1、幾種抗腫瘤藥物誘導Jurkat細胞凋亡的研究【摘要】本研究評價幾種臨床常用的抗腫瘤藥物順鉑DDP、羥基喜樹堿(HPT)、高三尖杉酯堿(HHT)和米托蒽醌(IT)在白血病治療中的作用，并闡發其在誘導Jurkat細胞凋亡的作用，為白血病的臨床治療提供新的理論根據和思緒。用AnnexinV/PI雙參數流式闡發要領，檢測這幾種抗腫瘤藥物誘導Jurkat細胞凋亡和殞命的效應。結果表白：IT和HPT在加藥處置懲罰早期4小時(P0.05)和后期第8小時(P0.05)都有顯著的誘導Jurkat細胞凋亡的效應。HHT有顯著誘導Jurkat細胞凋亡的結果，但各劑量組之間無明顯差異。DDP在高濃度和長時間作用時才表

2、現較弱的細胞凋亡效應，顯著弱于前3者。種種藥物作用后均未不雅察到顯著的細胞殞命效應。結論：IT誘導Jurkat細胞凋亡的作用最明顯，AnnexinV流式闡發要領可作為一種可靠的臨床藥物挑選的要領。【關鍵詞】抗癌藥物；細胞凋亡；Jurkat細胞系；AnnexinVEffetfSeveralAnti-turDrugsnApptsisIndutininJurkatellLineKeyrdsanti-turdrug;apptsis;Jurkatellline;AnnexinV化療是腫瘤治療的一種緊張要領，新的抗腫瘤藥物也不竭地涌現。海內涵上個世紀90年代上市的抗癌藥物中化學合成藥米托蒽醌(IT)、羥基

3、脲溫順鉑(DDP)等少數幾種抗癌藥物，通過與DNA分子團結按捺核酸合成引起細胞殞命，這類藥物稱之為細胞周期非特異性藥物。本研究選用米托蒽醌(IT)、順鉑(DDP)、羥基喜樹堿(HPT)、高三尖杉酯堿(HHT)誘導Jurkat細胞凋亡，并通過AnnexinV/PI法檢測細胞凋亡及細胞殞命比例，闡發差異作用時間以及差異藥物濃度對Jurkat細胞凋亡的影響。質料和要領質料Jurkat細胞系由本實行室保存。順鉑DDP為齊魯制藥產物、羥基喜樹堿HPT為黃石飛云制藥廠產物、高三尖杉酯堿HHT為杭州民生藥業公司產物、米托蒽醌IT為浙江瑞新藥業公司產物；RPI1640為Invitrgen產物；AnnexinV

4、FIT/PI試劑盒購自晶美生物公司；貝克曼流式細胞闡發儀EliteEXP。誘導Jurkat細胞凋亡Jurkat細胞在5%2孵箱造就至對數生恒久，鏡下計數為1106/l，參加24孔板，每孔1l細胞懸液。用無血清細胞懸液將順鉑、羥基喜樹堿、高三尖杉酯堿和米托蒽醌藥物配制成1g/l溶液；每組藥物別離設4個濃度：12.5、25、50、100g/l；別離參加24孔造就板，作3個復孔。置于52孵箱造就。AnnexinV/PI流式雙參數闡發1-3別離于參加藥物作用2、4和8小時，汲取造就細胞懸液，用4預冷的PBS洗細胞2次，用250l團結緩沖液重懸細胞，使其濃度為1106/l；取100l細胞懸液，加5lAn

5、nexinV/FIT和10l(20g/l)的碘化丙錠；混勻后室溫避光孵育15分鐘；用PBS洗滌2次，舉行流式細胞儀FAS闡發。AnnexinV-FIT/PI雙參數舉行調試，以此條件舉行細胞凋亡和細胞壞死率檢測。圖1-5橫坐標表現熒光強度，縱坐標表現細胞數，圖中兩個峰中的左邊峰表現陰性峰，右峰表現凋亡峰，右峰曲線下面積越大凋亡就越多。按照所測數據盤算細胞凋亡率和繼發性壞死率。統計學闡發各組細胞凋亡率均取3個樣本的均值，以XSD表現，多個均數的兩兩比力接納?中國醫學百科全書醫學統計學?統計軟件包(第三版)PES3.1軟件舉行查驗。結果DDP對Jurkat細胞的誘導凋亡作用DDP各劑量組與比擬組未處

