1、第十一章 雙水相萃取法Two-aqueous phase extraction1第1頁，共75頁。第十一章 雙水相萃取法 雙水相萃取技術(Two-aqueous phase extraction )又稱水溶液兩相分配技術,是近年出現的、極有前途的新型分離技術，可用于生物化學、細胞生物學和生物化工等領域歷史:1896年Beijernek 瓊脂-明膠形成雙水相 60年代瑞典Lund大學的Albertson最先提出雙水相萃取技術; 70年代中西德從細胞勻漿液提取酶,蛋白質 1989年, Diamond等以Flory-Huggins理論為基礎，推導出生物分子在雙水相體系中的分配模型2第2頁，共75頁。

2、 (1) 保留生物分子活性 (2) 除細胞碎片(與離心和膜分離比成本低) (3) 表面張力低，耗 能少 (4) 成本高 (5) 大分子及小分子萃取 萃取法的應用 在生物轉化、蛋白質、核酸、病毒、甲酸脫氫酶、紅霉素、頭孢霉素C等方面應用價格較貴(原料成本占85),未廣泛工業化 雙水相萃取特點3第3頁，共75頁。不同方法除去細胞碎片的比較（100公斤細胞）方 法收率/%濃縮倍數時間/h成本/$雙水相萃取蝶式離心機分離903-537800蝶式離心機分離8511030000轉鼓式過濾器8518.346000中空纖維錯流過濾8511025000方法步驟流量收率純化倍數總純度沉淀法30.77633.523

3、雙水相110-157712.843-半乳糖苷酶純化方法的比較4第4頁，共75頁。11.1 雙水相體系11.1.1 雙水相的形成 葡聚糖(2.2%)溶液甲基纖維素(0.72%)溶液混合靜止后產生兩相， 上相 甲基纖維素 90.3 下相 葡聚糖 71.8親水性聚合物親水性聚合物分相5第5頁，共75頁。 雙水相形成原因：分子之間作用力 聚乙二醇（PEG）/ 葡聚糖 (Dextran） (1) A-A A-B 相分離 (2) A-AA-A 凝聚復合 成相是由于高聚物之間的不溶性，無法相互滲透，不能形成均一相，具有相分離傾向，在一定條件下即可分為兩相。 6第6頁，共75頁。11.1.2 雙水相體系類型

4、(1) 高聚物-高聚物 (PEG-Dextran) 易于與后續處理近年來出現聚合物無機鹽 形成兩相 (2) 高聚物-鹽 (PEG-(NH4)2SO4 ) 鹽濃度高，蛋白質易鹽析， 廢水處理困難7第7頁，共75頁。各種雙水相系統8第8頁，共75頁。混溶性疏水梯度9第9頁，共75頁。11.1.2 雙水相體系相圖 雙節線 系線 節點 T、B 臨界點 K 杠桿規則TBMKDextran質量分數PEG質量分數10第10頁，共75頁。11.2 雙水相萃取過程的理論基礎11.2.1 表面自由能的影響 蛋白質等生物大分子物質在兩相中的分配也服從Nernst分配定律 Kct/cb 式中:ct,cb上、下相中溶質

5、濃度 相系統固定時,分配系數K為常數,與溶質濃度無關。溶質的分配，總是選擇兩相中相互作用最充分或系統能量最低的相，根據平衡時化學位相等原則， K 由Brownstedt方程式求得式中:M物質分子量； 系統的表面特性系數； k波爾茲曼常數； T溫度與表面自由能有關11第11頁，共75頁。 如粒子帶有電荷，兩相中分配不相等時，就會在相間產生電位。稱為道南電位 (Donnan Potential)。可用下式表示：式中: U2,U1分別表示相2和相1的電位； Z+，Z- 分別表示一種鹽的正、負離子的離子價； Kz+AKz-B正、負離子不帶電時兩相間的分配系數； F法拉第常數，F; R氣體常數，J/(m

6、ol.K)；11.2.2 表面電荷的影響12第12頁，共75頁。 一種鹽正、負離子對兩相有不同親和力，即Kz+AKz-B時,就會產生電位差; (Z+Z-)電位差對分配系數產生影響 影響分配系數的因素,用Gerson公式表示： -lgK 式中：表面積； 兩相表面自由能之差；電荷數； 電位差； 由標準化學位和活度系數組成的常數。 K和表面自由能與電位差成指數關系。影響K因素很多,各因素間影響 目前無定量關聯K與蛋白質分子性質關系。最佳操作條件，實驗得到13第13頁，共75頁。 聚合物及成相鹽種類及濃度 聚合物平均分子量 菌體或細胞種類及含量 其他鹽種類及濃度 體系pH值、溫度。 目的：選擇最適條件

