1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2聯(lián)合熱化療誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖抑制作用及機(jī)制龍騰 王亞旭 作者單位：400010，重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院普外科通信作者：王亞旭，Email:wangyaxu1967【摘要】目的 探討骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）、熱化療(五氟尿嘧啶，5-FU)單獨(dú)和聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞（SW480）株增殖凋亡的影響并探討其可能機(jī)制。方法 BMP-2（100g/L）、5-FU（75mg/L、100mg/L）單獨(dú)與聯(lián)合作用于SW480細(xì)胞株，F(xiàn)CM法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，Western blot法檢測(cè)PTEN(人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因)蛋白的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒从常≧

2、T-PCR）檢測(cè)PTEN mRNA表達(dá)。結(jié)果 與單獨(dú)作用比較，BMP-2聯(lián)合熱化療(5-FU)作用于SW480細(xì)胞株時(shí)，凋亡率明顯增高（P0.05)。BMP-2聯(lián)合熱化療(5-FU)作用時(shí)PTEN蛋白的表達(dá)水平高于單獨(dú)使用熱化療（5-FU）時(shí)的表達(dá)水平。各組間PTENmRNA的表達(dá)沒有差異。 結(jié)論 BMP-2與熱化療（5-FU）聯(lián)合作用有協(xié)同誘導(dǎo)SW480細(xì)胞株凋亡的作用，并可以降低化療藥物劑量，其機(jī)制可能與上調(diào)PTEN蛋白表達(dá)有關(guān)。【關(guān)鍵詞】 熱化療；骨形態(tài)發(fā)生蛋白2；PTEN；細(xì)胞凋亡The effect and mechanism of bone morphogenetic protei

3、n-2 on cell proliferation inhibition by combining thermo-chemotherapy in colon cancer SW480 cellsAuthor：Long Teng Mailing address: General surgery of Chongqing Medical university affiliated second hospital; Chongqing 400010，China Corresponding author: Wang Yaxu【Key word】Thermo-chemotherapy; bone mor

4、phogenetic protein-2; PTEN; apoptosis Abstract Objective To observe the effects bone morphogenetic protein-2 (BMP-2)、Thermo-chemotherapy (5-FU) and their combination on the proliferation and apoptosis of human colon cancer cell（SW480） line, and to explore the possible mechanism. Methods BMP-2(100g/L

5、) and 5-FU(75mg/L、100mg/L) were used, SW480 cells were divided into control group, BMP-2 treated group, Thermo-chemotherapy (5-FU) treated group, Thermo-chemotherapy(5-FU)+BMP-2 treated group. Their apoptosis rate was detected by flow cytometry (FCM). The protein expression of phosphatase and tensin

6、 homolog deleted on chromosome ten (PTEN) was detected by Western blotting. The mRNA expression of PTEN was detected by reverse transcription PCR （RT-PCR）. Results The apoptosis rate of Thermo-chemotherapy (5-FU)+BMP-2 treated cells was significantly higher than those of BMP-2 treated and those of T

7、hermo-chemotherapy(5-FU) treated cells（P0.01 ). The apoptosis rate of SW480 cells treated with BMP-2 (100g/L) and 5-FU (75 mg/L) is similar to those cells treated with 5-FU(100 mg/L) P0.05. The expression of PTEN in Thermo-chemotherapy (5-FU)+BMP-2 treated group was higher than these in Thermo-chemo

8、therapy (5-FU) treated cells. The expression of PTENmRNA have no difference in groups. Conclusions BMP-2 can lower chemotherapy doses. BMP-2 combined with Thermo-chemotherapy (5-FU) treated can induce the inhibition and apoptosis of SW480 cell line, and the mechanism may be through increasing the pr

