1、細菌藥物敏感試驗第一節 臨床常用抗菌藥物抗菌藥物 是指具有殺菌或抑菌活性的抗生素和化學合成藥物。 前者是真菌、放線菌、細菌等的代謝產物，后者是經化學改造的半合成抗生素和化學合成藥物。一、青霉素類抗生素：包括青霉素G、耐青霉素酶青霉素、 廣譜青霉素(氨芐青霉素、美洛西林、哌拉西林 )等。二、頭孢菌素類抗生素：第一代(頭孢唑林、頭孢氨芐、頭 孢拉定 )、第二代(頭孢孟多、頭孢西汀，頭孢呋新，頭孢克 羅等 )、第三代 (頭孢哌酮（先鋒必）、頭孢三嗪（菌必治）、 頭孢噻肟鈉、頭孢他啶、頭孢唑肟等) 。第四代如頭孢地嗪、 頭孢噻唑肟、頭孢吡肟等。適用于多重耐 藥G-桿菌嚴重 感染，對厭氧菌也有很好的抗菌

2、作用 三、其他內酰胺類抗生素 （一）單環內酰胺類抗生素: 主要有氨曲 南和卡蘆莫南。 抗菌藥物的分類（二）頭霉素類和氧頭孢烯類抗生素: 主要 有頭孢西丁、頭孢替坦、頭孢美唑。（三）碳青霉烯類抗生素: 主要有亞胺培南、 米洛培南、必安培南、帕尼培南。（四）內酰胺類抑制劑: 主要有克拉維酸 舒巴坦和他唑巴坦。所有內酰胺類抗生素都能抑制細胞壁粘肽合成酶，即青霉素結合蛋白（penicillin binding proteins ，PBPs），從而阻礙細胞壁粘肽合成，使細菌胞壁缺損四、氨基糖苷類抗生素 可干擾細菌蛋白質合成,主用于對革蘭氏陰性菌、綠膿桿菌等感染 的治療 按其來源分為： 由鏈霉菌屬發酵濾液

3、提取獲得，有鏈霉素、卡那 霉素、妥布霉素、核糖霉素、巴龍霉素、新霉 素； 由小單胞菌屬發酵濾液中提取，有慶大霉素、福 提霉素； 半合成氨基糖苷類，有阿米卡星、奈替米星、地 貝卡星等。 五、喹諾酮類抗生素 是一種DNA旋轉酶抑制劑，它作用于細菌DNA旋轉酶，干擾DNA超螺旋結構的解旋，從而阻礙DNA的復制。 第一代 為窄譜抗生素，有新惡酸、奈啶酸和惡 喹酸。第二代 為廣譜類抗生素，抗菌強度依次為環丙 沙星、氧氟沙星、洛美沙星、氟咯沙星、 培氟沙星、諾氟沙星。第三代 為超廣譜類抗生素，有司帕沙星、妥舒 沙星、左氟沙星等。 六、大環內酯類抗生素: 作用于核糖體50S亞基，抑制肽酰基轉移酶，阻止轉肽作

4、用和mRNA位移，抑制細菌蛋白質的合成。 常用的有：紅霉素、柱晶白霉素、麥迪霉素、乙酰螺旋霉素。 七、四環素、氯霉素和林可酰胺類抗生素 （一）四環素為廣譜抗生素，能特異性地與細菌核糖體30S亞基的A位置結合?？咕钚缘捻樞?為米諾環素多西環素美他環素地美環素。（二）氯霉素類抗生素，包括氯霉素、 甲砜霉素。（三）林可酰胺類抗生素，主要有鹽酸 林可霉素、克林霉素。八、糖肽類抗生素 常用的有萬古霉素 和替卡拉寧 九、磺胺類藥物及增效劑分三類： 用于全身感染的藥物，分為短效、 中效、長效三類，有磺胺甲惡唑， 磺胺嘧啶、磺胺甲氧吡嗪； 腸道起作用的藥物有柳氮磺胺啶銀、 磺胺二甲氧嘧啶； 局部應用的藥物有

