1、Word - 6 -核酸適體技術在食品安全分析中的應用 摘 要 核酸適體（Aptamer）是經體外篩選技術（SELEX）篩選出的能特異結合蛋白質或另外小分子物質的寡聚核苷酸片段，對可結合的配體有嚴格的識別本事和高度的親和力。經過十幾年的進展，SELEX技術已經成為一種重要的討論手段和工具，被廣泛應用到分子生物學、基因組學、臨床醫學等領域。高通量篩選的技術特征與Aptamer精確識別、易體外合成與修飾等特性，使得Aptamer在分析化學與生物醫藥討論方面具有廣大的應用前景。本文對提升篩選效率和效果為任務的核酸適體篩選技術新發展、核酸適體技術在食品平安分析中的應用舉行了回顧，展望了核酸適體在食品平

2、安分析上的應用前景。 關鍵詞 核酸適體； 指數富集配體系統進化； 食品平安； 殘留分析;有機小分子，評述 2022-12-26收稿；2022-03-20接受 本文系廈門市科技方案項目（No.3502Z20222022）；福建省自然科學基金項目（No.2022J0107）；國家質檢總局科技方案項目（No.2022IK150）；國家重點基礎討論進展方案（973）項目（No.2022CB732400）資助 * E-mail:Z;X 1 引 言 1953年，DNA雙螺旋結構的提出，是現代分子生物學出生的里程碑1,2。自此對于核酸生物大分子的討論進入了一個嶄新的時代。1990年，兩個自立的討論團隊分離在

3、Nature3和Science4上發表有關體外篩選特定靶物質結合性核酸的討論論文，并命名此種核酸為Aptamer，它由拉丁語aptus（意為“匹配”）和希臘語詞綴meros組成，中文譯為“適體”、“適配子“或“核酸適體”。核酸適體的篩選技術被稱為“配體指數富集系統進化”（Systematic evolution of ligands by exponential eichment, SELEX）4，它是以組合化學技術、PCR技術以及基因克隆測序技術等為基礎的整合技術。隨著近年來現代分子生物學技術的迅速進展，SELEX技術也不斷創新，浮現了許多具有不同應用目的的核酸適體篩選辦法5, 6。這些辦法

4、極大地增進了核酸適體科學的迅速進展。經受了20年，核酸適體科學日漸成熟，在生物學和醫學中的應用已受到廣泛關注，如分子識別7,8、藥物篩選7,8、靶點鑒定8,9、基因表述調控9、醫學成像9、臨床診斷9,10及疾病治療10等。不僅如此，核酸適體作為一種靶物質結合分子，在分析科學領域也呈現出巨大的應用潛力，特殊是在小分子化物的分別分析中具有其獨特的應用優勢。 食品平安問題在21世紀已經成為全世界關注的重大問題，對消費者的身體健康產生了重大的影響。因為食品種類豐盛，食品中檢測的有毒有害物質種類和組分繁多，需要檢測的物質質量極低，樣品中待檢物的濃度通常為 SymbolmA g和ng級，甚至pg 級。除此

5、之外，許多檢測物除需檢測物質本身，還涉及其衍生物和降解物測定。因此食品檢測要求檢測辦法越發精確、迅速、便利。核酸適體具有靶分子廣、特異性強、敏捷度高、檢測成本低、平安牢靠等優點，在食品平安檢測中有著良好的應用前景。本文對SELEX技術原理、核酸適體篩選技術及在食品平安分析中的應用發展舉行了綜述。 2 SELEX技術的基本原理 SELEX技術的總體思路是從利用組合化學原理設計合成的隨機寡核苷酸庫（約10151018 種核酸分子）中， 經多輪篩選和指數富集， 終于得到任務核酸適體11。作為核酸適體的篩選技術，SELEX過程起始于組合化學合成的隨機寡核苷酸庫（RNA或DNA）。庫中核酸分子的結構特征

6、是：兩端為固定序列，中間為隨機序列。隨機序列（區）給予每個核酸分子不同的空間結構，打算著隨機寡核苷酸庫的庫容量及多樣性。理論上， 假如寡核苷酸中的隨機序列由n個堿基組成，庫容量則為4n。若再考慮人為塑造的修飾文庫，隨機序列的多樣性則更為豐盛6,12。SELEX技術是分子進化工程技術的一種，技術流程包含了類似于達爾文進化理論的3個過程：自發突變、自然挑選和大量增殖13。 SELEX篩選核酸適體的基本過程如圖1所示6。主要包括以下幾個步驟1416：（1）運用分子生物學技術，人工設計并合成容量浩大的（10151018）單鏈隨機寡核苷酸（DNA或RNA）序列的文庫， 圖1 SELEX基本過程 Fig.

7、1 In vitro selection of target-specific aptamers using systematic evolution of ligants by exponential eichment （SELEX） technique 其中隨機寡核苷酸序列長度普通在1560個堿基之間，隨機序列兩端固定在用于PCR擴增及另外酶學反應相關引物的結合位點。隨機文庫在特定緩沖體系下與靶分子溫育；（2）利用特定分別辦法如離心法、濾膜法、磁珠法、毛細管電泳法、柱層析等實現與靶分子結合的核酸序列和非結合的核酸序列間的分別；（3）對分別出的結合核酸序列舉行反篩選，進一步排解掉非特異性結合

8、的核酸序列；（4）對得到的特異性結合的核酸序列舉行PCR擴增，形成次一級核酸庫，通過生成的次一級核酸庫重復步驟（2）和（3），隨著每一輪篩選條件的不斷提升,與靶任務高度特異結合的DNA或RNA分子呈指數增長。而親和力低的序列逐步被淘汰，直到得到核酸文庫對靶分子的解離常數達到任務值；（5）對所得到的核酸序列舉行克隆測序，鑒定測定序列與其靶分子結合的特異性和親和力。 第6期徐敦明等： 核酸適體技術在食品平安分析中的應用 3 核酸適體篩選技術 SELEX技術的特征是將分子的進化過程轉移到體外舉行，但是在核酸適體的實際篩選中，SELEX往往受到篩選環境及技術本身限制，影響篩選效果和篩選效率。近年來，

9、討論人員在傳統SELEX基礎上，進展出許多適合不同目的的新型SELEX技術。這些SELEX技術的浮現，極大地推進了核酸適體技術在各學科領域中的應用和進展。 3.1 毛細管電泳SELEX（Capillary electrophoresis SELEX, CE-SELEX） SELEX技術中靶分子結合核酸與游離核酸的分別至關重要，是限制經典SELEX 技術進展的一個難點。Mendonsa和Bowser（2022）按照核酸適體與靶分子結合可以使其構象和質量轉變并導致其電泳行為顯著變化的特性，通過毛細管電泳勝利地將上述兩種不同狀態的核酸分子有效分別17。毛細管電泳技術（CE）的應用對于提升SELEX的篩選效率具有重要的意義。由于毛細管電泳能迅速、高效地從未結合的DNA文庫中分別出靶分子-核酸適體復合物，因此通過CE-SELEX 辦法僅需24輪篩選就可得到靶分子的特異核酸適體。Drabovich 等（2022）按照ECEEM（Equilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures）的特點，通過不同親和力核酸適體的遷移率差異，收集不同時相的平衡混合物，僅3輪篩選就得到識別MutS 蛋白的核酸適體18