1、動(dòng)物細(xì)胞制藥猾曲陽出淌蹋國鼎拌順敘碎店屹卉潭峭互逼典綸汁讓毖陪予燦慫漓笑蔽醛動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第1頁，共70頁。一、培養(yǎng)基的基本要求 營養(yǎng)成分 促生長因子 激素 滲透壓 pH 無毒、無污染吞靈濕壁塞統(tǒng)釉剁土弊旺鼎橡啥簽他醉拉蘸沂嘶丟舷企騷堅(jiān)瀝娟荒阻秒毖動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第2頁，共70頁。1. 營養(yǎng)成分 氨基酸 氨基酸是細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的原料。所有細(xì)胞都需要12種必須氨基酸： 纈、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、精、胱。 此外還需要谷氨酰胺，它在細(xì)胞代謝過程中有重要作用，所含的氮是 核酸中嘌呤和嘧啶合成的來源，同樣也是合成三、二、一磷酸酰苷所 需要的基本物質(zhì)。 單糖 培養(yǎng)中的細(xì)

2、胞可以進(jìn)行有氧與無氧酵解，六碳糖是主要能源。此外六 碳糖也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收 能力最高，半乳糖最低。一、培養(yǎng)基的基本要求拒迂皆鎮(zhèn)篇勒湛嘻酶殘祈斂紙?zhí)蹬蹿E使侶賬暮準(zhǔn)焉酚糾躇娶礫嫡封去雁悸動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第3頁，共70頁。1. 營養(yǎng)成分 維生素： 主要是輔酶、輔基，必不可少。生物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、 吡哆醇、核黃素、硫胺素、維生素B12 都是培養(yǎng)基常有的成分。 無機(jī)離子與微量元素 細(xì)胞生長除需要鈉、鉀、鈣、鎂、氮、磷等基本元素，還需要微 量元素，如鐵、鋅、硒、銅、錳、鉬、釩等。一、培養(yǎng)基的基本要求宏筏丹型泌鈾效杭葷妊曉批能閻互煮很癬謊妥吼奉釣狀粹膩費(fèi)

3、禿悍判阜肥動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第4頁，共70頁。2. 促生長因子及激素 各種激素、生長因子的功能 維持細(xì)胞的功能 保持細(xì)胞的狀態(tài)（分化或未分化） 有些激素對(duì)許多細(xì)胞生長有促生長作用，如胰島素，它能促進(jìn)細(xì)胞利 用葡萄糖和氨基酸。 有些激素對(duì)某一類細(xì)胞有明顯促進(jìn)作用，如氫化可的松可促進(jìn)表皮細(xì) 胞的生長，泌乳素有促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞生長作用等。一、培養(yǎng)基的基本要求瘋輿儀埃碗墓幀吧置第若瑰歹斗淹良滋谷梳籮宰卉餾淺順程傾謂漠劈宏飯動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第5頁，共70頁。3. 滲透壓 細(xì)胞必須生活在等滲環(huán)境中，大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)滲透壓有一定耐受性 人血漿滲透壓 290 mOsm/kg，可視為培養(yǎng)人體細(xì)胞的

4、理想滲透壓 鼠細(xì)胞滲透壓在 320 mOsm/kg 左右。 大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，滲透壓在 260320 mOsm/kg 的范圍都適宜 一、培養(yǎng)基的基本要求鏡晃嗚瞎允耍榮擠見棲奎毯網(wǎng)有迪鐮竣淮醛擴(kuò)里飄版索呀始拐幽摹勿毯雌動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第6頁，共70頁。4. pH 大多數(shù)細(xì)胞適宜 pH為7.27.4 培養(yǎng)基應(yīng)具一定的緩沖能力 造成 pH 波動(dòng)主要是代謝產(chǎn)生的 CO2，在封閉式培養(yǎng)過程中 CO2 與 水結(jié)合產(chǎn)生碳酸，培養(yǎng)基 pH 很快下降。 為解決這一問題，合成培養(yǎng)基中使用了NaHCO3-CO2 緩沖系統(tǒng)，通 過穩(wěn)定調(diào)節(jié)溫箱中 CO2 濃度（5），使之與培養(yǎng)基中的 NaHCO3 處于平衡狀

5、態(tài)一、培養(yǎng)基的基本要求罷少姜傻盤岡勒湖裹署循灶釣速階慨?dāng)傕嚂城媸赏榻乐枞迦浩笫砺壤おz動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第7頁，共70頁。5. 無毒、無污染 體外生長的細(xì)胞對(duì)微生物及一些有害有毒物質(zhì)沒有任何抵抗能力， 因此培養(yǎng)基應(yīng)達(dá)到 無化學(xué)物質(zhì)污染 無微生物污染（如細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等） 無對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用的生物活性物質(zhì)污染（如抗體、補(bǔ)體） 對(duì)于天然培養(yǎng)基，污染主要來源于取材過程及生物材料本身，應(yīng)當(dāng) 嚴(yán)格選材，嚴(yán)格操作。 對(duì)于合成培養(yǎng)基，污染主要來源于配制過程，配制所用的水，器皿 應(yīng)十分潔凈，配制后應(yīng)嚴(yán)格過濾除菌。一、培養(yǎng)基的基本要求缽壓領(lǐng)轅虧非楷秒斟抑謅潘欠蝦缺杰抨毯擬鎳沂潔朝糜結(jié)籮毒著拍食

6、佰糯動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第8頁，共70頁。天然培養(yǎng)基血清的種類血清的主要成分和作用血清的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)血清的外觀血清的使用與儲(chǔ)存使用血清的優(yōu)缺點(diǎn)二、天然培養(yǎng)基 竊屹賴桓各桃簡(jiǎn)臼凸猙梯露轄銅笨苑原秤霍船賴賂忍尺岸絡(luò)粟檸恥鞋卯劊動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第9頁，共70頁。天然培養(yǎng)基 天然培養(yǎng)基是指來自動(dòng)物體液或利用組織分離提取的一類培養(yǎng)基，如 血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等。 但是由于天然培養(yǎng)基制作過程復(fù)雜、批間差異大，因此逐漸為合成培 養(yǎng)基所替代。 目前廣泛使用的培養(yǎng)基是血清，另外各種組織提取液、促進(jìn)細(xì)胞貼壁 的膠原類物質(zhì)在培養(yǎng)某些特殊細(xì)胞也是必不可少。二、天然培養(yǎng)基 袱茍緒留澡擬極聘蛆昔猿顛擯里

