1、基因克隆DNA克隆是指在體外將目的基因或DNA片段同能夠自我復(fù)制的載體DNA連接，然后將其轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞或受體生物進(jìn)行表達(dá)或進(jìn)一步研究的分子操作的過程，又稱為重組DNA技術(shù)。DNA克隆涉及一系列的分子生物學(xué)技術(shù)，如目的DNA片段的獲得、載體的選擇、各種工具酶的選用、體外重組、導(dǎo)入宿主細(xì)胞技術(shù)和重組子篩選技術(shù)等。一DNA的提取二目的DNA片段的獲得（酶切）三體外重組LB培養(yǎng)基的配制大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備載體的選擇導(dǎo)入受體細(xì)胞重組子的篩選1插入失活法實驗一DNA提取取0.5克以下的魚類組織或20ul血液：1準(zhǔn)備1.5ml離心管，加入500ul裂解液，取組織放入離心管，破碎。（常溫操作）2恒溫箱裂解

2、，55C。30min。3加等體積Tris飽和酚（酚：氯仿：異戊醇25：24：1），先顛倒混勻后靜置抽提10分鐘，離心4度12000g10分鐘。（注意酚在油層下面）4取上清（把槍頭去掉部分，注意液面。蛋白質(zhì)凝膠停留在水相及氯仿相中間，而位于上層水相中），加入等體積CI（氯仿：異戊醇24：1），先顛倒混勻后靜置抽提10分鐘，離心4度12000g10分鐘。5匯集上清，加2倍無水乙醇（-30度保存），顛倒混勻可觀察到絮狀DNA。在-30度冰箱沉淀30min。離心4度12000g10分鐘。6棄去上清，75%乙醇洗滌，7500g離心5分鐘。7重復(fù)一次上述操作。在無菌臺干燥半小時，乙醇揮發(fā)。溶解于200ul

3、ddwater。9定量DNA。裂解液的配制1ml體系200ul0.5MEDTA（PH=8.0高壓滅菌。作用抑制酶的活性。）螯合DNA酶發(fā)揮作用需要的金屬離子。50ul10%SDS（蛋白質(zhì)變性劑）10ul1MTris-cl（PH=8.0高壓滅菌）緩沖溶液5ulPK（消化）735ul滅菌超純水a(chǎn)加入水中，在磁（約需顆粒），定容至。將溶液的值調(diào)至接近時，（，）將二水乙二胺四乙酸二鈉（力攪拌器上劇烈攪拌。用調(diào)節(jié)值至分裝后高壓蒸汽滅菌。二鈉鹽加入才會溶解。實驗二目的DNA片段的獲得（酶切）獲得了包含目的基因在內(nèi)的DNA,這些DNA或來自于目的生物基因組DNA或來自目的細(xì)胞mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成的雙鏈cDNA

4、。由于基因組DNA較大，不利于克隆，必須將其處理成適合克隆的DNA小片段，常用的方法是核酸限制性內(nèi)切酶消化。儀器：臺式離心機、恒溫水浴、取液器、電泳儀、電泳槽、紫外觀測儀試劑EcoRI,HindIII酶,DNA樣品（濃度0.3|jg/|jl）1XTAE緩沖液。操作（一）EcoRI單酶切。取1支干凈、滅菌新Eppendof管，分別按下表加入（ul）滅菌水13EcoRI緩沖液2DNA43ugEcoRI110U20ul體系。37C保溫14小時，也可過夜。保溫結(jié)束后65-70C10min滅活酶（如為熱穩(wěn)定性酶，則用氯仿抽提）。4，取10pl左右的反應(yīng)液加入1卩1電泳加樣緩沖液，電泳。目的片段回收。注意

5、：1，樣品加入次序為水、緩沖液、DNA最后為酶，不應(yīng)顛倒。2,加酶步驟要在冰浴中進(jìn)行，在加酶前應(yīng)先將水、緩沖液及待切DNA混勻。3，反應(yīng)體系的體積要盡量少，要保證所加酶的體積不高于總體積的1/10。為了控制反應(yīng)體積和促進(jìn)反應(yīng)進(jìn)行，要求模板DNA的濃度應(yīng)很高，因此如底物DNA濃度過低則應(yīng)進(jìn)行真空濃縮。培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基。含有酵母提取物、蛋白胨和C其中酵母提取物為微生物提供碳源、能源和磷酸鹽，蛋白胨主要提供氮源，提供無機鹽。在配制固體培養(yǎng)基時還要加入一定量瓊脂作凝固劑。瓊脂在常用濃度下96c時溶化。瓊脂在40T時凝固（高壓滅菌融化瓊脂糖），通常不被微生物分解