5、磺胺米隆、磺胺 醋酰鈉。十、其他合成抗菌藥 用于腸道、尿路感染和 外用消毒 ，有呋喃坦啶和呋喃唑酮。 2.硝基咪唑類 對厭氧菌有抗菌作用，對 需氧菌無效，有甲硝唑和替硝唑。 第二節 抗菌藥物敏感性試驗 （AST）一、意義可預測抗菌治療的效果， “敏感”治療可能有效； “耐藥” 肯定失??；指導醫生選擇使用抗生素，AST的結果為“耐藥”，即應更換藥物；提供所選擇藥物的依據；監測耐藥性，分析耐藥菌變遷，掌握耐藥菌感染 病流行病學，控制和預防耐藥菌感染發生和流行。二、試驗常規抗菌藥物選擇 在臨床上將試驗藥物分成A、B、C、U四組, A組 所列的抗生素為常規首選藥敏試驗藥物,B組 為臨床使用主要抗生素,

6、尤其在醫院感染時使用的抗生素，可在下列情況下使用：對A組同類抗生素耐藥；標本來源不同時，如三代頭孢菌素使用于腦脊液中的腸桿菌，磺胺甲惡唑使用于尿道分離的細菌；多種微生物感染；多部位感染；感染流行的控制；對A組抗生素過敏、耐受或無反應。C組 藥物用于對A組藥物耐藥的流行菌株或 對A組藥物過敏的病人和某些不常見的 細菌（如腸外分離的沙門菌屬或耐萬 古霉素腸球菌）。U組 僅用于尿道中分離的細菌，不作為尿 道外分離菌的常規藥敏試驗。 建議非苛氧菌常規藥敏試驗和報告應考慮的抗菌藥物分組細菌A組B組C組U組腸桿菌科氨芐西林頭孢唑啉頭孢噻吩慶大霉素阿莫西林/克拉維酸或氨芐西林頭孢孟多或頭孢呋辛頭孢吡污頭孢美

7、唑頭孢哌酮頭孢西丁頭孢噻污環丙沙星或左氟沙星亞胺培南甲氧芐定氨曲南頭孢他啶(可指示產ESBLs)氯霉素卡那霉素奈替米星四環素妥布霉素羧芐西林洛美沙星或氧氟沙星加替沙星氯碳頭孢磺胺異惡唑甲氧芐啶呋喃妥因 建議非苛氧菌常規藥敏試驗 和報告應考慮的抗菌藥物分組細菌A組B組C組U組 葡 萄 球 菌 屬 細 菌苯唑西林青霉素阿奇霉素或克拉霉素或紅霉素克林霉素萬古霉素泰利霉素利奈唑胺環丙沙星或左氟沙星或氧氟沙星氯霉素慶大霉素利福平四環素羅美沙星或諾氟沙星磺胺異惡唑甲氧芐啶呋喃妥因(一）非苛養菌藥敏試驗抗生素的選用 A組一級試驗并常規報告的抗微生物藥 , 如葡萄球菌屬用苯唑西林和青霉素。B組一級試驗有選擇報

8、告的抗微生物藥 , 如腸球菌屬用萬古霉素 。C組補充試驗有選擇報告的抗微生物藥， 如葡萄球菌屬用氯霉素 。U組僅用于泌尿道的補充實驗的抗微生物藥，如葡萄球菌屬用洛美沙星和諾氟沙星。(二）苛養菌藥敏試驗抗生素的選用A組一級試驗并常規報告的抗微生物藥, 如肺炎鏈球菌用紅霉素和青霉素。B組一級試驗有選擇報告的抗微生物藥, 如肺炎鏈球菌用頭孢噻肟或頭孢曲 松。C組補充試驗有選擇報告的抗微生物藥， 如肺炎鏈球菌用頭孢呋辛。 稀釋法和紙片擴散法 稀釋法是在體外定量檢測抗菌藥物抑制待測菌生長活性的方法,抗菌藥物在液體或固體培養基中稀釋. （一）液體稀釋法 原理: 以MH（水解 蛋白）液體培養基將抗菌藥物做不