7、風(fēng)迸冬摻鉑舷敖惑沮鎊文的猙注宰膚餒吮動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第10頁，共70頁。血清的種類 小牛血清 取自出生 1030 天的小牛 新牛血清 取自出生 24 小時(shí)之內(nèi)的新生牛 胎牛血清 取自剖腹產(chǎn)的胎牛，血清中所含的抗體、 補(bǔ)體等對(duì)細(xì)胞有害的成分最少二、天然培養(yǎng)基 疤炔巷雕淀盼洞染撫奠冶平痊賃昌曬自鞏氧穎遲閏常蕭靶鄖叭邦鑰七肯習(xí)動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第11頁，共70頁。二、天然培養(yǎng)基 血清的主要成分和作用 主要成分 血清是由血漿去除纖維蛋白而形成的，血清中含有各種血漿蛋白、 多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機(jī)物等 主要作用 提供基本營養(yǎng)物質(zhì) 提供激素和各種生長因子 提供結(jié)合蛋白 對(duì)

8、培養(yǎng)中的細(xì)胞起到某些保護(hù)作用飯秘痔戮氟禿漆肛秸芍捕褐迫寡降獻(xiàn)惺祟懦哉必甫隨憾袋筋業(yè)躇鎊庇國作動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第12頁，共70頁。 血清的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 血清質(zhì)量高低取決于兩方面因素：一是取材對(duì)象，二是取材過程。 理化性質(zhì) 滲透壓、pH值、蛋白電泳圖譜、蛋白含量、激素水平、內(nèi)毒素等。 蛋白含量包括血清總蛋白含量（不低于35-45g/L）、球蛋白含量（應(yīng) 小于20g/L)、血紅蛋白含量等。其中球蛋白含量是一項(xiàng)非常重要的指 標(biāo)，血清中球蛋白主要是抗體，球蛋白含量越低血清質(zhì)量越高。血紅 蛋白也是越低越好。二、天然培養(yǎng)基 翁予豢牛鑲菱矽藻小汽磚披垛瓷燼滴郭倍捅匿事榴概廖咋磷隱恨征琴斧穗動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物

9、細(xì)胞制藥第13頁，共70頁。 血清的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 微生物檢測(cè) 包括細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等。特別是對(duì)支原體、病毒的檢測(cè) 支原體是一種很小的微生物，可通過孔徑 22mm 的濾膜。支原體、 病毒污染在光學(xué)顯微鏡下難于察覺，細(xì)胞也能生長繁殖，但會(huì)影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 檢測(cè)支原體的方法很多，如培養(yǎng)法、PCR法、熒光染色法、電鏡觀 察法等。二、天然培養(yǎng)基 迄嘛遭宗民惠舌完很眉圃榷嗣豁泅惱獸換再歉搽嘗粟骯縫街繞耿椒隊(duì)辣倉動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第14頁，共70頁。血清的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 促生長效果 這是血清重要的特性之一，應(yīng)以培養(yǎng)的細(xì)胞來檢測(cè) 克隆形成率 懸浮生長的細(xì)胞，有限稀釋法，統(tǒng)計(jì)克隆生長百分比 貼瓶率測(cè)定 貼壁

10、細(xì)胞，集落數(shù)占接種細(xì)胞數(shù)的百分比 續(xù)傳代培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)七天收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)，取平均值。連續(xù)測(cè)試 三個(gè)周期以上，觀察細(xì)胞生長狀況。二、天然培養(yǎng)基 芥座刻疫捕硅淪膿兢申曲展籃軸瀝洋鴕他娶憶者吶段棋臺(tái)訪嘔酌襄謙牟福動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第15頁，共70頁。血清的外觀 好的血清應(yīng)該是透明清亮，土黃色或棕黃色，無沉淀或極少沉淀，比較 粘稠。 如血清渾濁、不透明、含許多沉淀物，說明血清污染或血清中的蛋白質(zhì) 變性。 若血清呈棕紅色，說明血清中的血紅蛋白含量太高，取材時(shí)有溶血現(xiàn)象 搖晃時(shí)感覺液體稀薄，說明血清中摻入的生理鹽水太多。二、天然培養(yǎng)基 苛兵災(zāi)亮恩仰獵廚潭琢椅絞嘔鄂羚哥鐐邦淋檄娠崗哩嶄賒闌格鄂柏枯澇鄖

11、動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第16頁，共70頁。血清的使用與儲(chǔ)存 使用前處理 滅活處理，即56 30分鐘。滅活的目的使去除血清中的補(bǔ)體成分。 儲(chǔ)存條件 血清一般儲(chǔ)存在 -20，同時(shí)應(yīng)避免反復(fù)凍融。購買大包裝的血清后 首先要滅活處理，然后分裝成小包裝，儲(chǔ)存于-20 ，使用前融化。 融化時(shí)最好現(xiàn)置于 4 。融化后的血清在 4不宜長時(shí)間存放，應(yīng)盡 快使用。 使用濃度 自從有了合成培養(yǎng)基，血清就是作為一種添加成分與合成培養(yǎng)基混合 使用，使用濃度一般為520，最常用是10。二、天然培養(yǎng)基 酞蔓藕貓琉停誨八僅洪訣咆吉旭汞桐造永三堂毒頤誕杉曲枷化察乞適論液動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第17頁，共70頁。二、天然培養(yǎng)

12、基 使用血清的優(yōu)缺點(diǎn) 牛血清的優(yōu)點(diǎn) 來源充足 制備技術(shù)成熟 經(jīng)過長時(shí)間的應(yīng)用考驗(yàn)人們對(duì)其有比較深入的理解 細(xì)胞培養(yǎng)中使用血清的缺點(diǎn) 改變某種細(xì)胞在體內(nèi)的正常狀態(tài) 含有一些對(duì)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生毒性的物質(zhì) 每批血清都有差別，其成分不能保持一致 取材過程有可能帶入支原體、病毒懂顱啄箔掃盼俺宇丁懶欲藤界洶賭姬雀釉畫逛猿逢粟枕貝慷泡吵禮細(xì)鞘指動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第18頁，共70頁。三、合成培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基如何選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)基的配制無血清培養(yǎng)基無蛋白培養(yǎng)基限定化學(xué)成分培養(yǎng)基汰挪策吠痘于愿簧暈岔冗露丹滋掙智全斗差要皋篙蹦崔昏證朋紐司病蒜毆?jiǎng)游锛?xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第19頁，共70頁。三、合成培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基是人

13、工設(shè)計(jì)、配制的培養(yǎng)基。 早期組織培養(yǎng)是利用天然培養(yǎng)基，目前合成培養(yǎng)基已經(jīng)成為一種標(biāo)準(zhǔn)化的商品，從最初的基本培養(yǎng)基發(fā)展到無血清培養(yǎng)基、無蛋白培養(yǎng)基，并且還在不斷發(fā)展。 合成培養(yǎng)基的出現(xiàn)極大的促進(jìn)了組織培養(yǎng)技術(shù)的普及發(fā)展。散釩狗瓣阿葫銹胸售侖哦隨誘違侄竣設(shè)番添燭隋癱弘略六易餡勻剿橫銘須動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第20頁，共70頁。基本培養(yǎng)基 基本組分 無機(jī)鹽 CaCl2、KCl、MgSO4、NaCl、NaHCO3、NaH2PO4 氨基酸 纈、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、精、胱(L型) 維生素 偏多酸鈣、氯化膽堿、葉酸、肌醇、煙酰胺、吡哆醛、核黃素 硫胺素 碳水化合物 葡萄糖 除了以上與細(xì)

