1、肺炎鏈球菌SpxB蛋白的亞細胞定位及保守性分析王哲，王建敏，馬峰，張帥，黃遠帥，張雪梅(400016 重慶，重慶醫(yī)科大學檢驗醫(yī)學院 臨床檢驗診斷學教育部重點實驗室)摘 要 目的 鑒定肺炎鏈球菌中spxB基因編碼的丙酮酸氧化酶的亞細胞定位和保守性表達。方法 利用PCR方法擴增肺炎鏈球菌D39菌株的spxB基因全長序列，并將其整合至表達載體pET-28a(+)，經(jīng)測序鑒定后，將重組質粒轉化至大腸埃希菌BL21(DE3)，以IPTG誘導表達含有His標簽的rSpxB蛋白，經(jīng)Ni-NTA親和層析柱純化后，使用SDS鑒定蛋白純度，采用一種商品丙酮酸氧化酶活性質控方法鑒定其酶活性。以rSpxB蛋白免疫昆明

2、小鼠獲得其多克隆抗體。采用ELISA檢測多克隆抗體效價，采用Western blot鑒定抗體的特異性和蛋白的保守性表達。采用流式細胞術鑒定SpxB的亞細胞定位。結果 實現(xiàn)了具有丙酮酸氧化酶活性SpxB蛋白的可溶性表達，該蛋白免疫小鼠后獲得高效價特異的抗SpxB蛋白抗血清，Western blot鑒定顯示SpxB蛋白在1、2、4、6B、14、19F和23F等血清型肺炎鏈球菌均有表達，流式細胞術檢測顯示SpxB蛋白的熒光信號較陰性對照有右移，但較陽性對照的熒光信號弱很多。結論 肺炎鏈球菌spxB基因編碼的丙酮酸氧化酶在肺炎鏈球菌中有保守表達，且主要表達于胞內(nèi)。 本研究為后續(xù)肺炎鏈球菌spxB基因及

3、其產(chǎn)物作用機制研究打下基礎。關鍵詞 肺炎鏈球菌；丙酮酸氧化酶；亞細胞定位；保守性中圖分類號 R378.14 文獻標識碼 ASubcellular localization and conservation of SpxB in Steptococcus PneumoniaeWang Zhe, Wang Jianmin, Ma Feng, Zhang Shuai, Huang Yuanshuai, Zhang Xuemei (Department of Laboratory Medicine, Chongqing Medical University , Chongqing ,400016, C

4、hina)Abstract Objective To investigate subcellular localization of pyruvate oxidase encoded by spxB gene from Steptococcus Pneumoniae(S.pn),and its conservation in different serotypes of S. pn. Methods The full-length spxB gene of S.pn D39 was amplified by PCR with specific primers, and then inserte

5、d into the pET-28a(+) expression vector, the recombinant plasmid pET-28a(+)-spxB was transformed to E.coli BL21(DE3) and after being confirmed by sequencing, induced with IPTG and expressed His-tagged rSpxB recombinant protein, after purified by affinity chromatography column, the protein HYPERLINK

6、app:ds:purity purity was checked by SDS, and the enzyme activity assay was performed in a commercial pyruvate oxidase quality control method. The KM mice were immunized with the purified rSpxB protein to obtain polyclonal antibody. The antibody titers were determined by ELISA, specificity and protei

7、n conservation were determined by Western blot. And this antibody was used for subcellular localization of SpxB in S.pn by Flow Cytometry. Results Realized high and soluble expression of pyruvate oxidase with enzyme activity, antiserum of high titer against SpxB protein was obtained from KM mice, We

8、stern Blot showed its specificity to SpxB and the conservation of SpxB in 1, 2, 4, 6B, 14, 19F, 23F serotype of S. pn，F(xiàn)low Cytometry result showed the fluorescence signal of SpxB had shifted to the right compared to the negative control , but still much weaker than the positive control. Conclusion P

9、yruvate oxidase encoded by spxB was highly conserved in 7 different serotypes of S. pn, and mostly expressed intracellular. This work had laid a foundation for subsequent research of S.pn spxB gene and its product.Key words Steptococcus pneumoniae; SpxB; subcellular localization; conservation.Suppor