9、otein expression of PTEN.腹腔溫?zé)峄?intraperitoneal hyperthermia chemoperfusion，IHCP),自1980年進(jìn)入臨床已有近30年的歷史，作為胃腸道腫瘤術(shù)后的輔助療法，在西方國(guó)家已廣泛應(yīng)用。IHCP能有效殺滅腹腔內(nèi)游離的腫瘤細(xì)胞和微小癌轉(zhuǎn)移灶，預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)，提高術(shù)后生存率，但亦可對(duì)增生活躍的腸上皮細(xì)胞和器官產(chǎn)生損傷，導(dǎo)致抗腫瘤副作用【1-3】。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone morphogenetic proteins ，BMPs),最初是作為能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)骨和軟骨的形成的因子為人們所認(rèn)識(shí)【4】，對(duì)骨骼的胚胎發(fā)育和再生休修復(fù)其重要作用

10、。現(xiàn)在研究發(fā)現(xiàn)，它們參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的增值、分化和凋亡的生物學(xué)過程。骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 （bone morphogenetic protein-2 ，BMP-2)作為骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPS）家族中的一員，被證實(shí)在多種腫瘤中均有表達(dá)，并且影響臨床和預(yù)后，并且可抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖、分化促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡【5-7】。我們嘗試BMP-2聯(lián)合熱化療，通過體外實(shí)驗(yàn)旨在證實(shí)其聯(lián)合作用對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響，并探討其可能機(jī)制。為在不降低腹腔溫?zé)峄煰熜У幕A(chǔ)上而降低其副作用提供依據(jù)。材料與方法一、材料 人結(jié)腸癌細(xì)胞（SW480）購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)生命研究院；BMP-2（上海天呈科技有限公司，進(jìn)口分裝）；RP

11、M1640培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Gibco BRL公司）；兔抗人PTEN單抗（美國(guó)Sant Cruz公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記IgG山羊抗兔(北京中杉公司)；Western blot發(fā)光試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；Western blot凝膠試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；五氟尿嘧啶（山東齊魯制藥有限公司）；RT-PCR（逆轉(zhuǎn)錄PCR）試劑盒（東洋紡生物科技有限公司）；9700基因擴(kuò)增儀（美國(guó)）；SDS電泳儀（中國(guó)北京六一儀器廠）；電泳轉(zhuǎn)移裝置（美國(guó)Bio-RAD）;凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-RAD）；PVDF膜（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）等。二、方法 1. 流式細(xì)胞法細(xì)胞凋

12、亡的檢測(cè)：將SW480分為5個(gè)組：A組:對(duì)照組，不加任何處理，只常規(guī)更換培養(yǎng)基；B組: 加入BMP-2（100g/L）組；C組:單純熱化療組(5-FU100mg/L)；D組:BMP-2(100g/L)+熱化療(5-FU75mg/L）；E 組:BMP-2(100g/L)+熱化療（5-FU100mg/L）。組處理如下：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的SW480細(xì)胞均勻的接種于5個(gè)50 ml的培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁60%80%時(shí)，A組用磷酸鹽緩沖液沖洗后只加入RPM1640培養(yǎng)基（含胎牛血清，濃度為10%）；B組用磷酸鹽緩沖液沖洗后加入含BMP-2（終濃度為100mg/L）的RPM1640培養(yǎng)基（含胎牛血清，濃度為

13、10%）；C組用磷酸鹽緩沖液沖洗后加入含5-FU（終濃度為100mg/L）的RPM1640培養(yǎng)基（含胎牛血清，濃度為10%）；D組用磷酸鹽緩沖液沖洗后加入含BMP-2（終濃度為100g/L）及5-FU（終濃度為75mg/L）的RPM1640培養(yǎng)基（含胎牛血清，濃度為10%）；E組用磷酸鹽緩沖液沖洗后加入含BMP-2（終濃度為100g/L）及5-FU(終濃度為100mg/L)的RPM1640培養(yǎng)基（含胎牛血清，濃度為10%）；A組處理后放入37二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)24 h；C、D、E組處理后先放入43培養(yǎng)箱內(nèi)30 min再轉(zhuǎn)入37二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)共24 h；B組處理后放在37二氧化碳