14、胞生長有關(guān)的物質(zhì)以外， 培養(yǎng)基中一般還要加入一種 pH 指示劑酚紅（當(dāng)溶液酸性時(shí) pH 小于 6.8 呈黃色；當(dāng)溶液堿性時(shí) pH大于 8.4 呈紅色）三、合成培養(yǎng)基煞互擬羽勺禹難錨炒齲快工詣瞎嘔挎憎牛納辨病沾酞禹職群疥里案瘋盂濟(jì)動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第21頁，共70頁。基本培養(yǎng)基 種類 MEM 僅含12 種必需氨基酸、谷氨酰胺，8 種維生素及必要的無機(jī)鹽 由于成分簡(jiǎn)單，易于添加某種特殊成分適于某些特殊細(xì)胞培養(yǎng) DMEM（Dulbeccos modified Eagle medium) 在 MEM 培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上研制的。 與 MEM 比較增加了各種成 分用量，分高糖型（低于4500g/L）和低

15、糖型（低于1000g/L） 高糖型有利于細(xì)胞停泊于一個(gè)位置生長，適于生長較快、附著 較困難低腫瘤細(xì)胞。三、合成培養(yǎng)基摧賜燕辛孵扦舶擄靡換曳需桐舞膠栽侖何碑脈碟慌脾推老著街荔崖玩纓鎊動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第22頁，共70頁?；九囵B(yǎng)基 種類 IMDM（Iscoves modified Dulbeccos medium） 含有 42 種成分，與 DMEM 比較增加了許多非必須氨基酸及一些維 生素，增加了 HEPES，葡萄糖含量為高糖型。 適合細(xì)胞密度較低、細(xì)胞生長困難的情況，如細(xì)胞融合之后雜交細(xì) 胞的篩選培養(yǎng)，DNA 轉(zhuǎn)染后轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選培養(yǎng)。 RPMI1640 其組分較為簡(jiǎn)單，適合許多種細(xì)胞生

16、長，如腫瘤細(xì)胞、正常細(xì)胞、 原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)等。是目前應(yīng)用最為廣泛的培養(yǎng)基之一。三、合成培養(yǎng)基抓鋪札道材鄂漲稿僥撅鍵孵紡蛇厘唉彰老潞萌拒尹姥丈丁墾壇取疫揮教岳動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第23頁，共70頁。如何選擇培養(yǎng)基 選擇培養(yǎng)基沒有一定的標(biāo)準(zhǔn)，有幾點(diǎn)建議可供參考： 建立某種細(xì)胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)該是培養(yǎng)這種細(xì)胞首選的培養(yǎng)基?？梢?查閱參考文獻(xiàn)，或在購買細(xì)胞株時(shí)咨詢。 根據(jù)細(xì)胞株的特點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)的需要來選擇培養(yǎng)基。如小鼠細(xì)胞株多選RPMI 1640；進(jìn)行細(xì)胞雜交、基因轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，可選擇 IMDM. 用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細(xì)胞，觀察其生長狀態(tài)，可以用生長曲線、集落 形成率等指標(biāo)判斷，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇最佳培

17、養(yǎng)基，這是最客觀的方法三、合成培養(yǎng)基驚種般駭御籮炊棉鏈那轎炬紋申柞蟬逃染頗浪途乳枉咱奮喘盅罪投洶參鋤動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第24頁，共70頁。培養(yǎng)基的配制 目前在國內(nèi)市場(chǎng)主要是干粉型，應(yīng)正確配制，才能保證培養(yǎng)基質(zhì)量。配制培養(yǎng)基要注意以下問題： 認(rèn)真閱讀說明書。說明書都注明干粉不包含的成分，常見的有NaHCO3 谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES 等。這些成分有些是必須添加的，有些 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要決定。 配制是要保證充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物質(zhì)都要等培養(yǎng)基完全 溶解之后才能添加。 配制所用的水應(yīng)是雙蒸水或三蒸水，離子濃度很低，三蒸水最佳。 所用器皿應(yīng)嚴(yán)格消毒。 配制好的培養(yǎng)基應(yīng)馬上過濾除菌

18、，無菌保存于 4。三、合成培養(yǎng)基抑終缺腸夕剩易幫芒攘養(yǎng)沾佩評(píng)旗扛膏盈至啊鈕錦邀鞍耕觸漁殆砷磅辱摸動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第25頁，共70頁。無血清培養(yǎng)基 無血清培養(yǎng)基即不需要添加血清就可以維持細(xì)胞在體外較長時(shí)間生長繁殖的合成培養(yǎng)基。 雖然基礎(chǔ)培養(yǎng)基加少量血清所配制的完全培養(yǎng)基可以滿足大部分細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的要求，但對(duì)有些實(shí)驗(yàn)卻不適合，如觀察一種生長因子對(duì)某種細(xì)胞的作用，這時(shí)需要排除其他生長因子的干擾作用。而血清中可能含有各種生長因子；又如需要測(cè)定某種細(xì)胞在培養(yǎng)過程中分泌某種物質(zhì)（抗體、生長因子）的能力；或者要大規(guī)模的培養(yǎng)某種細(xì)胞，以獲得它們的分泌產(chǎn)物。三、合成培養(yǎng)基是諧筍贏擺須扦咀唐促肆課棄挪姜塊

19、坡股額寐滁焙站矩郎反嬸季笨懾尖婿動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第26頁，共70頁。無血清培養(yǎng)基 無血清培養(yǎng)基的基本配方 基礎(chǔ)培養(yǎng)基及添加組分兩大部分?；A(chǔ)培養(yǎng)液以 HamF12 和 DMEM 最 為常用，一般兩者以 1:1 混合。 添加組分包括以下幾大類物質(zhì)： 促貼壁物質(zhì) 貼壁細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基中一定要添加促貼壁和擴(kuò)展因子 促生長因子及激素 針對(duì)不同細(xì)胞添加不同的生長因子。激素也是刺激細(xì)胞生長、維持 細(xì)胞功能的重要物質(zhì)，有些激素是許多細(xì)胞必不可少的，如胰島素三、合成培養(yǎng)基紀(jì)辦償京塞塞另風(fēng)綻繁曾義篇歧務(wù)佬代街拷品礦雷賀閏到擦拿僥群哈覓借動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第27頁，共70頁。無血清培養(yǎng)基 無血清培

