1、脂質體轉染的實驗原理與操作步驟大全日期：2012-06-25 來源：互聯網 作者：青嵐 點擊：3644次摘要：細胞轉染的方法主要包括：電穿孔法、顯微注射、基因槍、磷酸鈣共沉淀法、脂質體轉染法、多種陽離子物質介導、病毒介導的轉染等，理想的細胞轉染方法是具有高轉染效率、對細胞的毒性作用小等，本文主要介紹細胞轉染常用的方法-脂質體轉染的原理和操作步驟等。 HYPERLINK /extend/redirect-htm-aid-24.html o t _blank 找產品，上生物幫 細胞轉染的方法主要包括：電穿孔法、顯微注射、基因槍、磷酸鈣共沉淀法、脂質體轉染法、多種陽離子物質介導、病毒介導的轉染等，理

2、想的 HYPERLINK /zhuanti/product/201307/440205.html t _blank 細胞轉染方法是具有高轉染效率、對細胞的毒性作用小等，本文主要介紹細胞轉染常用的方法-脂質體轉染的原理和操作步驟等。脂質體(lipofectin regeant，LR)試劑是陽離子脂質體N-1-2，3-Dioleyoxy， Propyl-n， n，n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE)的混合物1：1(w/w)。它適用于把 HYPERLINK /zhuanti/product/20

3、1308/442416.html t _blank DNA轉染入懸浮或貼壁培養細胞中，是目前條件下最方便的轉染方法之一。轉染率高，優于磷酸鈣法，比它高5100倍，能把DNA和RNA轉染到各種細胞。用LR進行轉染時，首先需優化轉染條件，應找出該批LR對轉染某一特定細胞適合的用量、作用時間等，對每批LR都要做：第一，先要固定一個 HYPERLINK /zhuanti/product/201307/440341.html t _blank DNA的量和DNA/LR混合物與細胞相互作用的時間，DNA可從15g和孵育時間6小時開始，按這兩個參數繪出相應LR需用量的曲線，再選用LR和DNA兩者最佳的劑量，

4、確定出轉染時間(224小時)。因LR對細胞有一定的毒性，轉染時間以不超過24小時為宜。 HYPERLINK /zhuanti/product/201308/444034.html t _blank 細胞種類：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一種細胞均可作為受體細胞。一、脂質體(liposome)轉染方法原理脂質體(liposome)轉染方法原理：脂質體(Iiposome)作為體內和體外輸送載體的工具，已經研究的十分廣泛，用合成的陽離子脂類包裹DNA，同樣可以通過融合而進人細胞。使用脂質體將DNA帶人不同類型的 HYPERLINK /zhuanti/product/

5、201308/443762.html t _blank 真核細胞，與其它方法相比，有較高的效率和較好的重復性。中性脂質體是利用脂質膜包裹DNA，借助脂質膜將DNA導入 HYPERLINK /zhuanti/product/201308/444264.html t _blank 細胞膜內。帶正電的陽離子脂質體，DNA并沒有預先包埋在脂質體中，而是帶負電 的DNA自動結合到帶正電的脂質體上，形成DNA-陽離子脂質體復合物，從而吸附到帶負電的細胞膜表面，經過內吞被導入細胞。二、 HYPERLINK /zhuanti/product/201308/441868.html t _blank 脂質體轉染操

6、作步驟1、操作步驟方法一：(1)細胞培養：取6孔培養板(或用35mm培養皿)，向每孔中加入2mL含12105個細胞培養液，37CO2培養至40%60%匯合時(匯合過分，轉染后不利篩選細胞)。(2) 轉染液制備：在聚苯乙稀管中制備以下兩液(為轉染每一個孔細胞所用的量)A液：用不含血清培養基稀釋1-10g DNA，終量100L，B液：用不含血清培養基稀釋2-50gLR，終量100L，輕輕混合A、B液，室溫中置10-15分鐘，稍后會出現微濁現象，但并不妨礙轉染(如出現沉淀可能因LR或DNA濃度過高所致，應酌情減量)。(3)轉染準備：用2mL不含血清培養液漂洗兩次，再加入1mL不含血清培養液。(4)轉