9、同濃度的稀釋，然后接種待測菌，定量測定抗菌藥物抑制或殺死該菌的最低（或最?。┮志鷿舛龋╩inimal inhibitory concentration,MIC）。 三、藥敏試驗方法材料： 抗菌藥物(配制見表) 培養基：一般采用MH液體培養基。 接種菌液的準備：8 cfu/ml ）標準，再用MH液體培養基進行1：200的稀釋后，在15 min內用完。 無菌小試管：10-15支 無菌吸管： 35培養箱操作步驟：取10支小試管，除第一支外，其余每管加于MH培養基1ml.吸取抗菌藥物原液（ 1000 g/ml）5.12ml,加入液體培養基，混合，吸出2ml加入第一和第二管中，每管加1ml，第二管混合后

10、取出1ml加入第三管，依次類推直至9管，吸取1ml去掉，各管抗菌藥物的實際含量依次分別為512、256、128、64、32、16、8、4、2、1 g/ml ；另設培養液對照、待測菌生長對照、和質控菌生長對照。3. 將一定濃度的待測菌懸液依次加入上述各管中，每管，混勻。放入35培養箱12-18小時后觀察結果。4. 結果判斷：凡無肉眼可見細菌生長的藥物最低濃度即為該待測菌的最低抑菌濃度（MIC）; 再以容量接種環無菌管中取出一環種于血平板作次代培養，經35培養過夜后，觀察最低藥物濃度能殺死99.9%原始種于的細菌者，即為該菌的最低殺菌濃度（MBC）。影響因素 1.培養基 pH、滲透壓、電解質對結果

11、均有影響。在MH培養基上不生長的細菌除外，一般都用該培養基。 2.抗菌藥物 必須采用標準粉劑。 3.結果觀察時間，應在12-18小時之間觀察。質量控制： 每次試驗時應根據待測菌的不同而分別選用：金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸艾希菌ATCC25922、糞腸球菌ATCC29212和銅綠假單胞菌ATCC27853等標準菌株在同一實驗條件下作平行試驗。其結果（MIC）超過或低于預期值范圍一個稀釋度以上，不應向臨床發出報告。 （二）瓊脂稀釋法 原 理 瓊脂選擇法是將藥物混勻于瓊脂培養基中，配制含不同濃度藥物平板，使用多頭接種器接種細菌，經孵育后觀察細菌生長情況，以抑制細菌生長的瓊脂平板所含藥物濃

12、度測得 MIC。 結果判斷 將平板置于暗色、無反光表面上判斷試驗終點，以抑制細菌生長的藥物稀釋度為終點濃度（磺胺可見少許散在細菌生長）。 結果報告 可用 MIC（g/ml）或用敏感S）、（中介（I）和耐藥（R）報告。紙片瓊脂擴散法 （一）試驗原理 將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測試菌的瓊脂平板上，紙片中所含的藥物吸收瓊脂中水分溶解后不斷向紙片周圍擴散形成遞減的梯度濃度，在紙片周圍抑菌濃度范圍內細菌的生長被抑制，從而形成無菌生長的透明圈即為抑菌圈。 抑菌圈的大小反映測試菌對測定藥物的敏感程度，并與該藥對測試菌的MIC呈負相關。 (二)材料1抗菌藥物紙片 選擇直徑為635mm， 吸水量為20l

13、的專用藥敏紙片用逐 片加樣或浸泡方法使每片含藥量達規 定所示。含藥紙片密封貯存28 且不超過1周。2培養基 水解酪蛋白（MH）培養基是 兼性厭氧菌和需氧菌藥敏試驗標準培 養基，4保存。（三）方法： 1.用05麥氏比濁標準的菌液濃度，在瓊 脂表面均勻涂片,在15min內接種完畢。 2.將含藥紙片緊貼于瓊脂表面, 35孵育18h后閱讀結果。（四）結果判斷和報告 用精確度為1mm的游標卡尺量取抑菌圈直徑。根據NCCLS標準， 作出“敏感”,“耐藥”和“中介”的判斷。紙片法藥敏試驗抑菌圈直徑與結果解釋的標準抗菌藥物與細菌 紙片含量 抑菌圈直徑：mm 相應MIC g/ml 耐藥 中介度 敏感 耐藥 敏感