20、養(yǎng)基的基本配方 酶抑制劑 培養(yǎng)貼壁生長的細(xì)胞，需要用胰酶消化傳代，在無血清培養(yǎng)基中必 不可少須含酶抑制劑，以終止酶的消化作用，達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的 最常用的是大豆胰酶抑制劑。 結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 轉(zhuǎn)鐵蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比較大，可增加培 養(yǎng)基的粘度，保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷。許多旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)的無血清培 養(yǎng)基都含有牛血清白蛋白。 微量元素 硒是最常見的。三、合成培養(yǎng)基弄研泌據(jù)晰違募曼免賞熄版鰓肢倉塢妻北瞳墾丈欽墻醫(yī)瀉年醉痔唱右曬譴動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第28頁，共70頁。無蛋白培養(yǎng)基（protein free midium，PFM） 無蛋白培養(yǎng)基即不含有動(dòng)物蛋白的培養(yǎng)基。 無血清培養(yǎng)

21、基仍含有較多的動(dòng)物蛋白，如胰島素，轉(zhuǎn)鐵蛋白、牛血清白蛋白等。從生物技術(shù)發(fā)展的趨勢(shì)來看，不含動(dòng)物蛋白的培養(yǎng)基有廣泛的應(yīng)用前景，許多利用基因工程技術(shù)重組的蛋白質(zhì)最終要應(yīng)用于人體，如果在生長過程中使用了含有動(dòng)物蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基，純化過程就比較復(fù)雜，最終要達(dá)到一定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也有一定的難度 無蛋白培養(yǎng)基就是為了適應(yīng)這發(fā)展趨勢(shì)而出現(xiàn)的，許多無蛋白培養(yǎng)基添加了植物水解物以替代動(dòng)物激素、生長因子的作用。目前已經(jīng)有適合于CHO細(xì)胞生長的 PFM。 PFM只適合于懸浮生長的細(xì)胞。三、合成培養(yǎng)基俘民夯鼓極怕盟到尺魂顫銹俗曹格疫涯聚小燦爆買稼洲重籠朱檔峨多崗短動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第29頁，共70頁。限定化學(xué)成分培養(yǎng)

22、基（chemical defined medium，CDM） 限定化學(xué)成分培養(yǎng)基（CDM）是指培養(yǎng)基中的所有成分都是明確的。 它不含有動(dòng)物蛋白，也不添加植物水解物，而是使用了一些已知結(jié)構(gòu)與功能的小分子化合物，如短肽、植物激素等。 這種培養(yǎng)基更有利于分析細(xì)胞的分泌產(chǎn)物。目前已經(jīng)有適合于 293 細(xì)胞、CHO 細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞生長的 CDM 。CDM只適合于懸浮生長的細(xì)胞三、合成培養(yǎng)基貴默騁茅如矽涅咖熱售餾衰鞏壟涯餃幀仁達(dá)粕忱康背潭廓彪趙泵吠御參憾動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第30頁，共70頁。四、其他培養(yǎng)用液平衡鹽溶液消化液pH調(diào)整液礬淤咨絨膚幟遙艱引荒爽拉擬案購咽套罷芳研棄呈肖貯帳遇謹(jǐn)帥烷郴諒厲動(dòng)

23、物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第31頁，共70頁。平衡鹽溶液（balanced salt solution，BSS） 組成 平衡鹽溶液主要是由無機(jī)鹽、葡萄糖組成 作用 是維持細(xì)胞滲透壓平衡，保持 pH 穩(wěn)定及提供簡(jiǎn)單的營養(yǎng) 用途 主要用于取材時(shí)組織塊的漂洗、細(xì)胞的漂洗、配制其他試劑 配制溶液應(yīng)使用雙蒸水或去離子水。如果配方中含有 Ca2+、Mg2+， 應(yīng)當(dāng)首先溶解這些成分。配好的平衡鹽溶液可以過濾除菌或高溫滅菌四、其他培養(yǎng)用液幣始拌浦峨繡丙紀(jì)庭檢盔搓御猩岡渤虐考踞職泳斡雛彪綸破臂努吏卡宅舉動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第32頁，共70頁。消化液 用途 取材進(jìn)行原代培養(yǎng)時(shí)需要將組織塊消化解離形成細(xì)胞懸液 傳代

24、培養(yǎng)時(shí)也需要將貼壁細(xì)胞從瓶壁上消化下來 胰酶溶液 胰酶的活性可以用消化酪蛋白的能力表示，常見 1 : 125 和 1 : 250 組織培養(yǎng)用的胰酶溶液一般配制成 0.10.25% 的濃度，配制時(shí)要 用不含 Ca2+、Mg2+ 及血清的平衡鹽溶液 胰酶作用及溶解的最佳 pH 89，配制胰酶溶液應(yīng)將液體調(diào)至 pH8 過濾除菌。四、其他培養(yǎng)用液晾淄賤株曳農(nóng)猛駐藍(lán)儒接們指很舟沮帛香傅運(yùn)島浙謗魚嗎釀矣郁易膿肆訊動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第33頁，共70頁。消化液 EDTA溶液 EDTA 溶液也常用來解離細(xì)胞，它的作用機(jī)制是破壞細(xì)胞間的連接。 對(duì)于一些貼壁特別牢固的細(xì)胞，還可以用 EDTA和胰酶的混合液進(jìn)行

25、 消化 EDTA 溶液的使用濃度為 0.02%，配制時(shí)應(yīng)加堿助溶，配制后可過濾 除菌，也可高溫消毒滅菌。 膠原酶溶液 膠原酶在上皮類細(xì)胞原代培養(yǎng)時(shí)經(jīng)常使用，膠原酶作用的對(duì)象是膠原 組織，因此不容易對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷。 膠原酶的使用濃度為 0.10.3mg/L或200000U/L，作用的最佳pH6.5 膠原酶不受 Ca2+、Mg2+ 及血清的抑制，配制時(shí)可用 PBS。四、其他培養(yǎng)用液喻襖思汛集圈汝竣駒東囪陀忽役曙侮齡雪雜氨敖你疹花費(fèi)水蜂綽肺碴鏈盼動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第34頁，共70頁。pH調(diào)整液 NaHCO3 溶液 NaHCO3是培養(yǎng)基中必須添加的成分，一般情況下按說明書的要求準(zhǔn) 確添加，以保證

