1、高速逆流色譜分離純化抗生素課件高速逆流色譜分離純化抗生素課件 內 容 提 要一 高速逆流色譜技術簡介 二 溶劑選擇 在逆流色譜中的重要性三 高速逆流色譜技術分離純化抗生素實例高速逆流色譜分離純化抗生素課件一 高速逆流色譜技術簡介高速逆流色譜(High Speed Counter Current Chromatography, HSCCC)a 多層盤繞管；b 平衡物一 高速逆流色譜技術簡介優缺點（與HPLC等液-固色譜技術比較)優點分離原理不同：互補性強無需固體作固定相 ：不存在固體對樣品組分的吸附、玷污、變性、失活、拖尾等現象，能實現很高的回收率，節省昂貴的材料消耗和溶劑消耗（HPLC的1/1

2、0以下），運行使用的后續投入較低 溶劑極性可調：無需更換不同極性的色譜柱即可實現流動相從弱極性到強極性或相反的轉化 色譜柱無填料，柱內空間全部是有效空間，容積大：樣品負載能力強，制備量大，重現性好盤管總體積100mL， 一次分離量：0.5-2克盤管總體積3000mL，一次分離量：15-60克 優缺點（與HPLC等液-固色譜技術比較)缺點 分離效率（理論塔板數）還不高（1000) N=5.54(tR/W1/2)2一次分離所需時間還較長（以小時計） 基本原理以及溶劑系統選擇等還不完善相應的配套檢測器還不夠完善（溶劑干擾）分離后樣品的純度還需HPLC等方法測定混合溶劑的回收缺點 二 溶劑選擇在高速逆

3、流色譜中的重要性分離度Rs: 2(tR2- tR1)/W1+W2提高分離度的方法CCC &CPC: (tR2- tR1), HPLC: W1+W2二 溶劑選擇在高速逆流色譜中的重要性樣品：極性、溶解度、純度（預處理）溶劑：兩相溶劑的體積應盡量相同，揮發性較強 樣品+溶劑：沉降時間（1.5 溶劑系統：固定相保留率：75% 樣品：極性、溶解度、純度（預處理）表1 最佳溶劑體系選擇表極性較弱溶劑 最佳溶劑 極性較強溶劑heptane, CHCl3 THF H2Oheptane, toluene, MiBK, CHCl3, EtOAc ACO H2Oheptane methyl ethyl keton

4、e H2OTHF DMSO H2Otoluene, MtBE, MiBK, EtOAc MeCN H2Oheptane, toluene, CHCl3, EtOAc BuOH H2Oheptane, toluene, CHCl3, EtOAc PrOH H2Oheptane, CHCl3, EtOAc EtOH H2Oheptane, toluene, CHCl3, EtOAc, BuOH MeOH H2Oheptane, toluene, CHCl3, MiBK, EtOAc, BuOH HOAc H2OCHCl3 HCOOH H2O非水體系Heptane THF, DMF, EtOAc,

5、PrOH, EtOH MeOH, MeCN表1 最佳溶劑體系選擇表逆流色譜中常用的幾個三元溶劑體系相圖 Type 1: Chloroform / Methanol / Water應用：桿菌肽，Niphimycin，克念菌素 ，Herbicidins A, B等逆流色譜中常用的幾個三元溶劑體系相圖Type 2. Ethyl acetate / butanol / Water應用：WAP-8294A ，弱極性樣品高速逆流色譜分離純化抗生素課件Type 0: Water /Dimethylsulfoxide / Tetrahydrofuran 應用：極性強的難溶性樣品如兩性霉素B 高速逆流色譜分離純

6、化抗生素課件 CPC separation of Amphotericin B(peak 7) Water-DMSO-THF(24.6:16.2:59.2, V/V/V)高速逆流色譜分離純化抗生素課件溶劑系統的選擇與優化步驟1:采用簡單的梯度洗脫系統如水-乙腈（100:00:100）用HPLC對樣品進行極性掃描分析 ，得到樣品的極性范圍溶劑系統的選擇與優化步驟2:溶劑系統 的優化區域 化合物極性 溶劑系統 A 強極性 正己烷/正丁醇/甲醇/水 B 中極性 正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水 C 非極性 正己烷/乙腈步驟3:溶劑比例的優化 一次只改變一種溶劑的量取少量樣品在試管中進行分配系數實驗TLC或