10、ted by Natural Science Foundation of Chongqing（CSTC,2011BB5137）. Corresponding author: Zhang Xuemei, Tel: 86-23-68485216, E-mail: 作者簡介 王哲，男，碩士研究生在讀，初級檢驗師，分子微生物研究方向 聯(lián)系電話E-mail: 通信作者 張雪梅，電話：(023)68485216，E-mail: 肺炎鏈球菌是一種導致嚴重感染和社區(qū)獲得性感染的主要病原菌，可導致中耳炎、鼻竇炎、菌血癥、肺炎和腦膜炎 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CIT

11、E.DATA HYPERLINK l _ENREF_1 o Domenech de Celles, 2011 #5 1。世界衛(wèi)生組織估計在全球范圍內(nèi)，每年有160萬人死于肺炎鏈球菌引起的感染 ADDIN EN.CITE Levine20067277017Levine, Orin S.O'Brien, Katherine L.Knoll, MariaAdegbola, Richard A.Black, StevenCherian, ThomasDagan, RonGoldblatt, DavidGrange, AdenikeGreenwood, BrianHennessy, TomKl

12、ugman, Keith P.Madhi, Shabir A.Mulholland, KimNohynek, HannaSantosham, MathuramSaha, Samir K.Scott, J. AnthonySow, SambaWhitney, Cynthia G.Cutts, FelicityPneumococcal vaccination in developing countriesThe LancetThe Lancet1880-1882367952620060140673610.1016/s0140-6736(06)68703-5 HYPERLINK l _ENREF_2

13、 o Levine, 2006 #7 2。然而肺炎鏈球菌的致病機制仍不十分清楚，毒力因子的研究一直是該領域的研究熱點和重點。丙酮酸氧化酶是一種將丙酮酸分解為乙酰磷酸、H2O2和CO2的酶，近年來的研究顯示，丙酮酸氧化酶的這種產(chǎn)H2O2的能力影響細菌的致病，是一種新的毒力因子 ADDIN EN.CITE Spellerberg1996593595917Spellerberg, BarbaraCundell, Diana R.Sandros, JensPearce, Barbara J.Idnpn-Heikkil, IlonaRosenow, CarstenMasure, H. RobertPyr

14、uvate oxidase, as a determinant of virulence in Streptococcus pneumoniaeMolecular MicrobiologyMol MicrobiolMolecular microbiology803-8131941996Blackwell Science Ltd1365-2958/10.1046/j.1365-2958.1996.425954.x10.1046/j.1365-2958.1996.425954.x HYPERLINK l _ENREF_3 o Spellerberg, 1996 #59 3。目前發(fā)現(xiàn)，肺炎鏈球菌中只

15、有一種丙酮酸氧化酶，由spxB基因編碼。研究顯示spxB基因產(chǎn)物丙酮酸氧化酶在肺炎鏈球菌生長的穩(wěn)定期釋放的H2O2導致細菌自溶。并有利于其在鼻咽部的定植 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA HYPERLINK l _ENREF_4 o Regev-Yochay, 2007 #2 4。另有研究還顯示SpxB蛋白影響肺炎鏈球菌的轉化 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA HYPERLINK l _ENREF_5 o Battig, 2008 #1 5，而轉化不僅影響細菌的毒力而且在細菌的遺傳變異中發(fā)揮了重要作用 ADDIN EN.CITE

16、ADDIN EN.CITE.DATA HYPERLINK l _ENREF_6 o Johnston, 2013 #44 6。由于尚不清楚SpxB蛋白的基本表達情況，如亞細胞定位、是否在肺炎鏈球菌的中有保守表達等，對于SpxB蛋白在細菌轉化及毒力中如何發(fā)揮功能仍不完全清楚。因此，本研究擬對肺炎鏈球菌spxB基因編碼的產(chǎn)物丙酮酸氧化酶進行可溶性表達和純化，并通過體外檢測方法鑒定其丙酮酸氧化酶活性，采用自制的特異性較高的SpxB蛋白多克隆抗體，鑒定其在各型肺炎鏈球菌中的保守性及亞細胞定位，為進一步研究SpxB蛋白對肺炎鏈球菌轉化和毒力影響的機制奠定基礎。1 材料與方法 實驗動物 實驗小鼠 6-8周