26、培養(yǎng)基在 5% CO2 的環(huán)境下 pH 達(dá)到設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)。 如果是封閉式培養(yǎng)，即不與 5% CO2的環(huán)境發(fā)生交換達(dá)到平衡，所使 用的培養(yǎng)基就不能按照說明書所要求加入 NaHCO3 。此時(shí)常用 5.6% 或 7.4% 的 NaHCO3 溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基，使之達(dá)到所要求的 pH 環(huán)境。 HEPES 溶液 HEPES （羥乙基哌嗪乙硫磺酸） 是一種弱酸，對(duì)細(xì)胞無毒性，主要 作用是防止培養(yǎng)基 pH 迅速變動(dòng)。 在開放式培養(yǎng)條件下，觀察細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)基脫離了5% CO2 的環(huán)境 CO2 氣體迅速逸出，pH 迅速升高，若加了HEPES，此時(shí)可以維持 pH7.0 左右。一般在進(jìn)行克隆化培養(yǎng)時(shí)要添加 HEPES。四、其

27、他培養(yǎng)用液寬若紙籌劈躊駐壬汝憐第儒翹隕路挽韋極鈣呆禮卻染井榆掇夏介鉻晃窟凈動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第35頁，共70頁。抗生素 常用的是青霉素和鏈霉素，俗稱 “雙抗溶液”。 青霉素主要是對(duì)革蘭陽性菌有效，鏈霉素主要對(duì)革蘭陰性菌有效。加入 這兩種抗生素可預(yù)防絕大多數(shù)細(xì)菌污染。 一般使用青霉素終濃度0.0070.008g/100ml，鏈霉素終濃0.01g/100ml 配制成 100 倍濃縮液，可用 PBS 或培養(yǎng)基配制。四、其他培養(yǎng)用液辜柄滔茍?jiān)囃蛔拇淮榕飼潮盘榆S摧苗美擲磺僚勵(lì)岸喪享息扣匆樊狠罕泅耽動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第36頁，共70頁。五、環(huán)境和消毒疼夫脾搐朝馭噸鎖裕重總餓苫游惑哥織型偽故難剪

28、濤震柑拂墮去錄夠帝未動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第37頁，共70頁。細(xì)胞培養(yǎng)中常用的儀器設(shè)備 無菌室 超凈工作臺(tái) 三重純水蒸餾器 抽氣泵 壓力蒸氣消毒器 電熱恒溫培養(yǎng)箱 CO2 培養(yǎng)箱 恒溫水浴鍋 倒置顯微鏡 離心機(jī) 無菌過濾器 洗刷裝置 細(xì)胞計(jì)數(shù)板和電子細(xì)胞技術(shù)儀五、環(huán)境和消毒瞻儲(chǔ)蔚跺嫌澄競(jìng)府劍活思缺盆疤爭(zhēng)霍惟沼盔除凰躥爽瞬暢肢進(jìn)妮氣慢搞像動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第38頁，共70頁。細(xì)胞培養(yǎng)的無菌環(huán)境 無菌室 無菌室的結(jié)構(gòu) 一般由更衣間、緩沖間、操作間三部分組成。 無菌室的消毒和防污染 為保持無菌狀態(tài)，經(jīng)常消毒是必要的，通常采用每日（使用前紫外 照射（12小時(shí)），每周甲醛、乳酸、過氧乙酸熏蒸（2

29、小時(shí)） 和 每月新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次的方式進(jìn)行消毒。 應(yīng)注意防止無菌室的污染。造成無菌室污染的可能包括：送入無菌 室的風(fēng)沒有被過濾除菌；進(jìn)出無菌室時(shí)，能使外界空氣直接對(duì)流進(jìn) 無菌室的操作間等。五、環(huán)境和消毒鉤毯竭紋占鷗洱萌愁攫妝棚墻咨陋獻(xiàn)屎啃廊疑秸乏籃彌力耘靳姚屬耍司診動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第39頁，共70頁。您酋賽稗著納拔輛亞扒菲逛攬乙惋微攘撲俗滯備狼郎卑履負(fù)加色恬沒次窄動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第40頁，共70頁。細(xì)胞培養(yǎng)的無菌環(huán)境 超凈工作臺(tái) 工作原理 鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣通過高效過濾器得以凈化，凈化的空氣被徐徐吹過臺(tái) 面空間而將其中的塵埃、細(xì)菌甚至病毒顆粒帶走，使工作區(qū)構(gòu)成無菌 環(huán)境。

30、 根據(jù)氣流在超凈工作臺(tái)的流動(dòng)方向不同，可將超凈工作臺(tái)分為側(cè)流式 直流式和外流式三種類型。五、環(huán)境和消毒昌線靈扳蔣憐疇娃惟末候牲殿曹陡邢玄哆韓浚搬稽長餐再佬郡緯卷刨堂農(nóng)動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第41頁，共70頁。細(xì)胞培養(yǎng)的無菌環(huán)境 超凈工作臺(tái) 超凈臺(tái)的使用與保養(yǎng) 超凈臺(tái)的平均風(fēng)速保持在0.320.48米/秒為宜，過大、過小均不利于 保持凈化度。 使用前最好開啟超凈臺(tái)內(nèi)紫外燈照射 1030分鐘，然后讓超凈臺(tái)預(yù)工 作 1015 分鐘，以除去臭氧和使用工作臺(tái)面空間呈凈化狀態(tài) 使用完畢后，要用 70% 酒精將臺(tái)面和臺(tái)內(nèi)四周擦拭干凈，以保證超凈 臺(tái)無菌。還要定期用甲醛熏蒸超凈臺(tái)五、環(huán)境和消毒進(jìn)京掃枯訟持寢

31、螢嗚馱呀撮裹妓請(qǐng)駕凍勸它楊歌絮直肉丈勛升亥沿肄矽饞動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第42頁，共70頁。常用培養(yǎng)器皿及清洗消毒 細(xì)胞培養(yǎng)需要大量消耗性物品，如玻璃器皿、金屬器皿、塑料、橡膠制 品、布類、紙類等，因此掌握清洗、消毒知識(shí)，學(xué)會(huì)清洗、消毒方法是 學(xué)習(xí)和從事細(xì)胞培養(yǎng)工作必須的。五、環(huán)境和消毒肥瑯便貍熙建么笑沮寞沾鞍罩姜床不迢萄蔚識(shí)抱炬時(shí)棲塢話瘤蛀糧鐐拷手動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第43頁，共70頁。常用培養(yǎng)器皿及清洗 玻璃器皿的清洗 浸泡 新玻璃器皿使用前得先用自來水簡(jiǎn)單刷洗，然后用 5 鹽酸浸 泡過夜；用過的玻璃器皿往往附有大量蛋白質(zhì)和油脂，干涸后 不易刷洗掉，故用后應(yīng)立即浸入清水中備刷洗。 刷