14、丁胺卡那霉素 30g 14 15-16 17 32 16 氨芐青霉素 測腸桿菌 10g 11 12-13 14 32 8 測葡萄球菌 10g 28 29 測嗜血桿菌 10g 19 20 4 0.25 測腸球菌 10g 16 16 2 E 試 驗 （一）原理 E試條是一條 5mm50mm的無孔試劑載體，一面固定有預先制備的，濃度呈連續指數增長稀釋抗生素，另一面有讀數和判別的刻度。將E試條放在細菌接種過的瓊脂平板上，經孵育過夜，圍繞試條明顯可見橢圓形抑菌圈，圈的邊緣與試條交點的刻度濃度即為抗生素抑制細菌的特定濃度,又稱抑制濃度（IC），它與MIC呈高度相關。 （二）細菌接種和加樣 使用厚度為4mm

15、MH瓊脂平板，用0.5麥氏濃度的對數期菌液涂布，待瓊脂平板完全干燥，用E試驗加樣器將試條放在已接種細菌的平板表面，試條全長應與瓊脂平板緊 密接觸，試條MIC刻度面朝上濃度最大處靠平板邊緣。 （三）結果判斷和報告 讀取橢圓環與E試驗試條的交界點IC值。 與NCCLS的稀釋法MIC參考值高度相關。四、藥物敏感試驗結果解釋 “敏感”即表示測試菌可被測定藥物常規劑量 給藥后在體內達到的血藥濃度所抑制“耐藥”即表示測試菌不能被在體內感染部位 可能達到的抗菌藥物濃度所抑制，臨 床治療無效?！爸薪椤闭咛崾驹摷毦鷮ΤＲ幱盟庴w液或組織 中的藥物濃度的反應率低于敏感株， 使用高于正常給藥量有療效。 五、自動化儀器

16、檢測 ViterATB系統和Microscan是半自動或全自動細菌鑒定和藥敏系統，通過系統中藥敏專家系統可報告分離菌的藥敏結果。 第三節 細菌耐藥性和產生機制一、細菌的耐藥性 對某種抗菌藥物敏感細菌變成對該藥物耐受稱細菌耐藥性。 它可分為天然耐藥和獲得性耐藥，前者是通過染色體DNA突變而致，后者往往是由質粒、噬菌體及其他遺傳物質攜帶外來DNA片段導致產生的耐藥性。 突變可由細菌自發產生或在X線等物理因素或化學物質誘導產生，一般只對一種或兩種相似藥物耐藥，在細菌耐藥性上不占主要地位。 獲得性耐藥可通過接合、轉化。轉導、轉換形式產生耐藥 。二、細菌耐藥性的生物化學機制 1. 產生內酰胺酶，水解藥物

17、內酰 胺環而失去抗菌活性。2. 產生鈍化酶使抗生素失活，鈍化酶有三類： 氨基糖苷類鈍化酶 ； 氯霉素乙酸轉移酶； 紅霉素酶和其他滅活酶。3.青霉素結合蛋白改變，導致對抗生素的 親和力下降 。4.藥物作用靶位的改變使抗生素不易結 合產生耐藥性。5.抗菌藥物滲透障礙，如外膜蛋白減少 和藥物外排作用等。6.代謝途徑的改變 。 第四節 細菌耐藥性檢測 一、特殊菌耐藥性表型檢測（一）耐藥篩選試驗：瓊脂篩選試驗 以單一藥物單一濃度檢測某種細菌的耐藥性。 在含一定濃度測試藥物的特殊培養上，點種0.5麥氏比濁度直接菌落配制細菌懸液，35孵育24h后觀察平板上是否有菌落生長識要有1個菌落生長，均視為耐藥。 臨床