6、利用。固體培養(yǎng)基中瓊脂的含量根據(jù)瓊脂的質(zhì)量和氣溫不同而有所不同。培養(yǎng)基用來培養(yǎng)細(xì)菌，將其調(diào)至中性或微堿性，利于細(xì)菌生長繁殖。器材和試劑酵母提取物，蛋白胨，a瓊脂，氨芐青霉素；錐形瓶，燒杯，量筒，玻璃棒，細(xì)菌培養(yǎng)皿，培養(yǎng)基分裝器，天平，牛角匙，高壓蒸汽滅菌鍋，試紙，記號筆，紗布，封口膠。000體系液體培養(yǎng)基：參考分子克隆實驗指南在950ml去離子水中加入:TOC o 1-5 h z胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g搖動容器直至溶質(zhì)溶解.用1mol/LNaOH（大約1ml）調(diào)pH至7.4.（適合E.coli的生長）用去離子水定容至1L.在15psi高壓下蒸汽滅菌20min.（全過程需

7、要2小時）錫箔。常溫保存。氨芐青霉素，用無菌水配制成0溶液，置C冰箱保存。LB固體培養(yǎng)基1L和液體一樣，加15g瓊脂粉。.稱量按培養(yǎng)基配方比例依次準(zhǔn)確地稱取酵母提取物、蛋白胨0、0放入燒杯中。蛋白胨很易吸潮，在稱取時動作要迅速。在燒杯中加入950ml去離子水，搖動容器直至溶質(zhì)溶解用1mol/LNaOH（800ul）調(diào)pH至7.4，再用去離子水定容至1L。轉(zhuǎn)移到試劑瓶中再加入加15g瓊脂粉。高壓滅菌。2抗生素的加入：高壓滅菌后，待培養(yǎng)基溫度降到55C時（手可觸摸）在超凈臺加入1/500體積50mg/ml抗生素，以免溫度過高導(dǎo)致抗生素失效，并充分搖勻。一定要在溫度降下之前加好抗生素，并且倒好板。（

8、類似瓊脂糖制膠）3.倒板：一般10ml倒1個板子。培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿后，打開蓋子，在紫外下照10-15分鐘。4保存：用封口膠封邊，并倒置放于4C保存，一個月內(nèi)使用。1kg=1000g1g=1000mg1mg=1000ug1ug=1000ng試驗四大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備（超凈臺）r是指細(xì)菌處于容易吸收外源的狀態(tài)叫感受態(tài)。轉(zhuǎn)化（質(zhì)?；蛞运鼮檩d體的重組子導(dǎo)入細(xì)菌的過程。其原理是細(xì)菌處于C,低滲溶液中，菌細(xì)胞膨脹成球形。轉(zhuǎn)化混合物中的形成抗酶的羥基鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)C短時間熱擊處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收復(fù)合物。將細(xì)菌放置在非選擇性液體培養(yǎng)基中保溫一段時間，促使在轉(zhuǎn)化過程中獲得的新表型得到表達(dá)，然后

9、將此細(xì)菌培養(yǎng)物涂在含氨芐青霉素的選擇性固體培養(yǎng)基上?！緝x器、材料與試劑】（一）儀器i超凈工作臺.低溫C離心機.恒溫?fù)u床C180rpm4C冰箱.恒溫水浴器二材料1氯化鈣培養(yǎng)基（液體）大腸桿菌（）離心管.吸嘴、小指管試管、培養(yǎng)皿、錐形瓶等三）試劑.溶液（分子量110.98）滅菌后C保存。氨芐青霉素，用無菌水配制成溶液，置C冰箱保存。液體培養(yǎng)基。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備從大腸桿菌平板上挑取一個單菌落接于含有液體培養(yǎng)基的試管中,7。180rpm振蕩培養(yǎng)過夜。取菌液轉(zhuǎn)接到一個含有液體培養(yǎng)基錐形瓶中，7180rpm振蕩培養(yǎng).將菌液轉(zhuǎn)移到冰預(yù)冷的C,離心5.倒出培養(yǎng)液，將管倒置離，心液管中，冰上放置回收細(xì)胞