6、置懲罰組比擬，在其劑量為12.5g/l時，各個作用時間點上Jurkat細胞凋亡率均無顯著變革；劑量為25g/l和50g/l時，在2小時和4小時Jurkat細胞凋亡率也無顯著變革，而在作用8小不時Jurkat細胞凋亡率才有顯著增高，別離為13.6%和23.9%，與比擬組比擬有明顯差異P0.05。當DDP藥物濃度增大至100g/l時，作用2小時和4小不時，Jurkat細胞凋亡率無變革，在8小不時Jurkat細胞凋亡率為19.9%，與50g/l劑量比擬，誘導細胞凋亡率不單沒有顯著差異，并且有所低落圖1，這表白DDP的作用有藥物飽和效應。HHT對Jurkat細胞的誘導凋亡作用HHT各劑量組的細胞凋亡率

7、與比擬組未處置懲罰組比擬均有顯著增高P0.05。Jurkat細胞凋亡率與藥物劑量干系不顯著，但與作用時間顯著成正比。12.5g/lHHT作用2、4和8小不時Jurkat細胞凋亡率別離是4.9%、20.4%和35.4%(P0.05)；25g/lHHT時別離為5.5%、12.1%和27.2%；50g/lHHT時別離為5.8%、12.2%和33.0%；100g/lHHT時別離是5.7%，12.1%和35.0%(P0.05)。差異藥物濃度HHT在同一時間點之間誘導Jurkat細胞凋亡率沒有顯著差異圖2。IT對Jurkat細胞的誘導凋亡作用與比擬組未處置懲罰組比擬，IT各劑量組在作用2小不時Jurkat

8、細胞凋亡率無顯著差異，但隨作用時間延伸均有顯著增高P0.05。12.5g/l劑量組作用2、4和8小不時Jurkat細胞凋亡率別離是4.2%、20.5%和52.4%(P0.05)，25g/l組別離為4.9%、30.1%和68.9%，50g/l組別離是7.2%、37.9%和81.8%(P0.05)圖3，100g/l組別離為6.6%，41.5%和84.1%，各作用時間點之間差異均有明顯差異P0.05圖4。Jurkat細胞凋亡率在藥物低劑量時隨劑量增大顯著增高；100g/l組作用效應與50g/l劑量組沒有顯著差異，表現有劑量飽和效應。HPT對Jurkat細胞的誘導凋亡作用HPT各劑量組與比擬組未處置懲

9、罰組比擬，Jurkat細胞凋亡率均有顯著增高P0.05，Jurkat細胞凋亡率隨藥物劑量增大和時間延伸而顯著增高，12.5g/lHPT劑量組作用2、4和8小不時Jurkat細胞凋亡率別離是3.4%、20.9%和30.3%(P0.05)；而25g/l組別離為3.7%、19.1%和30.3%；50g/l組別離是5.9%、23.8%和44.6%(P0.05)，100g/l組別離是3.0%、15.8%和55.7%(P0.05)。HPT雷同劑量差異作用時間點的Jurkat細胞凋亡率均有明顯差異(P0.05)圖5；HPT差異劑量同一作用時間點的誘導Jurkat細胞凋亡率在2小時與4小時間沒有明顯差異，而兩

10、者與8小時作用比擬均有明顯差異(P0.05)。各藥物組間誘導Jurkat細胞凋亡的比力順鉑、高三尖杉酯、米托蒽醌和羥基喜樹堿4種藥物間差異劑量組在作用2小不時誘導Jurkat細胞的凋亡率無顯著差異，在4小時和8小不時各組間均有明顯差異(P0.05，圖6。藥物誘導Jurkat細胞凋亡的強度依次為IT、HPT、HHT和DDP。各藥物組誘導的Jurkat細胞殞命各藥物組均未產生顯著的誘導Jurkat細胞殞命的征象。DDP誘導Jurkat細胞殞命的效應隨藥物濃度的增高和作用時間的延伸而加強，在藥物濃度為25、50和100g/l，作用8小不時誘導的Jurkat細胞殞命率別離為7.6%、9.9%和10.3