17、齡雌性KM小鼠，購于重慶醫(yī)科大學實驗動物中心，SPF 級，實驗動物使用許可證號為SYXK（渝） 2007-0001。 質粒、菌株和試劑原核表達質粒pET-28a(+)，大腸埃希菌DH5、BL21（DE3）感受態(tài)為本課題組保存；肺炎鏈球菌NCTC7466（D39， 2型血清型）菌株購于英國典型菌種保藏中心（NCTC）、TIGR4（4型血清型）菌株購于美國典型微生物菌種保藏中心（ATCC）、CMCC(B)31109(1型血清型)、CMCC(B)31207(6B血清型)、CMCC(B)31614(14血清型)、CMCC(B)31693(19F血清型)、CMCC(B)31759(23F血清型)菌株購于

18、中國醫(yī)學細菌保藏管理中心（CMCC）。培養(yǎng)基為C + Y 半合成培養(yǎng)基。基因組DNA提取試劑盒（天根）；質粒提取試劑盒（Omega）；DNA片段純化試劑盒（Roche）;限制性內(nèi)切酶EcoR I、Xho I、PrimeStar 高保真 DNA 聚合酶和 DNA marker DL2000 (Takara)；T4連接酶（Promega）；異丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA)(Sigma)；HRP標記羊抗鼠IgG（中衫金橋）；Ni-NTA親和層析柱（Novagen）；丙酮酸氧化酶T45（ASAHI KASEI）；引物合成及測序（北京華大）。 目的基

19、因spxB的PCR擴增 S.pn菌株D39在C+Y培養(yǎng)基生長至對數(shù)生長中期，按照試劑盒說明書提取細菌基因組DNA，用于擴增spxB基因片段。由GenBank中S.pn D39 spxB基因序列（1776bp），使用Primer Premier5.0軟件設計引物：P1:5- CCGGAATTCATGACTCAAGGGAAAATTACTGCAT-3，含EcoRI酶切位點；P2：5- CCGCTCGAGTTATTTAATTGCGCGTGATTGCAAT-3，含Xho I酶切位點。引物由北京六合華大基因科技公司合成。PCR擴增體系為50l：5x buffer( 含 Mg2+) 10. 0l, dNTP

20、( 10 mmol/ L) 4. 0l, P1 ( 10 pmol/ L) 1. 0l, P2 ( 10pmol/ L) 1. 0l, S . pn D39基因組DNA 1.0l, PrimeStar 0.5l，ddH2O 32. 5l。按以下條件進行PCR擴增: 98C 10秒、58C 15秒、72C 2分鐘、反應30個循環(huán)后72C延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，用DNA純化試劑盒純化，保存于-20C。1.4 構建pET-28a(+)-spxB重組質粒 純化產(chǎn)物spxB片段與表達載體pET-28a(+)分別經(jīng)EcoR I和Xho I限制性內(nèi)切酶雙酶切后，使用T4 DNA連

21、接酶進行體外連接，之后轉化至感受態(tài)細胞DH5中，在50g/ml的卡那霉素抗性（Kan+）LB平板上挑取菌落PCR及雙酶切鑒定均為陽性的克隆送華大基因測序鑒定。 重組spxB蛋白的表達和純化 將測序正確的重組質粒pET-28a(+)-spxB轉化到BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，單個菌落接種至LB培養(yǎng)基（含有50g/ml卡那霉素）中，37C振蕩培養(yǎng)過夜，再將培養(yǎng)液按1:50接種至含有50g/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)至OD600=0.40.5時加IPTG使其終濃度為0.2mmol/L，20C誘導培養(yǎng)8小時。離心收集誘導菌，使用結合緩沖液（500mmol/L NaCl,20 mmol/L