7、,提高分配系數選擇性 產物分離和純化,直接從細胞破碎萃取蛋白質無需碎片分離。改變pH和電解質濃度反萃取。11.3 影響物質分配平衡的因素14第14頁，共75頁。11.3.1 聚合物及其分子量的影響 重要性：聚合物類型決定了是否能萃取 聚合物溶液混合時的情況： 完全混溶性(勻相溶液)； 相分離； 復雜凝聚(聚合物在同一相,水另一相 離子和非離子聚合物都可構成，當同為離子電荷相反時，互相吸引發生復雜的凝聚。15第15頁，共75頁。 不同聚合物 蛋白質存在疏水區 當pH=pI Ko與系統的疏水性有關 不同聚合物水溶液中疏水性： 葡萄糖硫酸鹽 甲基葡萄糖 葡萄糖 羥丙基葡聚糖 甲基纖維素 聚乙烯醇 聚

8、乙二醇 聚丙三醇 這種疏水性的差別對目的產物與相的相互作用是重要的。 11.3.1 聚合物及其分子量的影響疏水性 強16第16頁，共75頁。 同一聚合物分子量不同 同一聚合物的疏水性隨分子量增加而增加，其大小的選擇依賴于萃取過程的目的方向 在上相(PEG聚合物)獲得較高的蛋白質收率，應降低平均分子量 在下相獲得較高的蛋白質收率則平均分子量增加17第17頁，共75頁。PEG平均分子量對分配平衡的影響18第18頁，共75頁。分子量K019第19頁，共75頁。PEG分子對不同分子量蛋白質分配系數的影響分子量K020第20頁，共75頁。 相圖中系線長度由組成總濃度決定， 臨界點(K)附近，長度 零，上

9、相組成下相，K0 =1，聚合物和鹽濃度,系線長度,上相和下相相對組成差別TBMK 11.3.2 系線長度對分配平衡的影響21第21頁，共75頁。產物如酶在兩相中的表面張力差,會極大地影響分配系數，使酶富集于上相。22第22頁，共75頁。11.3.3 鹽緩沖液的影響 在水溶液中，離子影響溶質兩相分配。在含水混合物中引入鹽,鹽的陽陰離子不均勻分配,影響荷電大分子蛋白質、核酸分配離 子 lgK+ 離 子 lgK-K+ -0.084 I-+0.151 Na+ -0.076 Br-+0.083 NH4+ -0.036 Cl-+0.051 Li+ -0.015 F- +0.040 23第23頁，共75頁。

10、 多價離子分配取決于水溶液的pH值，pH值也會影響K 使用磷酸鹽緩沖液 pH7 且下相是負電時，會產生一個高的界面電位。 等電點7的磷酸鹽緩沖液，由于其中的HPO42-離子在聚乙二醇-葡聚糖系統中分配系數相當低，因此可方便改變界面電位，而使帶負電荷的蛋白質轉入富PEG相26第26頁，共75頁。11.3.4 溫度的影響臨界點附近-溫度較小的變化,影響相組成液相物理性質，如和，對分配系數影響不敏感。室溫收率依很高，粘度較冷卻(4)時低，有利于分離節省能源。27第27頁，共75頁。11.4 雙水相萃取技術的應用兩水相分離條件（1） 目的分子與細胞應分配在不同的相（2） 分配系數應足夠大（3） 離心機

11、容易分離NaDS-硫酸葡聚糖28第28頁，共75頁。 雙水相的應用始于酶的提取。精制Dextran太貴，粗Dextran粘度太大，目前研究和應用較多的是PEG/鹽體系。A. 酶的提取和純化29第29頁，共75頁。 這些體系中，酶主要分配在上相，菌體在下相或界面上。料液中濕細胞含量可高達30，酶的提取率可達90以上。 如條件選擇合適， 發酵液提取酶 酶與菌體的分離 各種酶互相分離30第30頁，共75頁。 -淀粉酶的提取和純化 -淀粉酶 (1,4-D-Glucan glucanohydrolases) 是一種重要的工業用酶 ,它被廣泛應用于 釀酒、紡織、洗滌劑、淀粉加工等工業領域。來源于枯草芽孢桿

12、菌,具有許多優點 ,如熱穩 定性好、活性高等。該酶的分子量約為 48 kDa ,等電點約為 5 ,酶活的最適 pH范圍為 5.36.4 硫酸銨體系pH 調整不方便 ,磷酸鹽體系會造成對環境的污染 雙水相體系： PEG-檸檬酸鹽H2O 檸檬酸鹽可生物降解 ,具有低環境毒性的特點 , 可方便調節 pH 值 ,改善純化效果。31第31頁，共75頁。 成相鹽對-淀粉酶穩定性的影響 來源于枯草芽孢桿菌的-淀粉酶的酶活和穩定性依賴于Ca2+的存在。但雙水相體系中 Ca2+的穩定存在會受到常用成相鹽的干擾 ,如與磷酸鹽形成沉淀，而會與檸檬酸鹽則螯合。0.56% Ca32第32頁，共75頁。 聚合物分子量對-

13、淀粉酶分配的影響33第33頁，共75頁。PEG分子量對-淀粉酶和總蛋白分配的影響34第34頁，共75頁。 pH 對-淀粉酶分配的影響35第35頁，共75頁。 發酵液加入量對-淀粉酶分配的影響36第36頁，共75頁。中性鹽NaCl的加入對-淀粉酶分配的影響37第37頁，共75頁。 用雙水相系統釋放大腸桿菌L-天門冬酰胺酶 L-天門冬酰胺酶,是治療白血病的藥物.主要由微生物發酵生產,屬于胞內酶. 傳統提取純化過程包括制備丙酮粉和緩沖液萃取 . 這種方法要使用大量的丙酮 ,產生細胞碎片,釋放許多細胞內含物 ,會給后續純化步驟帶來困難.38第38頁，共75頁。 聚氧乙烯辛基苯基醚(POOPE)-K2H