10、。以便培養(yǎng)液流盡。用冰冷的懸浮沉淀，立即放在冰上保溫，離心，回收細(xì)胞。用冰冷的懸浮細(xì)胞務(wù)必放冰上。加入甘油至終濃度為15%；使用離心管分裝細(xì)胞，每一份。此細(xì)胞為感受態(tài)細(xì)胞。7保存?zhèn)溆?。本實驗使用生物公司感受態(tài)大腸桿菌本實驗使用克隆載體質(zhì)粒是PGEM（R）-3ZF（+）VECTOR載體的選擇基因工程的載體應(yīng)具有一些基本的性質(zhì)：1）在宿主細(xì)胞中有獨立的復(fù)制和表達(dá)的能力，這樣才能使外源重組的DNA片段得以擴增。2）分子量盡可能小，以利于在宿主細(xì)胞中有較多的拷貝，便于結(jié)合更大的外源DNA片段。同時在實驗操作中也不易被機械剪切而破壞。3）載體分子中最好具有兩個以上的容易檢測的遺傳標(biāo)記（如抗藥性標(biāo)記基因A

11、mp）,以賦予宿主細(xì)胞的不同表型特征（如對抗生素的抗性）。4）載體本身最好具有盡可能多的限制酶單一切點，為避開外源DNA片段中限制酶位點的干擾提供更大的選擇范圍。若載體上的單一酶切位點是位于檢測表型的標(biāo)記基因之內(nèi)可造成插入失活效應(yīng)，則更有利于重組子的篩選。（藍(lán)白斑法）DNA克隆常用的載體有：質(zhì)粒載體（plasmid），噬菌體載體（phage），柯斯質(zhì)粒載體（cosimid），單鏈DNA噬菌體載體（ssDNAphage），噬粒載體（phagemid）及酵母人工染色體（YAC）等。從總體上講，根據(jù)載體的使用目的，載體可以分為克隆載體，表達(dá)載體，測序載體，穿梭載體等。T7IEcoRISacIKpnl

12、AvalSmalBamHIXbalSallAcclHindiPstlSphlHindlllrttast1551136289084691222233344556PGEM（R）-3ZF（+）VECTOR酶切位點及復(fù)制起始點。本實驗使用克隆載體質(zhì)粒是PGEM(R)-3ZF(+)VECTOR產(chǎn)品介鉛產(chǎn)品規(guī)格目錄號數(shù)量價格;元;pGEm-EZK-n去er2C?22?31681pGE2邕-3Zf(-V?:a-2OueP22611&49說明pGE2-3Zff-pGE2.-SZfC-Vsztcrt由pGEl養(yǎng)-遼戟體衍生而來，含有絲狀噬菌體左的復(fù)制起點-載體上的P-半乳構(gòu)昔酶的肽編碼醫(yī)中有哆克隆位點，哆克隆位

13、點旁邊還含師n-R3H彖合酶啟動子-選用合適的Emli菌株比如口口就能通過藍(lán)白篩選的方法把s肽插入失活的重齟克隆直接鑒別出來.劣克隆位點區(qū)域含有一些單一的限制性位點，SacIK.ptc:AvalSmal.BamKLXba2;邊&Acc；EincZ;PseLSphliaEuidUIopEEH-dZi(-湘載體除了fl起點的方向外，其它都呈一樣的-因此可以作為標(biāo)堆克隆截體初體那轉(zhuǎn)錄的模板也可用于制備環(huán)化ssDNAo特點藍(lán)白謙選.能方便地鑒定重組克隆謹(jǐn)用此載襪能用于標(biāo)淮克隆單強口戈仝制備必及在與哆克嗟區(qū)_域相連的5氏和?-RN煤合酶啟動子的作用下進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄方便多克隆區(qū)域的具有劣種限制性內(nèi)切醜位點.

14、在克隆時可選_擇哆種限制性臨n操作手冊編號pGE2官-3Zf-)YsctorTshnizalBullstiiiTBOS5pGE2-3Zz(-)Vszem-T52htii:aLBulletinIB045儲存條件:載怖儲存于二眈,細(xì)弦菌株儲存于-皿戲GstiBatikSE?-.TLAzcsstisnXuiubsi：-X553C&;:.-區(qū)厲北人實驗五體外重組體外重組即體外將目的片斷和載體分子連接的過程。大多數(shù)核酸限制性內(nèi)切酶能夠切割DNA分子形成有粘性末端，用同一種酶切割載體的多克隆位點便可獲得相同的粘性末端，粘性末端彼此退火，通過T4DNA連接酶的作用便可形成重組體，此為粘末端連接。當(dāng)目的DNA