22、 Tris-HCl，pH 8.0）重懸菌體沉淀，超聲破菌后低溫離心20分鐘，收集上清液，經(jīng)0.22m濾膜過濾后加入Ni-NTA親和層析柱，依次使用10、20、40、50、60、80mmol/L咪唑濃度的洗滌緩沖液洗滌，最后用洗脫緩沖液（500mmol/L NaCl,20 mmol/L Tris-HCl，500mmol/L咪唑，pH 8.0）進行目的蛋白的洗脫。收集洗脫蛋白，用SDS分析純化情況后用PBS超濾除鹽，Bradford法測蛋白濃度。 檢測純化表達的SpxB丙酮酸氧化酶活性使用ASAHI KASEI公司商品化丙酮酸氧化酶T-45酶活性的質控方法進行SpxB丙酮酸氧化酶活性的檢測。將反應

23、混合液I、底物液和反應混合液II按照6:1:3混合，精確吸取1.0ml到大EP管中，預孵育37C。5分鐘后，加入20ul 酶溶液（包含2.5 ng T-45或純化表達的13.4 ng SpxB蛋白，陰性對照為表達純化的SpxB 42C熱激15分鐘，空白對照只含酶緩沖液），混合后開始在37C孵育，開始反應。反應開始后10min，加2.0ml終止液來終止反應。5分鐘后，測量565nm處吸光度值。每次試驗做三個平行孔并重復兩次。 制備SpxB蛋白多克隆抗體 6-8周齡雌性KM小鼠7只，免疫前取尾靜脈血作為陰性對照血清。初次免疫時將純化獲得的SpxB蛋白與弗氏完全佐劑等量乳化后, 第 0 天腹腔注射免

24、疫 KM小鼠, 每只小鼠蛋白抗原用量為 200g。初次免疫后第 3天、21 天分別以減半劑量的SpxB蛋白抗原加弗氏不完全佐劑腹腔加強免疫兩次,第三次免疫后 7 天摘除KM小鼠眼球，分離小鼠血清, -20C保存。 ELISA檢測抗SpxB多克隆抗體效價 純化后的SpxB蛋白使用抗原包被液稀釋至5ug/ml,每孔200ul包被96孔板，4C過夜；封閉2h后分別加入100ul從1:10000開始倍比稀釋抗血清，以免疫前的KM小鼠血清為陰性對照，37C孵育1h；洗板后加入1:5000稀釋的HRP酶標羊抗鼠IgG，37C孵育1h;TMB顯色15分鐘后酶標儀測定A450值，以2.1倍于陰性對照血清吸光度

25、值的抗體最高稀釋倍數(shù)作為抗體的效價。 Western blot檢測抗SpxB多克隆抗體特異性 將7種不同血清型的S.pn在C+Y中增菌至對數(shù)生長中期（OD600=0.5左右），各取2ml菌液離心后沉淀用PBS洗滌，1X上樣緩沖液重懸后煮沸10分鐘裂解細菌。全菌裂解物經(jīng)SDS電泳分離后轉膜。使用獲得的抗SpxB多克隆抗體為一抗（1:1000），羊抗鼠HRP-IgG為酶標二抗（1:5000），化學發(fā)光檢測。SpxB蛋白亞細胞定位S.pn R6(S.pn D39的無莢膜天然突變株，為本實驗室保存)增菌至對數(shù)生長期，離心收菌，用預冷的PBS洗兩次后，取1107CFU細菌重懸于100L 5% FBS中，

26、加入1L抗SpxB多克隆抗體（1:1000稀釋），以抗磷壁酸（TA）抗體作為陽性對照，未免疫小鼠血清為陰性對照，抗VicK抗體為半陰性對照， 37孵育1h后，PBS洗兩次，加入PE標記的羊抗鼠IgG，4避光孵育50分鐘，PBS洗三次，進行檢測流式細胞術進行檢測。 結果2.1 目的基因spxB的PCR擴增PCR產(chǎn)物5l置于1%瓊脂糖凝膠電泳，分子量約1800bp處有清晰條帶，與spxB全長加酶切位點和保護堿基后大小一致。（圖1）圖1 spxB基因的PCR擴增結果M：Marker；1：spxB基因PCR產(chǎn)物 pET-28a(+)-spxB重組質粒的構建與鑒定spxB基因PCR擴增產(chǎn)物與表達載體pE