14、培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)24 h；各組培養(yǎng)結(jié)束后用0.125%的胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，PI雙染色，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1106/ml，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。 2. Western blot檢測(cè)PTEN 蛋白：SW480細(xì)胞重新分4個(gè)組A:對(duì)照組，不加任何處理只常規(guī)更換培養(yǎng)基B:單純BMP-2組（100g/L）；C:單純熱化療組(5-FU100 mg/L)；D BMP-2(100g/L)+熱化療組（5-FU100mg/L），組處理方法如下：待細(xì)胞貼壁60%80%時(shí)，A組用磷酸鹽緩沖液沖洗后只加入RPM1640培養(yǎng)基（含胎牛血清，濃度為10%）, 放在37 二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)12h；B組用磷酸鹽緩沖液沖

15、洗后加入含BMP-2（終濃度為100mg/L）的RPM1640培養(yǎng)基（含胎牛血清，濃度為10%），放在37二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)12h；C、D組培養(yǎng)處理后先放入43培養(yǎng)箱內(nèi)30min再轉(zhuǎn)入37二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)共12h。提取細(xì)胞蛋白，10%聚丙烯凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，加入兔抗人PTEN單抗（1:200稀釋），搖床封閉1h，冰箱4封閉過夜，洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1:1000稀釋），室溫作用1h，洗膜，ECL放射自顯影。 3. RT-PCR檢測(cè)PTENmRNA：細(xì)胞分組及各組細(xì)胞處理同Western blot檢測(cè)PTEN 蛋白時(shí)細(xì)胞的分組及處理，根據(jù)操作

16、說明用RNAOUT提取細(xì)胞總RNA，并用紫外分光計(jì)測(cè)定其濃度，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR引物序列及擴(kuò)增條件分別為：PTEN上游引物5-ATACCAGGACCAGAGGAAACC-3,下游引物5-TTGTCATTATCCGCACGCTC-3產(chǎn)物（101 bp）；以-actin為內(nèi)參，上游引物5-CTGGCACCACACCTTCTACAAT-3,下游引物5-AATGTCACGCACGATTTCCGC-3,產(chǎn)物（382bp)，擴(kuò)增條件為： 94 30 s，54 30 s， 72 30s，共30個(gè)循環(huán)，再72 5 min做終延伸。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果采用凝膠

17、成像系統(tǒng)進(jìn)行分析。4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以表示，行單因素方差分析。P0.05為差異非常顯著。結(jié) 果一、 SW480細(xì)胞凋亡情況 BMP-2（100g/L）與5-FU（75mg/L、100mg/L）單獨(dú)聯(lián)合處理SW480細(xì)胞后，行Annexin/PI雙染色后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，細(xì)胞凋亡率顯示：A組細(xì)胞凋亡率為（5.230.56）%；B組為（22.202.34）%；C組為（35.482.36）%；D組為（32.782.56）%；E組為（45.673.23）%；結(jié)果見圖1。BMP-2與5-FU聯(lián)合使用時(shí)細(xì)胞凋亡率較單獨(dú)使用時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），即

18、E組、D組與B組和C組相比，聯(lián)合使用較單獨(dú)使用時(shí)更能促進(jìn)細(xì)胞凋亡；C組細(xì)胞凋亡率與D組相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），即BMP-2與化療藥物聯(lián)合使用時(shí)，在降低化療藥物濃度的同時(shí)不降低促進(jìn)細(xì)胞凋亡的能力。不同條件下對(duì)SW480細(xì)胞的凋亡率均有影響，聯(lián)合組效果最明顯，BMP-2與熱化療聯(lián)合運(yùn)用有協(xié)同作用。 二、PTEN蛋白表達(dá)各組細(xì)胞處理后PTEN蛋白表達(dá)的情況，見圖2。 由圖2可以看出，B組及D組PTEN蛋白的表達(dá)較A組及C組明顯升高，因此可以得出BMP-2可以提高PTEN蛋白的表達(dá)；A組與C組相比可以看出熱化療不能提高PTEN蛋白的表達(dá)；B組與D組相比較可以得出，單獨(dú)使用BMP-2與聯(lián)合