7、染：把A/B復合物緩緩加入培養液中，搖勻，37溫箱置624小時，吸除無血清轉染液，換入正常培養液繼續培養。(5)其余處理如觀察、篩選、檢測等與其它轉染法相同。注意：轉染時切勿加血清，血清對轉染效率有很大影響。2、快速脂質體轉染法操作步驟如下方法二：(1)以5105細胞/孔接種6孔板(或35mm培養皿)培養24小時，使其達到5060%板底面積。(2)在試管中配制DNA/脂質體復合物方法如下：在1mL無血清DMEM中稀釋PSV2-neo質粒DNA或供體DNA。旋轉1秒鐘，再加入脂質體懸液，旋轉。室溫下放置510分鐘，使DNA結合在脂質體上。(3)棄去細胞中的舊液，用1mL無血清DMEM洗細胞一次后

8、棄去，向每孔中直接加入1mL DNA/脂質體復合物，37培養35小時。(4)再于每孔中加入20%FCS的DMEM，繼續培養1424小時，(5)吸出DMEM/DNA/脂質體混合物加入新鮮10%FCS的DMEM，2mL/孔，再培養2448小時。(6)用細胞刮或消化法收集細胞，以備分析鑒定。3、穩定的脂質體轉染方法如下：(1)接種細胞同前，細胞長至50%板底面積可用于轉染。(2)DNA/脂質體復合物制備轉染細胞同前(2)、(3)步驟。(3)在每孔中加入1mL、20%FCS的DMEM，37培養48小時。(4)吸出DMEM，用G418選擇培養液稀釋細胞，使細胞生長一定時間，篩選轉染克隆，方法參照細胞克隆

9、篩選法進行。三、個人經驗：本人用的是Invitrogen公司的Lipofectamine2000在24孔板轉染單層貼壁細胞。(別的方法可以參考生產商提供的protocol)1、轉染前1天將0.52105細胞接種于24孔培養板，并加入500ul不含抗生素的完全培養基，以保證轉染時細胞匯合達9095%。2、準備復合物(1) 將0.8ug DNA稀釋于50ul無血清無抗生素的培養液中輕輕渾勻。(2) 將2ul Lipofectamine2000稀釋于50ul無血清無抗生素的培養液中，輕輕渾勻，室溫孵育5分。注意：必須在25分內進行。(3) 5分后將它們混合，并輕輕渾勻，室溫孵育20分。3、吸去培養板

10、的培養基，用PBS或無血清培養基(最好)清洗細胞2次。4、將復合物(總體積100ul)加入培養孔，前后搖動培養板使其分布均勻。5、將細胞放入培養箱孵育46h后，可以更換含血清培養液去除復合物(也可不用)。6、2448h后可以觀察轉入基因表達情況。7、穩定轉染：換含血清培養基24h后將細胞以1：10(或更高比例)傳代，1天后更換篩選培養基篩選。8、優化：要保證細胞匯合率達9095%(比較高);DNA/ Lipofectamine2000比率1：0.51：5，一般細胞1：23.脂質體轉染法的主要優點是可用將DNA轉染至懸浮或者鐵壁細胞培養、轉染效率相對較高、對基因片段大小的限制較小等，但是陽離子脂

11、質體對細胞的毒性相對較高，為了防止其毒性，要摸索好如下實驗條件：脂質體與質粒的比例、細胞轉染時間等。測量學模擬試卷單項選擇題（每小題1 分，共20 分）在下列每小題的四個備選答案中選出一個正確的答案，并將其字母標號填入題干的括號內。得分評卷人復查人1經緯儀測量水平角時，正倒鏡瞄準同一方向所讀的水平方向值理論上應相差（A ）。A 180 B 0 C 90 D 2702. 1：5000地形圖的比例尺精度是（ D ）。A 5 m B 0.1 mm C 5 cm D 50 cm 3. 以下不屬于基本測量工作范疇的一項是（ C）。A 高差測量 B 距離測量 C 導線測量 D 角度測量4. 已知某直線的坐