27、T-28a(+)連接，所得陽性克隆經(jīng)菌落PCR和質粒雙酶切鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)的條帶與目的片段大小一致（圖2）。陽性克隆送往華大基因測序，測序結果spxB基因片段與GenBank公布序列一致，證明重組質粒構建成功。圖2 重組質粒pET-28a(+)-spxB的PCR及雙酶切鑒定M:Marker 1和2: pET-28a(+)-spxB經(jīng)EcoRI及Xho I的雙酶切產(chǎn)物 3： pET-28a(+)經(jīng)EcoRI及Xho I的雙酶切產(chǎn)物 4: 質粒pET-28a(+)-spxB的PCR產(chǎn)物 SpxB重組蛋白的誘導表達及純化SDS結果顯示（圖3），含有重組質粒pET-28a(+)-spxB的

28、E.coli BL21(DE3)菌株經(jīng)IPTG誘導后，與轉化未誘導菌及空載菌E.coli BL21(DE3)相比，在分子量約65kD處有一條明顯增粗的蛋白條帶，與預期的SpxB蛋白大小一致。超聲破菌后取上清經(jīng)Ni-NTA樹脂親和層析純化，超濾除鹽后經(jīng)SDS發(fā)現(xiàn)純化所得SpxB蛋白純度較高，純度達90%以上，可用于免疫等后續(xù)實驗。圖a圖b圖3 重組蛋白SpxB的表達及純化(圖a)M: Marker 1：誘導pET-28a(+)-spxB重組菌株 2：未誘導pET-28a(+)-spxB重組菌株 3：誘導pET-28a(+)空載菌株4：未誘導pET-28a(+)空載菌株(圖b) M: Marker

29、 1：純化的重組蛋白SpxB 純化表達的SpxB丙酮酸氧化酶活性的檢測按照T（TOYOBO）商品丙酮酸氧化酶質控方法測得565nm讀數(shù)顯示（圖4）圖4的圖注不清楚！表達純化的SpxB蛋白具有丙酮酸氧化酶活性，而42C熱激15分鐘后的SpxB蛋白與不含酶的空白對照近似，即喪失了酶活性。說明本研究實現(xiàn)了肺炎鏈球菌丙酮酸氧化酶SpxB蛋白的活性表達。圖4 純化表達的SpxB丙酮酸氧化酶活性的檢測 抗SpxB多克隆抗體效價重組蛋白SpxB免疫KM小鼠后，分離血清制備抗SpxB多克隆抗體，經(jīng)ELISA法檢測，抗體IgG效價可達1:2560000以上（圖4），說明重組SpxB蛋白與佐劑混合免疫三次即可刺激

30、小鼠產(chǎn)生高滴度的抗體。圖5 ELISA檢測抗SpxB多克隆抗體效價 抗SpxB多克隆抗體Western Blot分析用WesternBlot對七株不同血清型的肺炎鏈球菌全菌裂解液中SpxB蛋白進行檢測， SpxB重組蛋白作為陽性對照,E.coli BL21（DE3）作為陰性對照。結果顯示（圖6 ），陽性對照出現(xiàn)一條特異性條帶，分子量約為65KD, 說明該抗血清能特異性識別SpxB 重組蛋白。同時在多種血清型S.pn全菌裂解樣本中均有一條特異的條帶，大小與SpxB重組蛋白一致，說明SpxB蛋白在S.pn中保守性較高。圖6 抗SpxB多克隆抗體Western Blot分析1：純化SpxB 重組蛋白

31、 2: CMCC 31109( 1型 ) 3：D39（2型）4: TIGR4（4型） 5：CMCC 31207(6B型) 6：CMCC 31614 (14型) 7：CMCC 31693(19F型) 8：CMCC 31759(23F型) 9：陰性對照 E.coli BL21 SpxB蛋白的細胞定位磷壁酸是肺炎鏈球菌表面多糖，本研究將其設為陽性對照，陰性對照為未免疫小鼠血清，本實驗室前期研究證實VicK蛋白為胞外少量表達的蛋白，本研究將其設為半陰性對照。流式細胞術檢測結果顯示（圖7），陽性對照抗磷壁酸抗體染色后熒光強度較陰性對照和抗VicK抗體染色明顯升高，而抗SpxB 多克隆抗體染色后熒光強度較