14、PO4雙水相系統，釋放重組大腸桿菌細胞內L-天門冬酰胺酶 幾乎所有酶在下相(磷酸鹽相) ,上相中的酶很少 POOPE濃度從 20%55%時 ,單相變為兩相 ,酶釋放率(83.7%46.37%) ,相比 菌濃度1.35.1酶釋放率(101%38.68%) pH =7.18.1, 釋放率60%, 對蛋白的純化系數為7.8。如若進行三級錯流萃取,總收率可達81%,純化系數為8.5。 人生長激素的提取63第63頁，共75頁。 干擾素是合成纖維細胞或小鼠體內細胞的分泌物。不穩定,在超濾或沉淀時易失活,適于雙水相萃取。培養基中總蛋白濃度為1g/L,其濃度僅為0.1mg/L,用一般的PEGDextran體系

15、,不能將干擾素與主要雜蛋白分開, 用具有帶電基團或親和基團的PEG衍生物如PEG-磷酸酯-鹽系統使干擾素分配在上相，雜蛋白完全分配在下相而得到分離，其濃度越高，K越大，純化系數可高達350。已用于1109單位的干擾素的回收，收率達97%。與層析結合，組成雙水相萃取-層析純化聯合流程，已成功地用于工業生產。D. 干擾素(-IFN)的提取64第64頁，共75頁。E 病毒的分離純化 當病毒進入雙水相體系后，在上相和下相間也會發生選擇性分配，表現出一定的分配系數。 控制NaCl濃度(NaCl=lmol)病毒全部在上相 (NaCl=0.15mol)全部分配在下相 彼此分開(NaCl=0.30.5mol)

16、，從而實現各種病毒的提取、純化和反萃取。例如用PEG6000(0.5)和NaDS(硫酸葡聚糖)(0.2)及NaCl(0.3mol)組成的體系，脊髓灰質炎病毒得到80倍的濃縮，活性收率大于或等于90，對某些病毒，若一次萃取后濃度或純度達不到要求，也可采用多次萃取工藝。65第65頁，共75頁。一些病毒在PEG/NaDS/NaCl體系的分配* 仿病毒,NaDS-硫酸葡聚糖66第66頁，共75頁。組合表面活性劑-鹽萃取水楊酸和洛美沙星 采用聚乙二醇(PEG,M = 1500) 與聚乙烯吡咯烷酮(PVP , M = 30000) 組合表面活性劑-(NH4) 2SO42H2O 雙水相體系萃取水楊酸和洛美沙

17、星,兩種藥物的萃取率分別為102 %和69. 0 %。按所采用的方法形成雙水相體系,無需使用振蕩器,操作簡便,方法重現性好,可方便地進行連續萃取。67第67頁，共75頁。 實驗表明:隨著PVP 所占比例越大,PEG分子量越大,分相所需最小鹽量逐漸減小。 藥物在該雙水相體系中的分配只取決于藥物自身性質和PEG-PVP 相的性質和溫度,與藥物濃度無關。 分離pH 條件為6.068第68頁，共75頁。11.5 雙水相萃取技術的進展11.5.1 廉價雙水相體系的開發 變性淀粉PPT代替昂貴的dextran。PPT-PEG體系從發酵液中分離過氧化氫酶、半乳糖苷酶等。PPT-PEG體系比PEG-鹽體系穩定

18、。和PEG-dextran體系非常相似 體 系優 點缺 點(PEG)/(dextran)鹽濃度低活性損失小價格貴粘度大,分相困難(PEG)/鹽成本低,粘度小活性損失大鹽高, 界面吸附多69第69頁，共75頁。優點： (1)蛋白質溶解度大。蛋白質在PPT濃度到15以前沒有沉淀，但在PEG濃度大于5時，溶解度顯著地減小，在鹽溶液中的溶解度更小。 (2)粘度小。PPT的粘度是粗dextran的1/2,傳質好。 價格便宜。PPT幾十$/kg,粗dex幾百$/kg70第70頁，共75頁。11.5.2 雙水相萃取技術同其他分離技術結合A.雙水相體系同生物轉化相結合 雙水相體系對菌體及酶沒有毒性，同時又可將產物萃入上相，所以可消除產物抑制效應：二是使分布在下相的細胞(酶)循環使用，從而為固定化細胞及酶的應用開辟了新路。如將木質素經過酶水解生產乙醇就是很好的一例，流程見圖。71第71頁，共75頁。11.5.2 雙水相萃取技術同其他分離技術結合雙水相萃取同膜分離結合 將膜分離同雙水相萃取技術結合起來，可解決雙水相體系容易乳化和生物大分子在兩相界面的吸附等問題并能加快萃取速率。72第72頁，共