12、標方位角為220，則其象限角為（D ）。A 220 B 40 C 南西50 D 南西405. 由一條線段的邊長、方位角和一點坐標計算另一點坐標的計算稱為（A ）。A 坐標正算 B 坐標反算 C 導線計算 D 水準計算6. 閉合導線在X軸上的坐標增量閉合差（ A ）。A為一不等于0的常數 B 與導線形狀有關 C總為0 D 由路線中兩點確定7. 在地形圖中，表示測量控制點的符號屬于（D ）。A 比例符號 B 半依比例符號 C 地貌符號 D 非比例符號8. 在未知點上設站對三個已知點進行測角交會的方法稱為（A ）。A 后方交會 B 前方交會 C 側方交會 D 無法確定9. 兩井定向中不需要進行的一項

13、工作是（C ）。A 投點 B 地面連接 C 測量井筒中鋼絲長度 D 井下連接10. 絕對高程是地面點到（ C ）的鉛垂距離。A 坐標原點 B任意水準面 C 大地水準面 D 赤道面11下列關于等高線的敘述是錯誤的是：（A ）高程相等的點在同一等高線上等高線必定是閉合曲線，即使本幅圖沒閉合，則在相鄰的圖幅閉合等高線不能分叉、相交或合并等高線經過山脊與山脊線正交12下面關于非比例符號中定位點位置的敘述錯誤的是（B ）A幾何圖形符號，定位點在符號圖形中心B符號圖形中有一個點，則該點即為定位點C寬底符號，符號定位點在符號底部中心D底部為直角形符號，其符號定位點位于最右邊頂點處13下面關于控制網的敘述錯誤

14、的是（D ）國家控制網從高級到低級布設國家控制網按精度可分為A、B、C、D、E五等國家控制網分為平面控制網和高程控制網直接為測圖目的建立的控制網，稱為圖根控制網14下圖為某地形圖的一部分，各等高線高程如圖所視，A點位于線段MN上，點A到點M和點N的圖上水平距離為MA=3mm，NA=2mm，則A點高程為（A ）ANM37363536.4m 36.6m 37.4m 37.6m100301303010030DCBA15如圖所示支導線，AB邊的坐標方位角為，轉折角如圖，則CD邊的坐標方位角為（ B ）A B C D16三角高程測量要求對向觀測垂直角，計算往返高差，主要目的是（D ）有效地抵償或消除球差

15、和氣差的影響有效地抵償或消除儀器高和覘標高測量誤差的影響有效地抵償或消除垂直角讀數誤差的影響D有效地抵償或消除讀盤分劃誤差的影響17下面測量讀數的做法正確的是（ C ）用經緯儀測水平角，用橫絲照準目標讀數用水準儀測高差，用豎絲切準水準尺讀數水準測量時，每次讀數前都要使水準管氣泡居中經緯儀測豎直角時，盡量照準目標的底部18水準測量時對一端水準尺進行測量的正確操作步驟是（ D ）。A 對中-整平-瞄準-讀數 A 整平-瞄準-讀數-精平C 粗平-精平-瞄準-讀數 D粗平-瞄準-精平-讀數19礦井平面聯系測量的主要任務是（ D ）A 實現井上下平面坐標系統的統一 B 實現井上下高程的統一C 作為井下基

16、本平面控制 D 提高井下導線測量的精度20 井口水準基點一般位于（ A ）。A 地面工業廣場井筒附近 B 井下井筒附近C 地面任意位置的水準點 D 井下任意位置的水準點填空題（每空2分，共20分）得分評卷人復查人21水準測量中，為了進行測站檢核，在一個測站要測量兩個高差值進行比較，通常采用的測量檢核方法是雙面尺法和 。22直線定向常用的標準方向有真子午線方向、_磁北方向_和坐標縱線方向。23地形圖符號一般分為比例符號、_半依比例符號_和不依比例符號。24 井下巷道掘進過程中，為了保證巷道的方向和坡度，通常要進行中線和_的標定工作。25 測量誤差按其對測量結果的影響性質，可分為系統誤差和_偶然誤