32、陰性對照稍高，與抗VicK抗體染色組相近，顯著低于陽性對照組TA，已知磷壁酸（TA）位于細菌表面，VicK蛋白主要位于細胞內(nèi)，提示SpxB蛋白主要位于胞內(nèi)表達。圖7 SpxB蛋白的亞細胞定位 討論肺炎鏈球菌丙酮酸氧化酶SpxB近年來開始作為毒力因子被關注。spxB基因缺陷的肺炎鏈球菌表現(xiàn)出粘附和毒力的下降 ADDIN EN.CITE Spellerberg1996593595917Spellerberg, BarbaraCundell, Diana R.Sandros, JensPearce, Barbara J.Idnpn-Heikkil, IlonaRosenow, CarstenMasu

33、re, H. RobertPyruvate oxidase, as a determinant of virulence in Streptococcus pneumoniaeMolecular MicrobiologyMol MicrobiolMolecular microbiology803-8131941996Blackwell Science Ltd1365-2958/10.1046/j.1365-2958.1996.425954.x10.1046/j.1365-2958.1996.425954.x HYPERLINK l _ENREF_3 o Spellerberg, 1996 #5

34、9 3，并且對H2O2耐受性降低 ADDIN EN.CITE Pericone20031771717017Pericone, C. D.Park, S.Imlay, J. A.Weiser, J. N.Factors Contributing to Hydrogen Peroxide Resistance in Streptococcus pneumoniae Include Pyruvate Oxidase (SpxB) and Avoidance of the Toxic Effects of the Fenton ReactionJournal of BacteriologyJ Bact

35、eriolJournal of bacteriology6815-68251852320030021-919310.1128/jb.185.23.6815-6825.2003 HYPERLINK l _ENREF_7 o Pericone, 2003 #17 7。SpxB分解丙酮酸產(chǎn)生的乙酰磷酸也是肺炎鏈球菌有氧條件和氧化應激條件下ATP的重要來源 ADDIN EN.CITE Pericone20031771717017Pericone, C. D.Park, S.Imlay, J. A.Weiser, J. N.Factors Contributing to Hydrogen Peroxid

36、e Resistance in Streptococcus pneumoniae Include Pyruvate Oxidase (SpxB) and Avoidance of the Toxic Effects of the Fenton ReactionJournal of BacteriologyJ BacteriolJournal of bacteriology6815-68251852320030021-919310.1128/jb.185.23.6815-6825.2003 HYPERLINK l _ENREF_7 o Pericone, 2003 #17 7。丙酮酸氧化酶作用產(chǎn)

37、物H2O2的作用研究較多。研究顯示在肺炎鏈球菌導致的中耳炎中，細菌產(chǎn)生的H2O2作為血管擴張劑，在中耳炎早期腦過度灌注的產(chǎn)生中起一定作用 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA HYPERLINK l _ENREF_8 o Hoffmann, 2007 #10 8。肺炎鏈球菌內(nèi)源性H2O2還通過抑制FabF來改變膜脂肪酸的組成 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA HYPERLINK l _ENREF_9 o Benisty, 2010 #15 9。還有文獻報道體外實驗中發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌產(chǎn)生的H2O2可以抑制甚至殺死其他與肺炎鏈球菌共同存在于

38、上呼吸道的細菌比如流感嗜血桿菌和金黃色葡萄球菌 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA HYPERLINK l _ENREF_10 o Christopher D. Pericone, 2000 #42 10, HYPERLINK l _ENREF_11 o Regev-Yochay, 2006 #26 11。在本課題組前期研究中在肺炎鏈球菌中通過免疫共沉淀和質譜分析篩選到可能與分子伴侶蛋白DnaJ有相互作用的10種蛋白，丙酮酸氧化酶SpxB是其中之一 ADDIN EN.CITE Cai201339123939017Cai, Y.Yan, W.Xu, W.Yin, Y

39、.He, Y.Wang, H.Zhang, X.Key Laboratory of Diagnostic Medicine Designated by the Ministry of Education, Department of Laboratory Medicine, Chongqing Medical University, Chongqing, China.Screening and Identification of DnaJ Interaction Proteins in Streptococcus pneumoniaeCurr MicrobiolCurrent microbio