7、HPLC測定實驗結果步驟2:溶劑系統 的優化實例：孢綠菌素(Sporaviridins)的分離Sporaviridins A1 A2 B1 B2 C1 C2 R1 H H H H OH OH R2 OH OH NH2 NH2 OH OH R3 C2H5 CH3 C2H5 CH3 C2H5 CH3 實例：孢綠菌素(Sporaviridins)的分離孢綠菌素：堿性，水溶性，抗G+菌和毛癬菌等。化學結構：含七個糖元的34元大環內酯化合物，主要有6個組分，由于結構非常相似，用HPLC等方法難以分離。溶解性：只溶于極性溶劑如水、甲醇和正丁醇等。HSCCC方法：溶劑系統選擇：正丁醇/水：主要分布在上相（正

8、丁醇），因此，必須降低孢綠菌素在上相中的溶解度。方法：加入非極性溶劑如正己烷和乙醚。正丁醇/乙醚/水：先固定正丁醇和水的體積（各10mL)，加入不同體積的乙醚，發現10：4：10（V/V/V)效果較好。再固定正丁醇/乙醚10：4，調整水的體積，確定正丁醇：乙醚：水為10：4：12。HSCCC：固定相保留率：75%，分離時間：3.5h，洗脫體積：500mL分離前粗品15mg，分離后分別得到純組分A1(1.4mg), A2(0.6mg), B1(0.7mg), B2(0.5mg), C1(1.1mg), C2(1.4mg)。孢綠菌素：堿性，水溶性，抗G+菌和毛癬菌等。HPLC separation

9、 of sporaviridins. Column: Cosmosil 5C18 (5 um, 150 mm*4.6 mm), mobile phase: methanol-1 M ammonium chloride (74:26,v/v), flow rate:1ml/min, detection: 232 nm. 高速逆流色譜分離純化抗生素課件 孢綠菌素各組分在正丁醇系統中的分配系數 分配系數（U/L）正丁醇/乙醚/水 C2 B2 A2 C1 B1 A1 10:0:10 2.96 6.41 6.65 4.87 8.81 9.09 10:3:10 0.96 2.17 2.78 1.84 3.

10、34 4.19 10:4:10 0.50 1.12 1.59 1.04 1.85 2.91 10:5:10 0.38 0.78 1.11 0.74 1.25 2.12 10:6:10 0.39 0.90 1.19 0.81 1.39 1.70 10:7:10 0.24 0.63 1.10 0.59 1.08 1.82 10:4:11 0.31 0.89 1.24 0.70 1.50 2.00 10:4:12 0.38 1.09 1.41 0.80 1.85 2.32 10:4:13 0.37 1.05 1.51 0.73 1.58 2.10 10:4:14 0.29 1.09 1.17 0.5

11、7 1.22 1.74 孢綠菌素各組分在正丁醇系統中的分配系數HPLC separatin of each sporaviridin component. Column: Cosmosil 5C18 (5 um, 150 mm*4.6mm), mobile phase: methanol-1 M ammonium choride (74:26, v/v), folw rate: 1ml/min,detection: 232 nm. 高速逆流色譜分離純化抗生素課件三 高速逆流色譜技術分離純化抗生素實例文獻報道：樣品 溶劑系統 流動相 發表時間肽類短桿菌肽A,B,C C6H6-CHCl3-MeOH

12、-H2O LP 1982多粘菌素 n-BuOH-0.04MTFA(1%glycerol) LP 1991桿菌肽 CHCl3-MeOH-H2O LP 1991 CHCl3-EtOH-MeOH-H2O LP 1991WAP-8294A n-BuOH-EtOAC-0.005M TFA LP 2001 放線菌素類放線菌素混合物 Et2O-nC6H14-MeOH-H2O UP 1986 三 高速逆流色譜技術分離純化抗生素實例樣品 溶劑系統 流動相 發表時間大環內酯類2-去甲基紅霉素 nC5H12-C6H6-AcO-iPrOH -0.01M citrate buffer(pH6.3) UP 1988尼達霉

13、素 CCl4-MeOH-0.01MK3PO4 buffer(pH7) UP 1988Tiacumicins CCl4-CHCl3-MeOH-H2O UP 1988Coloradocin CHCl3-MeOH-H2O UP 1988孢綠菌素 n-BuOH-Et2O- H2O LP 1990霉菌素 n-C6H14-EtOAc-MeOH-8%NH3.H2O LP 1991Dunaimycin n-C6H14-EtOAc-MeOH-H2O UP 1991原始霉素 CHCl3- EtOAc-MeOH-H2O UP 1992伊維菌素 n-C6H14-EtOAc-MeOH-H2O LP 1996螺旋霉素 n