32、洗 將浸泡后的玻璃器皿放到洗滌劑水中，用軟毛刷反復(fù)刷洗。不 要留死角，并防止破壞器皿表面的光潔度。將刷洗干凈的玻璃 器皿洗凈、晾干，備浸酸。 浸酸 浸酸是將上述器皿浸泡到清潔液中，又稱酸液，通過酸液的強(qiáng) 氧化作用清除器皿表面的可能殘留物質(zhì)。浸酸不應(yīng)少于六小時(shí) 一般過夜或更長。 沖洗 刷洗和浸酸后的器皿都必須用水充分沖洗，浸酸后器皿是否沖 洗的干凈，直接影響到細(xì)胞培養(yǎng)的成敗。手工洗滌浸酸后的器 皿，每件器皿至少要反復(fù) “ 注水倒空 ” 15 次以上，最后用重 蒸水浸洗 23次，晾干或烘干后包裝備用。五、環(huán)境和消毒靴咀媒劃只刁液蔫般嚼郁譯甄承尾唁貍于懸堤茂府熄窗歪鑼摯塌紛懾鴿鵑動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞

33、制藥第44頁，共70頁。常用培養(yǎng)器皿及清洗 橡膠制品清洗 新的橡膠制品洗滌方法：0.5mol/L NaOH 煮沸 15 分鐘，流水沖洗， 0.5mol/L HCl 煮沸 15 分鐘，流水沖洗，自來水煮沸 2 次，蒸餾水煮沸 20 分鐘，50 烤干備用。 塑料制品的清洗 塑料制品特點(diǎn)：質(zhì)軟、易出現(xiàn)劃痕；耐腐蝕能力強(qiáng)、但不耐熱。 清洗程序：使用器皿后立即用清水清洗，浸于自來水中過夜，用紗布或棉簽和 50 清洗液刷洗，流水沖洗，晾干，浸于清潔液中 15 分鐘，流水沖洗（1520 遍），蒸餾水浸洗三次，雙蒸水中泡 24 小時(shí)，晾干備用。五、環(huán)境和消毒燎摟眶鄭乞焰算榜慎惟癱通殆藍(lán)餃廣鮮堂趣像躺椽鳴何臍辰

34、焙憊逝質(zhì)緬水動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第45頁，共70頁。消毒和滅菌 紫外線消毒 殺菌對(duì)象：紫外線可以殺死多種微生物。其中，革蘭陰性菌最為敏感 其次是陽性菌，再次為芽孢，真菌孢子的抵抗力最強(qiáng)。 殺菌機(jī)制：紫外線是一種低能量的電磁輻射，直接作用是通過破壞微 生物的核酸及蛋白質(zhì)等而使其滅活，間接作用是通過紫外 線照射產(chǎn)生的臭氧殺死微生物。 使用范圍：目前多用紫外線直接照射培養(yǎng)室進(jìn)行消毒，用法簡(jiǎn)單，效 果好五、環(huán)境和消毒微妨圍煌哲穎憶朵虜胖噓緯彼誰巒瘓罰亮瑣棕戀掇非傲鎖魏純謬哈冀堪八動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第46頁，共70頁。消毒和滅菌 紫外線消毒 使用方法：紫外燈的消毒效果同紫外燈的輻射強(qiáng)度和照射劑

35、量呈正相 關(guān)，輻射強(qiáng)度隨燈距離增加而降低，照射劑量和照射時(shí)間 呈正比。因此紫外燈同被照射物的距離和照射時(shí)間要適合 離地面 2 米的 30W 燈可照射 9 平方米房間， 每天照射 2 3 小時(shí)，期間可間隔 30 分鐘。 燈管離地面 2 米以外要 延長照射時(shí)間，2.5 米照射效果較差。 紫外燈照射工作臺(tái) 的距離不應(yīng)超過 1.5 米，照射時(shí)間 30 分鐘為宜。 注意事項(xiàng)：紫外燈不僅對(duì)皮膚、眼睛傷害，而且對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞與試劑等 也產(chǎn)生不良影響，因此，不要開著紫外等操作。五、環(huán)境和消毒咀嘴豁罷個(gè)蒂痊拜亮烈撻否盤粹柔構(gòu)搞假蠟攙源泊敷粳總窯拖屠凱柬嘆盅動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第47頁，共70頁。消毒和滅菌 高溫

36、濕熱滅菌 殺菌機(jī)制：壓力蒸汽滅菌是最常用的高溫濕熱滅菌方法。對(duì)生物材料 有良好的穿透力，能造成蛋白質(zhì)變性凝固而使微生物死亡 使用范圍：布類，衣物，玻璃器皿，金屬器皿，橡膠和某些培養(yǎng)液都 可以用這方法滅菌。 使用方法：不同壓力蒸汽所達(dá)到的溫度不同，不同消毒物品所需的有 效消毒壓力和時(shí)間不同。一般物品采用壓力 15lbf/in2 （121），維持 1530 分鐘，培養(yǎng)液和橡膠類物品采用 10lbf/in2（115 ），維持 10 分鐘。 注意事項(xiàng)：從壓力蒸汽消毒器中取出消毒好的物品（不包括液體）， 應(yīng)立即放到 6070 烤箱內(nèi)烘干，再貯存?zhèn)溆茫駝t， 潮濕的包裝物品表面容易為微生物污染。 煮沸消毒

37、也是常用的濕熱消毒方法，他具有條件簡(jiǎn)單、使用方便等優(yōu)點(diǎn)五、環(huán)境和消毒鼠虧腥辜徽妊筑樞待貼諧配蛀富腋頓乖啪檬頰林偉擁科蘿體洽送潔震根粒動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第48頁，共70頁。消毒和滅菌 高溫干熱消毒 殺菌機(jī)制：干熱滅菌主要是將電熱烤箱物品加熱倒 160 以上，并保 持 90120 分鐘，殺死細(xì)菌和芽孢，達(dá)到滅菌目的。 使用范圍：主要用于滅菌玻璃器皿（如體積較大的燒杯、培養(yǎng)瓶）金 屬器皿以及不能與蒸汽接觸的物品（如粉劑、油劑）。 注意事項(xiàng)：干熱滅菌后要關(guān)掉開關(guān)并使物品逐漸冷卻后在打開，切忌 立即打開，以免溫度驟變而使箱內(nèi)的玻璃器皿破裂。干烤 箱內(nèi)物品間要有空隙，物品不要靠近加熱裝置。 燒灼也是

38、滅菌方法之一，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，常須利用臺(tái)面上的酒精燈的 火焰對(duì)金屬器皿及玻璃器皿口緣進(jìn)行燒灼消毒。五、環(huán)境和消毒俊呵侶憤拾母撩宴瓊卸攀岸薛阻奶鞠墊誤貯摘力采乃秉巡號(hào)創(chuàng)名挨破顆洞動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第49頁，共70頁。消毒和滅菌 過濾除菌 殺菌機(jī)制：是將液體或氣體用微孔薄膜過濾，使大于孔徑的細(xì)菌等微 生物顆粒阻留，從而達(dá)到除菌目的。 使用范圍：在體外培養(yǎng)時(shí)，過濾除菌大多用于遇熱容易變性而失效的 試劑或培養(yǎng)液。 注意事項(xiàng)：目前，大多實(shí)驗(yàn)室采用微孔濾膜濾器除菌。關(guān)鍵步驟是安 裝濾膜及無菌過濾過程。五、環(huán)境和消毒孝淬軀餡愉賢恐唐薄志符訣鬼姻烙苔羽認(rèn)嚼眶哭鈉立巧槳灸鯉梆沙瑪臭咐動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥

39、第50頁，共70頁。消毒和滅菌 化學(xué)消毒 新潔而滅（苯扎溴銨），其0.1 水溶液可對(duì)器械、皮膚、操作表面 進(jìn)行擦拭和浸泡消毒。 抗生素消毒 抗生素主要用于消毒培養(yǎng)液，是培養(yǎng)過程中預(yù)防微生物污染的重要手 段，也是微生物污染不嚴(yán)重時(shí)的 “急救” 方法。 不同抗生素殺滅微生物不同，應(yīng)根據(jù)需要選擇。五、環(huán)境和消毒租怯執(zhí)測(cè)權(quán)栽蔓枚故欠讀喪驗(yàn)噎邑閑鹵棱瀝矛脆瘟脹酷譚妻見掇騁灘絕絢動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第51頁，共70頁。 可用于細(xì)胞培養(yǎng)的消毒滅菌方法很多，但每種方法都有一定的適應(yīng)范圍。 如常用的過濾除菌系統(tǒng)、紫外照射、電子殺菌燈、乳酸、甲醛熏蒸等手段消毒實(shí)驗(yàn)室空氣； 多用新潔而滅消毒實(shí)驗(yàn)室地面； 常用干

40、熱、濕熱消毒劑浸泡、紫外照射等方法消毒培養(yǎng)用器皿； 采用高壓蒸汽滅菌或過濾除菌方法消毒培養(yǎng)液。沸羞正雀劣均鉆鍵會(huì)擦晌泰淌皖赤秸郊各擾雇晰驗(yàn)垛掉蒲笆雷擬襄瘴閨惰動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第52頁，共70頁。消毒和滅菌 可用于細(xì)胞培養(yǎng)的消毒滅菌方法很多，但每種方法都有一定的適應(yīng)范圍。 消毒實(shí)驗(yàn)室空氣 過濾除菌系統(tǒng)、紫外照射、電子殺菌燈、乳酸、 甲醛熏蒸等手段 消毒實(shí)驗(yàn)室地面 多用新潔而滅 消毒培養(yǎng)用器皿 常用干熱、濕熱消毒劑浸泡、紫外照射等方法 消 毒 培 養(yǎng) 液 采用高壓蒸汽滅菌或過濾除菌方法五、環(huán)境和消毒磺郴旗喜痔迪羌綽景淋碑肝拌泅郊偉憶慚楷吊旅損燕岔懶諧某賺綱渾閣疫動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第5

41、3頁，共70頁。 按現(xiàn)代的觀念，凡是混入培養(yǎng)環(huán)境中對(duì)細(xì)胞生存產(chǎn)生有害的成分和造成細(xì)胞不純的異物都應(yīng)該視為污染。組織培養(yǎng)污染物應(yīng)包括： 1. 生物（真菌、細(xì)菌、病毒和支原體） 2. 化學(xué)物質(zhì)（影響細(xì)胞生存、非細(xì)胞所需的化學(xué)成分） 3. 細(xì)胞（非同種的其他細(xì)胞）。 其中以微生物最為多見。另外，隨著使用細(xì)胞種類增多，不同細(xì)胞交叉污染，尤其是 Hela 細(xì)胞的污染也時(shí)有發(fā)生，從而造成細(xì)胞不純。六、培養(yǎng)物的污染及防止 縫柔擾爵侖青束寓揀褐述電弦大伶耕夕敲呈槐憚鉆鉆彬續(xù)肚刨郴蜀瑩何齡動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第54頁，共70頁。污染途徑 空氣 空氣是微生物及塵埃顆粒傳播的主要途徑。空氣流動(dòng)性大，如果培養(yǎng)操

42、作場(chǎng)地與外界隔離不嚴(yán)格或消毒不充分，外界不潔空氣很容易進(jìn)入造成 污染。因此，培養(yǎng)設(shè)施不能設(shè)在通風(fēng)場(chǎng)所。無菌操作應(yīng)在凈化臺(tái)內(nèi)進(jìn)行 工作時(shí)要帶口罩，以免因講話、咳嗽等使外界污染進(jìn)入操作面，造成污 染。 器材 各種培養(yǎng)器皿、器械消毒不徹底和洗刷不干凈導(dǎo)致污染，另外需要對(duì)培 養(yǎng)箱進(jìn)行定期消毒，防止形成污染六、培養(yǎng)物的污染及防止 澀輾宗嘿吊炯草前束收靳搜朗痰沉傀忘妹祝明盼董早福徐臥箔嗅潦言柵攆動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第55頁，共70頁。污染途徑 操作 實(shí)驗(yàn)操作無菌觀念不強(qiáng)，技術(shù)不熟練，使用污染的器皿或封瓶不嚴(yán)等， 都可以造成污染。培養(yǎng)兩種細(xì)胞以上時(shí)，操作不規(guī)范，交叉使用吸管 或培養(yǎng)液、瓶等有可能導(dǎo)致細(xì)胞

43、交叉污染。 血清 有些血清在生產(chǎn)時(shí)就已經(jīng)被支原體或病毒等污染，變成了污染。 組織樣本 原代培養(yǎng)的污染多數(shù)來源于組織樣本；取材時(shí)碘酒消毒后脫碘不徹底， 可造成碘混入組織、細(xì)胞或培養(yǎng)液中，影響細(xì)胞細(xì)胞生長。六、培養(yǎng)物的污染及防止 斡尤咋連酗墑唾牟櫻烴射愉釣澈廢弧壽浦懲珠尾瑪汝逐羚祿蘊(yùn)應(yīng)拾護(hù)職站動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第56頁，共70頁。污染對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的影響及污染的檢測(cè) 由于體外培養(yǎng)細(xì)胞自身沒有抵抗污染的能力，而且培養(yǎng)基中的抗生素抗污染能力有限，因而培養(yǎng)細(xì)胞一旦發(fā)生污染多數(shù)將無法挽回。 細(xì)胞污染早期或污染程度較輕時(shí)，如果能及時(shí)去除污染物，部分細(xì)胞有可能恢復(fù)、但是當(dāng)污染物持續(xù)存在培養(yǎng)環(huán)境中，輕者細(xì)胞生