19、熱化療使用在提高PTEN蛋白表達(dá)方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0.05。 三、SW480細(xì)胞PTENmRNA的表達(dá) 各組PTEN蛋白在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，見圖3。 由圖3可以看出，各組細(xì)胞間PTENmRNA的表達(dá)情況，熱化療與BMP-2單獨(dú)及聯(lián)合使用時(shí)均不能提高SW480細(xì)胞PTENmRNA的表達(dá)，各組間PTENmRNA的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。討 論腹腔內(nèi)腹腔溫?zé)峄?intraperitoneal hyperthermia chemoperfusion，IHCP),作為胃腸道腫瘤術(shù)后的輔助療法，在臨床中已廣泛應(yīng)用，并取得很好的療效。但I(xiàn)HCP在抗腫瘤的同時(shí)，亦對(duì)正常組織細(xì)胞產(chǎn)生損傷，導(dǎo)致抗腫瘤

20、副作用【1-3】。如何在不降低IHCP療效的同時(shí)降低其副作用，成為急需解決的問題。 BMPs是TGF-超家族成員，有BMP1、BMP2BMP15等20余種成員, 其中以BMP2、BMP4、BMP6 及BMP7 的功能最具代表性 ,能引起多種細(xì)胞增殖、分化、凋亡, 參與組織再生和再建【5-6】, 在細(xì)胞游走和分裂等多種生命活動(dòng)中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。Arnold SF等【8】等發(fā)現(xiàn)在乳腺中發(fā)現(xiàn)BMP-2mRNA的表達(dá)。Beck等【8】發(fā)現(xiàn)在人結(jié)腸癌SW480中BMP-2和BMP-7高表達(dá)，并通過SMAD4獨(dú)立信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞增殖起抑制作用。Hardwick等【6】檢測(cè)BMP-2對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

21、，發(fā)現(xiàn)BMP-2體外能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡和分化。用BMP-2預(yù)處理的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中PTEN蛋白水平迅速增加，BMP-2通過PTEN蛋白水平的調(diào)節(jié)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化【9】。PTEN 基因( phosphatase and tensin homologydeleted on chromosome ten ) 也稱MMAC1 或TEP1 基因，是迄今發(fā)現(xiàn)的第1個(gè)具有磷酸酶活性的抑癌基因,它在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路的調(diào)控中起關(guān)鍵作用，不但參與正常細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育的調(diào)控,而且在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中起抑制作用10。PTEN 基因位點(diǎn)的雜合性丟失與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān),特別是乳腺癌、胃癌與肺癌病人中,其雜

22、合性丟失的發(fā)生率分別達(dá)到了31%、37. 5%和47% 11 。大腸癌中亦存在PTEN 基因的突變、缺失【12】，國(guó)內(nèi)臨床實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大腸癌組織中PTEN蛋白的表達(dá)與大腸癌的分化程度密切相關(guān)，即癌組織分化愈差，PTEN蛋白表達(dá)愈弱。因此，大腸癌中PTEN基因突變、缺失導(dǎo)致其表達(dá)水平下降或失表達(dá),從而喪失抑癌作用,促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展。另外Tolkacheva等【13】發(fā)現(xiàn)PTEN是多聚泛素化的，即PTEN蛋白可以通過泛素化途徑降解。既然腫瘤組織中PTEN 蛋白存在低表達(dá)現(xiàn)象，而且又存在PTEN蛋白自身降解的過程，那么通過提高PTEN蛋白含量可以增強(qiáng)其抗癌作用。Kristin A等【9】發(fā)現(xiàn)BMP-2