15、片斷為平端，可以直接與帶有平端載體相連，此為平末端連接，但連接效率比粘端相連差些。外源與載體分子的連接就是重組，重新組合的叫重組子。重組的分子是在連接酶的作用下，有、存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將分別經(jīng)酶切的載體分子與外源分子進(jìn)行連接。連接酶有兩種：噬菌體連接酶和大腸桿菌連接酶。兩種連接酶都有將兩個帶有相同粘性末端的分子連在一起的功能，而且噬菌體連接酶還有一種大腸桿菌連接酶沒有的特性，使兩個平末端的雙鏈分子連接起來。噬菌體連接酶催化連接反應(yīng)分為步：首先，連接酶與輔助因子形成酶復(fù)合物；然后，酶復(fù)合物再結(jié)合到具有5磷酸基和3羥基切口的上.使腺苷化；最后產(chǎn)生一個新的磷酸二酯鍵，把切口封起來。連接反應(yīng)的溫度

16、在37時有利于連接酶的活性。但在這個溫度下，粘性末端的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。實驗溫度選擇在C，連接過夜，既可最大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞后，還需對轉(zhuǎn)化菌落進(jìn)行篩選鑒定。利用a互補現(xiàn)象進(jìn)行篩選是最常用的一種鑒定方法。載體具有一段大腸桿菌P半乳糖苷酶的啟動子及其編碼肽鏈的序列，此結(jié)構(gòu)稱為c基因。c基因編碼的a肽鏈?zhǔn)?半乳糖苷酶的氨基端的短片段個氨基酸，宿主和質(zhì)粒編碼的片段各自都不具有酶活性，但它們可以通過片段互補的機制形成具有功能活性的0半乳糖苷酶分子?；蚓幋a的a肽鏈與失去了正常氨基端的0半乳糖苷酶突變體互補，這種現(xiàn)象稱為a互補。由a互補而形成的有功

17、能活性的0半乳糖苷酶，可以用溴氯吲哚0半乳糖苷顯色測定出來，它能將無色的化合物切割成半乳糖和深藍(lán)色的底物澳靛藍(lán)。因此，任何攜帶著基因的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化了染色體基因組存在著此種0半乳糖苷酶突變的大腸桿菌細(xì)胞后，便會產(chǎn)生出有功能活性的0半乳糖苷酶，在異丙基硫代0半乳糖苷誘導(dǎo)后，在含有的培養(yǎng)基平板上形成藍(lán)色菌落。而當(dāng)有外源片段插入到位于中的多克隆位點后，就會破壞a肽鏈的，從而不能合成與受體菌內(nèi)突變的0半乳糖苷酶相互補的活性a肽，而導(dǎo)致不能形成有功能活性的0半乳糖苷酶，含有重組質(zhì)粒載體的克隆是白色菌落。(一)設(shè)備，恒溫?fù)u床2恒溫水浴器3恒溫培養(yǎng)箱噬臺式離心機5低溫離心機(二，材料.胰蛋白胨.酵母提取物.氯

18、化鈉.氨芐青霉素.氯化鈣二甲基甲酰胺7限制性內(nèi)切酶連接酶大腸桿菌，PGEM(R)-3ZF(+)VECTOR，2培養(yǎng)皿，3接種針噬玻璃涂棒，5試管，氨酒精燈，鑷7子、牙簽等三，試劑(分子量98.14)高壓滅菌，常溫保存。:將溶于二甲基甲酰胺，配成，不需過濾滅菌，分裝小包裝，避光貯存于C。:取溶于雙蒸水中，再用雙蒸水補至，用|J濾膜過濾除菌，每份，貯存于C。質(zhì)粒的制備：PGEM(R)-3ZF(+)VECTOR。制備重組i在滅菌的管中，質(zhì)粒酶切。在另一無菌管中，全基因組酶切。反應(yīng)完畢后各取J酶解液做電泳分析?；蚪M做膠回收。C保存。余下的質(zhì)粒酶解液加入體積的溶液，再加倍體積的無水乙醇(C保存)C冰箱沉淀AC離心，棄上清加常溫乙醇洗沉淀物再離心，去上清，真空干燥后，加J滅菌水。連接試驗體系超凈水酶切質(zhì)粒5酶切連接酶儀上4過夜。在瓊脂糖上觀察連接產(chǎn)物，對照組是質(zhì)粒酶切產(chǎn)物和基因組酶切產(chǎn)物。實驗六轉(zhuǎn)化實驗載體DNA分子上