14、-C6H14-EtOAc-MeOH-H2O UP 2000 樣品 樣品 溶劑系統 流動相 發表時間蒽環類道諾紅霉素衍生物 CHCl3-CH2Cl2-nC6H14- MeOH-H2O UP 1981Benzanthrins A, B CCl4-CHCl3-MeOH-H2O UP 1986Tetracenomycin D EtOAC-C6H12-MeOH-H2O UP 2005多烯類呋羅托霉素 CCl4-CHCl3-MeOH-H2O UP 1985克念菌素 CHCl3-MeOH-H2O UP 1987頭孢類Cephalosporin C & PEG600 15%W/W-(NH4)2SO4 Desa

15、cetyl Cephalosporin C 17.5%W/W LP 1995 樣品 溶樣品 溶劑系統 流動相 發表時間其它Pentalenolactone CHCl3-MeOH-H2O UP 1985 （內酯）Tirandamycin A, B n-C6H14-EtOAc-MeOH-H2O UP 1985Siderochelin A CHCl3-MeOH-H2O UP 1985A 201E CCl4-CHCl3-MeOH-H2O UP 1985Bu 2313B n-C6H14-CH2Cl2- MeOH-H2O LP 1985Sordarin derivative CH2Cl2-CF3COOH(

16、0.04%) UP 2004SCH 42282 CHCl3-MeOH-H2O UP 1998(含糖大環內酰胺) 樣品 我們的工作1. HSCCC分離海洋小單孢菌產生的黃酮類化合物 HSCCC分離前粗品FW635HPLC圖 HSCCC:儀器：同田生物TBE-300 CHCl3:CH3OH:H2O(4:3:2, V/V/V) Mobile Phase: LP，轉速 800rpm 我們的工作FW635 I 1 t1 10.75minFW635I- 2 t2 11.35minFW635 I 1 t1 10.75min2. HSCCC分離大環內酯類抗生素從土壤放線菌次級代謝產物中分離出兩個大環內酯類抗真

17、菌抗生素Ac1和Ac2, 兩者結構相似，難以用HPLC等色譜方法分離。 分離前HPLC分析圖2. HSCCC分離大環內酯類抗生素HSCCC分離 儀器：同田生物TBE-300溶劑體系選擇：正己烷：異丙醚：甲醇：水 = 2：3：6：5下相HPLC圖上相HPLC圖HSCCC分離 儀器：同田生物TBE-300計算K值和值：K值：KAc1 = 上相中Ac1的峰面積/下相中Ac1的峰面積 = 1699782/2298768 = 0.74 KAc2 = 上相中Ac2的峰面積/下相中Ac2的峰面積 = 2542940/2172947 = 1.17值 = KAc2/KAc1= 1.17/0.74 = 1.58

18、固定相：上相；保留率； 79%；流速：1mL/min 轉速：800rpm 計算K值和值：分離后Ac1HPLC圖Ac2HPLC圖分離后3 HSCCC分離環孢菌素（由茄病鐮刀菌產生）環孢菌素：A，X=H, Y=CH3；B，X=Y=H；C， X=OH, Y=CH3； D， X=Y=CH3；H， (D-MeVal11) CsA環孢菌素AB、C、D和H的化學結構3 HSCCC分離環孢菌素（由茄病鐮刀菌產生）HSCCC分離純化天然環孢菌素 儀器：同田生物TBE-300分離前分離后:石油醚/丙酮/水（3：3：2）, Mobile Phase: LP 組份 純度（%） 收率（%）第一部分 Cyclospori

19、n C 99.3 85.0第二部分 Cyclosporin B 98.7 88.5第三部分 Cyclosporin A 98.6 90.2第四部分 Cyclosporin D 98.4 86.3HSCCC分離純化天然環孢菌素 儀器：同田生物TBE-30 Cyclosporin C 10.816min Cyclosporin B 11.915min Cyclosporin A 13.493min Cyclosporin D 16.043min 高速逆流色譜分離純化抗生素課件蒸發光散射器(ELSD)在線檢測HSCCC分離蒸發光散射器(ELSD)在線檢測HSCCC分離HSCCC分離環孢菌素其它組分CsL(組分1）HSCCC分離環孢菌素其它組分HSCCC分離環孢菌素其它組分組分2結構待確定HSCCC分離環孢菌素其它組分HSCCC分離環孢菌素其它組分CsE(組分3）HSCCC分離環孢菌素其它組分HSCCC分離半合成環孢菌素異構體 異構體1化學結構HPLC分析圖HSCCC分離半合成環孢菌素異構體異構體1分離的溶劑系統選擇(石油醚/丙酮/水）HSCCC分離石油醚/丙酮/水=3:3:2, 流動相：LP固定相保留率：76%; 流速：1.5ml/min;轉速: 900rpm; =K2：K1 = 0.69/0.43=1.60 溶劑比例a上(峰面積)a下(峰面積)b上(峰面積)