23、在一定的濃度和時(shí)間上可以通過減少乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的PTEN蛋白的降解來提高PTEN蛋白的水平。 本實(shí)驗(yàn)證明，BMP-2可以提高PTEN蛋白的表達(dá)水平(見圖2)。Huang H14等發(fā)現(xiàn)PTEN的高表達(dá)可以提高前列腺癌細(xì)胞對(duì)化療的敏感性，從而達(dá)到更好的化療效果。我們采用人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480為研究對(duì)象，通過聯(lián)合BMP-2與熱化療，期望在人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480中達(dá)到協(xié)同抗癌作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BMP-2 (100g/L)+熱化療組（5-FU100 mg/L）聯(lián)合使用時(shí)，較單獨(dú)使用時(shí)更能促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡（P0.05）,可以看出BMP-2與化療藥物聯(lián)合運(yùn)用時(shí)可以降低單純化療藥物的濃度，而不降低化

24、療效果，為保護(hù)正常組織細(xì)胞提供了很好的依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)BMP-2可以提高PTEN蛋白的表達(dá)見(圖1)而提高化療敏感性。BMP-2對(duì)PTEN蛋白表達(dá)的影響通過圖3可以看出，在轉(zhuǎn)率水平各組之間無明顯差異（P0.05），即熱化療與BMP-2單獨(dú)及聯(lián)合使用時(shí)均不能提高SW480細(xì)胞PTENmRNA的表達(dá)。根據(jù)本研究結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)BMP-2與熱化療聯(lián)合使用時(shí)具有協(xié)同抗癌作用，并可以降低化療藥物單藥的濃度，其協(xié)同作用機(jī)制可能與BMP-2提高PTEN蛋白表達(dá)有關(guān)。為降低熱化療藥物劑量，減輕熱化療副反應(yīng)提供了新的思路。參 考 文 獻(xiàn) 1 Van der Vange N, Van Goethem AR, Zoe

25、tmulder FA, et alExtensive cytoreductive surgery combined with intra-operative intraperitoneal perfusion with cisplatin under hyperthermic conditions （OVHIPEC) in patients with recurrent ovarian cancer:a feasibility pilot. Eur J Surg Oncol, 2000, 26(7): 663-668.2 Shen P, Levine EA, Hall J, et al. Fa

26、ctors predicting survival after intraperitoneal hyperthermic chemotherapy with mitomycin C after cytoreductive surgery for patients with peritoneal carcinomatosis. Arch Surg, 2003, 138(1): 26-33.3 Fujimoto S, Takahashi M, KoBayashi K, et a1. Histologic evaluation of preventive measures for scald inj

27、ury on the peritoneo-serosal surface due to intraoperative hyperthemic chemoperfusion for patients with gastric cancer and peritoneal metastasis. Int J Hyperthemia， 1998, 14（1）: 75-834 Wozney JM, Rosen V, Celeste AJ, et a1. Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities. Science

28、, 1988, 242(4885): 1528-1534.5 Arnold SF, Tims E, Mcgrath BE. Identification of bone morphogenetic proteins and their receptors in human breast cancer cell lines: importance of BMP2. Cytokine, 1999, 11(12)： 1031-1037.6 Hardwick JC, Van Den Brink GR, Bleuming SA. Bone morphogenetic protein 2 is expre

29、ssed by, and acts upon, mature epithelial cells in the colon. Gastroenterology, 2004, 126(1): 111-121.7 Nakamura Y, Ozaki T, Koseki H, et a1. Accumulation of p27 KIP1 is associated with BMP2-induced growth arrest and neuronal differentiation of human neuroblastoma-derived cell lines. Biochem Biophys

30、 Res Commun. 2003, 307(1)：206-2138 Beck SE， Jung BH， Del Rosario E， et a1. BMP-induced growth suppression in colon cancer cells is mediated by p21WAF1 stabilization and modulated by RAS/ERK . Cell signal，2007，19（7）：1465-1472. 9 Waite KA， Eng C. BMP2 exposure results in decreased PTEN protein degrada

31、tion and increased PTEN Levels. Hum .Mo1 .Genet，2003，12(6): 679-684.10 Steck PA, Pershouse MA, Jasser SA, et a1. Identification of a candidate tumour suppressor gene. MMAC1， at chromosome 10q233 that is mutated in multiple advanced cancers. Nat Genet, 1997, 15(4): 356-36211Goberdhan D, Clive Wilson. PTEN: tumor suppressor, multifuncti