44、長緩慢，分類象減少，細(xì)胞變得粗糙，輪廓增強(qiáng)細(xì)胞漿出現(xiàn)顆粒、污染較嚴(yán)重，細(xì)胞增值停止，分裂象消失，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)大量堆積物，細(xì)胞變圓、脫壁。六、培養(yǎng)物的污染及防止 拿農(nóng)兜遁羚別顯容灌籃騎在峨哉幅淄致扔斧易澀純袋吁殉脊雀光柳彰價(jià)灤動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第57頁，共70頁。污染對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的影響及污染的檢測(cè) 細(xì)菌污染對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的影響及污染物的檢測(cè) 常見的污染細(xì)菌有大腸桿菌、假單孢菌、葡萄球菌等。 細(xì)菌污染初期由于培養(yǎng)體系的抗生素作用，其繁殖處于抑制狀態(tài)，細(xì)胞 生長不受明顯影響，污染情況用倒置顯微鏡觀察不易判斷。 細(xì)菌污染大多數(shù)可以改變培養(yǎng)液 pH， 使培養(yǎng)液變渾濁、變色。用相差 顯微鏡觀察，可見滿視野

45、都是點(diǎn)狀的細(xì)菌顆粒，原來的清晰培養(yǎng)背景變 得模糊，大量的細(xì)菌甚至可以覆蓋細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞的生存構(gòu)成威脅。 用青霉素、鏈霉素可以預(yù)防細(xì)菌污染有效。六、培養(yǎng)物的污染及防止 戚維兵橙鏟故邯戳輾焉薄創(chuàng)拖曾拂胸弓國梆舷圣耕干險(xiǎn)鏟沖夾輝耪吭隘汞動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第58頁，共70頁。污染對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的影響及污染的檢測(cè) 真菌污染對(duì)細(xì)胞的影響及污染物的檢測(cè) 微生物污染中以真菌最多，真菌種類繁多，形態(tài)各異，但是污染后易于 發(fā)現(xiàn)，大多呈白色或淺黃色小點(diǎn)漂浮于培養(yǎng)液表面，肉眼可見；有的散 在生長，鏡下可見呈絲狀、管狀、樹枝狀，縱橫交錯(cuò)穿行于細(xì)胞之間。 念珠菌和酵母菌卵圓形，散在細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間生長。 真菌生長迅速，

46、能在短時(shí)間內(nèi)抑制細(xì)胞生長、產(chǎn)生有毒物質(zhì)殺死細(xì)胞。 抗真菌制劑對(duì)預(yù)防和排除真菌污染有效。六、培養(yǎng)物的污染及防止 締番爺姜亮錫協(xié)諄搪臃穴烘燕浪賂瞇嘯閻慣縮三稽徒頹篇艷弧漸刻懷汪沙動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第59頁，共70頁。污染對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的影響及污染的檢測(cè) 支原體污染對(duì)細(xì)胞影響及污染物的檢測(cè) 支原體是一種介于細(xì)菌和病毒之間、能獨(dú)立生活的最小微生物，無細(xì)胞 壁，形態(tài)呈多形形，最小 0.2mm，可以通過過濾器。常在購買各種血清 中含有支原體。 支原體污染后，因?yàn)樗鼈儾粫?huì)使細(xì)胞死亡可以與細(xì)胞長期共存，培養(yǎng)基 一般不發(fā)生渾濁，細(xì)胞無明顯變化，外觀上給人以正常感覺，實(shí)則細(xì)胞 受到多方面潛在影響，如引起細(xì)胞變形

47、，影響DNA合成，抑制細(xì)胞生長 支原體是細(xì)胞培養(yǎng)中最常見的、干擾試驗(yàn)結(jié)果的一種污染。但由于不易 被察覺，有些污染的細(xì)胞仍在被應(yīng)用。對(duì)支原體的污染必須嚴(yán)加防范。 用卡那霉素預(yù)防支原體污染有效。六、培養(yǎng)物的污染及防止 夜風(fēng)忌菠庶蕊屑籽鍘勇款閨剃墮肯跺僵澄疊串表諄課邯駱哄凹膝澳幣夯殺動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第60頁，共70頁。污染對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的影響及污染的檢測(cè) 細(xì)胞交叉污染對(duì)細(xì)胞的影響及污染物的檢測(cè) 細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞間交叉污染并不罕見，多是由于在培養(yǎng)中操作時(shí)各種 細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行，混雜使用器皿和液體所致，這種污染能使細(xì)胞的生長特 性、形態(tài)特征等發(fā)生變化，有些變化較輕、不易察覺，有些可能由于污 染的細(xì)胞具有

48、生長優(yōu)勢(shì)最終壓過原來細(xì)胞而導(dǎo)致細(xì)胞的生長抑制，最終 死亡 常用觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)、分析生長特性和核型、檢測(cè)細(xì)胞的標(biāo)記物等方法 檢測(cè)交叉污染的細(xì)胞。六、培養(yǎng)物的污染及防止 絮娩沸勵(lì)棗鉀養(yǎng)藍(lán)濃駕股胎互絡(luò)腫予鵝孟仔渣嬌押壯俯朱裝住張端喇鞭摯動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第61頁，共70頁。污染的防治 開始操作前的預(yù)防 定期清洗或更換超凈臺(tái)的空氣濾網(wǎng)，定期檢查超凈臺(tái)的空氣凈化標(biāo)準(zhǔn) 檢查培養(yǎng)皿是否有消毒標(biāo)志，有條件的實(shí)驗(yàn)室可以使用一次性用品 檢查新配置的培養(yǎng)液，確認(rèn)無菌后方可使用 操作前提前半小時(shí)啟動(dòng)超凈臺(tái)的紫外燈消毒 操作者應(yīng)戴口罩，消毒雙手六、培養(yǎng)物的污染及防止 延坤流哈獨(dú)減撬波衙習(xí)卿習(xí)藥加寸鍺鞠潦媳喪啤拜衰箱苛監(jiān)異同喂仿茹尤動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第62頁，共70頁。污染的防治 防止污染，預(yù)防是關(guān)鍵，預(yù)防措施應(yīng)該貫穿整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)的始終。 器皿準(zhǔn)備中的預(yù)防 用于細(xì)胞培養(yǎng)的器皿應(yīng)該嚴(yán)格消毒，做到真正潔凈 應(yīng)該無菌的物品，要做到消毒嚴(yán)格、真正無菌 器皿的運(yùn)輸、貯存過程中，要嚴(yán)格操作，謹(jǐn)防污染六、培養(yǎng)物的污染及防止 壘弄壁晦替茸坍廟毀甸涼險(xiǎn)謂擻凹榴醋攻免碎策汁礬磊廈猖偏篆瑤藉澡繕動(dòng)物細(xì)胞制藥動(dòng)物細(xì)胞制藥第63頁，共70頁。污染的防治 操