT共三十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月一. 概述酶是生物體內(nèi)具有催化作用的特殊蛋白質(zhì)高效性 103-106倍專一性低反應(yīng)條件易變性失活降低生化反應(yīng)的反應(yīng)活化能第二張，PPT共三十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月酶活性的檢測(cè)方法廣義上說(shuō)，任何一種可以測(cè)定反應(yīng)物變化速度的分析技術(shù)，都可用來(lái)測(cè)定酶活性容量法（量氣法）比色法與分光光度法熒光法與同位素法離子選擇電極法，旋光法分子生物學(xué)，免疫化學(xué)法等第三張，PPT共三十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月酶的組織化學(xué) 利用細(xì)胞內(nèi)的酶具有催化底物的特性，并通過(guò)顯色反應(yīng)在切片或涂片上顯示組織或細(xì)胞中內(nèi)源性酶的活性及其定位的方法第四張，PPT共三十三

2、頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 酶組織化學(xué)發(fā)展歷史1868年 Klebs 組化1939年 Takamatsu、Gomori 堿性磷酸酶 1940-1960年電鏡酶組織化學(xué) 1955年 Scheldon 酸性磷酸酶免疫酶組織化學(xué) 1970年 Sternberger 酶標(biāo)抗體法目前，用酶組織化學(xué)方法能顯示的酶已達(dá)100余種第五張，PPT共三十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 酶的種類 1. 氧化還原酶 2. 轉(zhuǎn)移酶 3. 水解酶 4. 裂解酶 5. 異構(gòu)酶 6. 合成酶第六張，PPT共三十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二. 酶組織化學(xué)反應(yīng)的基本知識(shí)酶的特性酶的定位酶組織化學(xué)的基本原理第七張，PPT共三十三頁(yè)，創(chuàng)作

3、于2022年6月（一）酶的特性水溶性，易擴(kuò)散，難溶或不溶于有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑不同程度降低酶的活性易受溫度影響，對(duì)熱耐受性弱對(duì)干燥耐受性強(qiáng)第八張，PPT共三十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（二）酶的定位 酶在細(xì)胞內(nèi)或超微結(jié)構(gòu)中存在的特定部位 5-核苷酸酶漿膜 ATPase肌球蛋白 細(xì)胞膜 線粒體第九張，PPT共三十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月(三）酶組化的基本條件 同時(shí)保存結(jié)構(gòu)和酶的活性 保存酶的定位，防止酶的擴(kuò)散或移位 保證反應(yīng)產(chǎn)物的特異性*影響酶活性的因素： 溫度 PH值 抑制劑 激活劑第十張，PPT共三十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（四）原理及一般原則第十一張，PPT共三十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月

4、1. 基本原理 細(xì)胞內(nèi)的酶催化分解合適的底物，生成中間產(chǎn)物（即初級(jí)反應(yīng)產(chǎn)物） 然后其中之一再與輔助物（或捕捉劑）反應(yīng)，生成有色不溶性的終反應(yīng)產(chǎn)物 該反應(yīng)產(chǎn)物沉積在原位，以顯示酶的存在第十二張，PPT共三十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第一反應(yīng)：酶促反應(yīng) 底物 初級(jí)反應(yīng)產(chǎn)物（PRP）第二反應(yīng)：捕捉反應(yīng) PRP + 捕捉劑 終反應(yīng)產(chǎn)物（FRP） 酶第十三張，PPT共三十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月* PRP彌散： 1. 底物在酶催化下水解的速度 2. PRP在緩沖液中的彌散系數(shù) 3. PRP與輔助物反應(yīng)的速度 應(yīng)選擇合適的底物和輔助物, 減少?gòu)浬?捕捉劑的濃度 （1mg/ml）第十四張，PPT共三十三頁(yè)

5、，創(chuàng)作于2022年6月2. 一般原則對(duì)組織處理, 制片過(guò)程不能影響酶的活性及分布所選底物和輔助物必須迅速, 同步穿透入組織和細(xì)胞中所選底物最好只能被一種酶催化分解所選輔助物不影響細(xì)胞內(nèi)酶的活性, 不影響其他反應(yīng)試劑的穿透性PRP必須迅速與輔助物反應(yīng), FRP為水不溶性的有色穩(wěn)定產(chǎn)物所有參與反應(yīng)的試劑均不能與其他成分吸附或結(jié)合第十五張，PPT共三十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月(五) 酶組織化學(xué)的主要步驟 1. 酶的固定 （fixation） 2. 酶的特異性反應(yīng) （specific reaction） 3. 在最適條件下, 酶反應(yīng)產(chǎn)物的沉著（precipitation） 4. 使沉著物具有可見(jiàn)性