11、%。12.5g/lHHT短時間和長時間作用時細胞殞命效應均不顯著，只在藥物濃度為25、50和100g/l，作用4小不時表現薄弱的誘導Jurkat細胞殞命的效應，細胞殞命率別離為6.6%、5.2%和6.6%。IT只在低藥物濃度12.5g/l和25g/l作用8小不時細胞殞命率別離為4.0%和4.5%圖7，藥物濃度增高時卻并未產生顯著的細胞殞命。而HPT那么只在增高藥物濃度至50g/l和100g/l，長時間作用8小不時才產生細胞殞命，細胞殞命率別離為5.0%和9.6%。詳見附表。Table.Effetfanti-turdrugsnapptsisfJurkatells(略)討論多種化療藥物可以誘導腫瘤

12、細胞凋亡，如米托蒽醌(IT)、順鉑(DDP)、羥基喜樹堿(HPT)，高三尖杉酯堿(HHT)等。有文獻報道米托蒽醌可誘導人髓系白血病細胞凋亡4，并漸漸用于白血病的治療。DDP曾用于治療卵巢癌、前線腺癌、睪丸癌、肺癌、鼻咽癌、食道癌、惡性淋巴瘤、乳腺癌、頭頸部鱗癌、甲狀腺癌及成骨血瘤等多種實體腫瘤，均表現出精良的療效，其機制是損傷線粒體成效、使DNA斷裂和按捺細胞發育5，比來有文獻報道，DDP可通過引起D95聚攏成簇進而誘導凋亡6。然而，其較強的腎毒性限定了其臨床利用。羥基喜樹堿(HPT)和高三尖杉脂堿(HHT)均是從植物中提取的生物堿，具有明顯的抗癌活性。HPT在臨床上重要用于結腸、直腸癌、肺癌

13、及白血病等惡性腫瘤的治療，也有很強的誘導人白血病細胞和消化體系腫瘤細胞凋亡的作用7，8。臨床證實，HHT對急性粒細胞白血并急性單核細胞白血并紅系白血病等種種急性非淋巴性白血病及慢性粒細胞白血病均有較好的療效。研究表白，HHT可誘導人野生型P53白血病細胞、HL-60，K562和Jurkat細胞等凋亡，誘導機制大概是通過粉碎或改變線粒體跨膜電位或細胞色素、AIF的開釋和aspase的活化等9-11，同時另有誘導白血病細胞分化和按捺轉移的作用12。本研究按照比年的研究結果和臨床白血病治療的題目和近況，用可靠的AnnexinV/PI流式雙參數闡發要領，比力了幾種抗腫瘤藥物誘導Jurkat細胞凋亡的作

14、用，為辦理臨床白血病治療的題目提供新的根據和思緒。細胞產生凋亡的早期，膜磷脂酰絲氨酸PS由脂膜內側翻向外側。AnnexinV是一種磷脂團結卵白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細胞外側表露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜團結。因此，AnnexinV被作為檢測細胞早期凋亡的敏捷指標之一。在細胞產生凋亡時，膜磷脂酰絲氨酸外翻的產生早于細胞核的變革。本研究團結斷定細胞死活的核酸染料PI，利用AnnexinV/PI流式雙參數闡發來區分凋亡細胞與殞命細胞，檢測幾種實行藥物誘導Jurkat細胞凋亡和殞命的效應。本研究結果表現，各藥物均表現差異程度的誘導Jurkat細胞凋亡的效應。DDP小劑量時無顯著

15、誘導Jurkat細胞凋亡的效應，只在大劑量長時間作用時才表現出誘導Jurkat細胞凋亡效應。HHT和IT誘導Jurkat細胞凋亡效應均隨藥物劑量增大顯著增高，但HHT各劑量組在差異時間點細胞凋亡率無顯著變革，IT誘導Jurkat細胞凋亡效應隨藥物作用時間延伸而顯著加強。HPT組差異藥物劑量同一作用時間點誘導Jurkat細胞凋亡率在2小時與4小時間沒有明顯差異，但作用8小不時均有明顯差異。IT誘導Jurkat細胞凋亡效應的強度顯著強于其他3種藥物，DDP只表現薄弱的細胞凋亡效應。前3種藥物隨劑量增大均表現出藥物飽和效應。各藥物組均未表現顯著的誘導Jurkat細胞殞命的變革。DDP和HPT只在高藥物濃度長時間作用時才表現薄弱的細胞殞命效應。HHT短時間和長時間作用時細胞殞命效應均不顯著，只在藥物作用4小不時表現薄弱的誘導Jurkat細胞殞命的效應。IT卻只在