17、差_。26 地物注記的形式有文字注記、 _ 和符號注記三種。27 象限角的取值范圍是： 0-90 。28 經緯儀安置通常包括整平和 對中 。29 為了便于計算和分析，對大地水準面采用一個規則的數學曲面進行表示，這個數學曲面稱為 參考托球面 。30 光電測距儀按照測量時間的方式可以分為相位式測距儀和 差分 。名詞解釋（每小題5分，共20分）得分評卷人復查人31豎盤指標差豎盤分劃誤差32水準測量利用水準儀測定兩點間的高差33系統誤差由客觀原因造成的具有統計規律性的誤差34視準軸儀器望遠鏡物鏡和目鏡中心的連線簡答題（每小題5分，共20分）得分評卷人復查人35簡述測回法測量水平角時一個測站上的工作步驟

18、和角度計算方法。對中，整平，定向，測角。觀測角度值減去定向角度值36什么叫比例尺精度？它在實際測量工作中有何意義？圖上0.1毫米在實地的距離。可以影響地物取舍37簡述用極坐標法在實地測設圖紙上某點平面位置的要素計算和測設過程。38高斯投影具有哪些基本規律。計算題（每小題10分，共20分）得分評卷人復查人39在1：2000圖幅坐標方格網上，量測出ab = 2.0cm, ac = 1.6cm, ad = 3.9cm, ae = 5.2cm。試計算AB長度DAB及其坐標方位角AB。abdceBA120014001600180040從圖上量得點M的坐標XM=14.22m, YM=86.71m；點A的坐

19、標為XA=42.34m, YA=85.00m。試計算M、A兩點的水平距離和坐標方位角。測量學 標準答案與評分說明一、 單項選擇題（每題1分）1 A； 2 D； 3 C； 4 D； 5 A； 6 C； 7 D； 8 A； 9 C； 10 C；11 A；12 D；13 B；14 A； 15 B；16 A；17 C；18 D； 19 A；20 A二、 填空題 （每空2分，共20分）21 變更儀器高法22 磁北方向23 半依比例符號（或線狀符號）24腰線25偶然誤差26數字注記27 大于等于0度且小于等于90度（或0, 90）28 對中29 旋轉橢球體面30 脈沖式測距儀三、 名詞解釋（每題5分，共2

20、0分）31豎盤指標差：在垂直角測量中，當豎盤指標水準管氣泡居中時，指標并不恰好指向其正確位置90度或270度，而是與正確位置相差一個小角度x, x即為豎盤指標差。32 水準測量：利用一條水平視線并借助于水準尺，測量地面兩點間的高差，進而由已知點的高程推算出未知點的高程的測量工作。33 系統誤差：在相同的觀測條件下，對某量進行了n次觀測，如果誤差出現的大小和符號均相同或按一定的規律變化，這種誤差稱為系統誤差。34視準軸：望遠鏡物鏡光心與十字絲中心（或交叉點）的連線。四、 簡答題（每題5分，共20分）35（1）在測站點O上安置經緯儀，對中，整平（1分）（2）盤左瞄準A點，讀數LA，順時針旋轉照準部到B點，讀數LB，計算上半測回角度O1=LB-LA； （2分）（3）旋轉望遠鏡和照準部，變為盤右方向，瞄準B點讀數RB，逆時針旋轉到A點，讀數RA，計算下半測回角度O2=RB-RA； （3分）（4）比較O1和O2的差，若超過限差則不符合要求，需要重新測量，若小于限差，則取平均值為最終測量結果 O = （O1+O2）/2 （5分）36 圖上0.1mm對應的實地距離叫做比例尺精度。（3分）其作用主要在于：一是根據地形圖比例尺確定實地量測精度；二是根據地形圖上需要表示地物地貌的詳細程度，確定所選用地形圖的比例尺。（5分）37 要素計算