6、（visualization）組織/細(xì)胞 制作切片 酶反應(yīng)（孵育） 顯色 封片 鏡檢第十六張，PPT共三十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（六）各步驟注意問(wèn)題檢測(cè)方法的選擇酶的保存與固定 一般新鮮組織快速冷凍, 冰凍切片 -70長(zhǎng)期保存 固定劑 1-4%多聚甲醛, 福爾馬林, 戊二醛 固定時(shí)間 固定方法: 浸泡固定 灌流固定 固定溫度: 04第十七張，PPT共三十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（六）各步驟注意問(wèn)題3. 切片制作: 切片厚度40um4. 緩沖液選擇 緩沖液用于 A. 配置固定液 B. 漂洗液 C. 配置酶反應(yīng)孵育液 選擇緩沖液應(yīng)注意 A.不能減弱目標(biāo)酶的活性 B.不能含有與捕捉機(jī)制相同的物

7、質(zhì) C. 注意漂洗用緩沖液的滲透壓 D. 漂洗用緩沖液原則上與固定液配置的緩沖液相同第十八張，PPT共三十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（六）各步驟注意問(wèn)題5. 孵育反應(yīng) A. 孵育液配置 B. 孵育的溫度和時(shí)間: 37 15-30min C. 切片孵育法 -切片孵育 -漂浮孵育第十九張，PPT共三十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（六）各步驟注意問(wèn)題6. 酶特異性對(duì)照實(shí)驗(yàn) 用酶活性抑制劑 采用無(wú)底物的孵育液 過(guò)固定或加熱 用針對(duì)目標(biāo)酶的激活劑 改變孵育液底物 選擇最適PH 酶細(xì)胞內(nèi)的定位差異第二十張，PPT共三十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（六）各步驟注意問(wèn)題7. 孵育后操作 光鏡: 酶孵育后進(jìn)行后固定

8、 脫水 封片, 鏡檢 電鏡: 孵育后, 后固定 脫水 超薄切片 后染色 電鏡檢查第二十一張，PPT共三十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（六）各步驟注意問(wèn)題8. 人為產(chǎn)物及其原因 酶或與檢測(cè)有關(guān)物質(zhì)的擴(kuò)散 最終反應(yīng)產(chǎn)物的擴(kuò)散 吸附現(xiàn)象 反應(yīng)陰性第二十二張，PPT共三十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月三. 顯示酶的組織化學(xué)方法（一）金屬離子沉淀法 一般用于顯示磷酸酶第二十三張，PPT共三十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1. 鈣鈷法-甘油磷酸鈉 磷酸酯 + Ca+ 磷酸鈣 磷酸鈷 硫化鈷（黑色沉淀） 酶底物 PRP（磷酸） + 某金屬 金屬 顯色 與底物混合液中 置換 某金屬離子結(jié)合AKPCo+硝酸鈷硫化胺酶第二

9、十四張，PPT共三十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2. Gomori 硝酸鉛法-甘油磷酸鈉 磷酸酯 + 鉛 磷酸鉛 硫化鉛（黑色沉淀） 酶底物 PRP（磷酸） 顯色反應(yīng) 與底物混合液中 金屬離子結(jié)合 ACP硫化胺 酶 直接沉著第二十五張，PPT共三十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 （二）偶氮偶聯(lián)法（偶氮色素法）1.原理底物混合液 PRP與 不溶性 重氮鹽結(jié)合 偶氮色素2. 方法 同時(shí)偶聯(lián)法 后偶聯(lián)法酶 偶氮偶聯(lián)第二十六張，PPT共三十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3. 常用底物 萘酚AS-BI 萘酚AS-D 萘酚AS-MX 萘酚AS-TR 常用重氮鹽 堅(jiān)牢蘭RR 堅(jiān)牢蘭B 堅(jiān)牢紅RC 堅(jiān)牢紅TR 堅(jiān)牢紫B

10、 六偶氮副品紅 六偶氮新品紅第二十七張，PPT共三十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月4. 舉例 -萘基磷酸鈉 磷酸氫二鈉 + -萘酚 -萘酚 + 堅(jiān)牢蘭 偶氮染料沉淀5. 應(yīng)用 可顯示ALPase, ACPase, 酯酶, 轉(zhuǎn)肽酶, 肽酶, -葡糖苷酶等磷酸酶第二十八張，PPT共三十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月(三) 聯(lián)苯胺色素法 用于顯示過(guò)氧化物酶 原理: 無(wú)色聯(lián)苯胺 有色聯(lián)苯胺過(guò)氧化物酶, H2O2 脫氫 (DAB) 聯(lián)苯胺褐第二十九張，PPT共三十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月(四) 四唑鹽法用于顯示氧化酶和脫氫酶原理: 四唑鹽或雙四唑鹽 氫離子 與 與 底物混合液 無(wú)色四唑鹽結(jié)合 紅色或蘭色的沉淀 脫氫酶 +2H被還原第三十張，PPT共三十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月常用四唑鹽種類 三苯四唑氯化物 TTC 藍(lán)四唑鹽 BT 新四唑鹽 NT 四唑氮藍(lán) NBT 四氮四唑鹽氯化物 TNBT第三十一張，PPT共三十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月(五) 靛藍(lán)反應(yīng)原理