40、logyCurr MicrobiolCurrent microbiologyCurr MicrobiolCurrent microbiology732-416762013Dec1432-0991 (Electronic)0343-8651 (Linking)23907491/pubmed/2390749110.1007/s00284-013-0424-4 HYPERLINK l _ENREF_12 o Cai, 2013 #39 12，為了進一步探索相關分子機制，我們擬對SpxB蛋白功能進行詳細分析。由于在之前關于丙酮酸氧化酶SpxB的文獻中未查見具體檢測其酶活性的方法，也沒有相應的商品化丙酮

41、酸氧化酶酶活性檢測試劑盒，本研究利用試劑公司標準品丙酮酸氧化酶質控方法測定酶活性。該方法原理是有氧條件下丙酮酸和氧氣以及磷酸在丙酮酸氧化酶催化下生成乙酰磷酸、二氧化碳和過氧化氫，生成的過氧化氫與4-氨基安替比林、N,N-二甲基苯胺在酸性條件下被過氧化氫酶催化生成水和565nm波長特異性檢測物質苯醌二亞胺，通過檢測該有色物質的量確定生成過氧化氫的量從而計算參與催化反應的丙酮酸氧化酶的活性。初步驗證了表達純化的SpxB蛋白具有一定的丙酮酸氧化酶活性，可用于后續(xù)研究影響SpxB蛋白活性的因素。全基因組測序結果顯示spxB基因在肺炎鏈球菌中較為保守，但在SpxB蛋白水平上的保守性尚無直接證據(jù)。本研究驗

42、證了SpxB蛋白在國內(nèi)常見血清型1、2、4、6B、14、19F和23F菌株 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA HYPERLINK l _ENREF_13 o Liu, 2008 #45 13中均有較多量表達，且高度保守。提示在各型肺炎鏈球菌中SpxB蛋白均作為重要毒力因子發(fā)揮作用。而確定SpxB蛋白主要表達于胞內(nèi)，則可能提示其毒力作用主要是通過產(chǎn)生和釋放H2O2，以及為細菌提供能量和乙酰磷酸來實現(xiàn)。本實驗利用分子克隆技術，成功表達并純化出有酶活性的SpxB蛋白，獲得了高滴度高特異性多克隆抗體，證實該蛋白在不同血清型肺炎鏈球菌中保守存在，并驗證了SpxB蛋白主要存

43、在于胞內(nèi)，為進一步研究肺炎鏈球菌中該蛋白的功能和作用機制奠定了堅實的基礎。參考文獻： ADDIN EN.REFLIST 1Domenech de Celles M, Opatowski L, Salomon J, et al. Intrinsic epidemicity of Streptococcus pneumoniae depends on strain serotype and antibiotic susceptibility pattern J. Antimicrobial agents and chemotherapy, 2011, 55(11): 5255-5261.2Levi

44、ne O S, OBrien K L, Knoll M, et al. Pneumococcal vaccination in developing countries J. The Lancet, 2006, 367(9526): 1880-1882.3Spellerberg B, Cundell D R, Sandros J, et al. Pyruvate oxidase, as a determinant of virulence in Streptococcus pneumoniae J. Molecular microbiology, 1996, 19(4): 803-813.4R

45、egev-Yochay G, Trzcinski K, Thompson C M, et al. SpxB is a suicide gene of Streptococcus pneumoniae and confers a selective advantage in an in vivo competitive colonization model J. Journal of bacteriology, 2007, 189(18): 6532-6539.5Battig P, Muhlemann K. Influence of the spxB gene on competence in

46、Streptococcus pneumoniae J. Journal of bacteriology, 2008, 190(4): 1184-1189.6Johnston C, Martin B, Granadel C, et al. Programmed protection of foreign DNA from restriction allows pathogenicity island exchange during pneumococcal transformation J. PLoS pathogens, 2013, 9(2): e1003178.7Pericone C D, Park S, Imlay J A, et al. Factors Contributing to Hydrogen Peroxide Resistance in Streptococcus pneumoniae Include Pyruvate