18、上常用于對耐甲氧西林葡萄球菌、耐 萬古霉素腸球菌，對慶大霉素或鏈霉素高水平 耐藥的腸球菌的檢測。（二）折點敏感試驗僅用特定抗生素濃度（敏感、中介或耐藥折點MIC）而不使用測定MIC時所用系列對倍抗生素濃度測試細菌對藥物的敏感性稱折點敏感試驗。當選擇區分中介和耐藥折點值藥物濃度時，若兩種抗藥物濃度培養基均生長可判斷為耐藥；如在兩種藥物濃度均不生長則為敏感；僅在較低藥物濃度培養基中生長提示為中介。（三）雙相紙片試驗度菌液。均勻涂布于MH平板。中央貼上阿莫西林/克拉維酸紙片，在距該紙片25mm處分別貼頭孢噻肟或頭孢曲松、頭孢他啶和氨曲南等藥敏紙片作為指示劑，35孵育18h觀察結果。 若指示劑在朝向阿

19、莫西林/克拉維酸方向有抑菌圈擴大的現象（協同現象），則說明待檢菌產生超廣譜內酰胺酶。（四）自動化儀器 自動化儀器Microscan有測定抗菌藥物抑菌的MIC值功能。 原理是先測定細菌對抗生素的MIC值，當頭孢他啶與頭孢他啶十克拉維酸的MIC比值或頭孢噻肟與頭孢噻肟十克拉維酸的MIC比值大于或等于8（即3個對倍稀釋度）即判定為此細菌產生ESBL。二、 內酰胺酶檢測 1.頭孢哨噻吩濾紙片法 用接種環挑取受試菌于商品化頭孢哨噻 吩濾紙片上，于10分鐘內由黃色轉變為 紅色即陽性結果，示產色頭孢菌素的 內酰胺環被酶打開。 2 .碘淀粉測定法 用接種環挑取受試菌混于青霉素溶液中， 室溫下振搖30分鐘。加入

20、淀粉液后，再加 入碘液，溶液變藍，繼續振搖。若檢測菌 產生酶，則可水解青霉素內酰胺環變 為青霉素噻唑酸，后者與碘結合，使碘淀 粉復合物轉變為無色，10分鐘之內藍色消 失者為產酶株。四、特殊耐藥菌檢測 （一）耐甲氧西林葡萄球菌檢測1定義 對1g苯唑西林紙片的抑菌圈直徑 10mm，或其MIC4gml的金黃色葡萄球菌； 對1g苯唑西林抑菌圈直徑17mm，或MIC 05gml的凝固酶陰性葡萄球菌； 都稱耐甲西林葡萄球菌（MRS）。2臨床意義 MRS不論其體外藥敏試驗結果，所有的內酰胺類藥物和內酰胺內酰胺酶抑制劑均無臨床療效； 絕大多數的MRS常示多重耐藥，包括氨基糖苷類、大環內酯類、四環素類。 （二）

21、耐青霉素肺炎鏈球菌檢測1.定義 當對1 gml苯唑西林紙片抑菌 圈20mm或MIC006 gml互應視 為耐青霉素肺炎鏈球菌（PRSP）。2.臨床意義PRSP對氨芐西林、氨芐西林 舒巴坦、頭孢克肟、頭孢唑肟，臨床治 療的療效很低。但應檢測對頭孢曲松、 頭孢噻肟和美咯培南的MIC以判斷是否對 這些抗生素敏感。 （三）耐萬古霉素腸球菌檢測1定義 對 30g萬古霉素紙片抑菌圈直 徑 14mm或其 MIC32gml應視 為耐萬古霉素腸球菌（VRE）。2臨床意義 對青霉素敏感的VRE可用青霉 素和慶大霉素聯合治療，若對青霉素耐 藥而不是高水平耐氨基糖苷類可用壁霉 素慶大霉素。 （四）超廣譜內酰胺酶腸桿菌

22、科細菌檢測 1定義 超廣譜-內酰胺酶就是能水解青霉素、頭孢菌素及單胺類的酶，主要由克雷伯菌和大腸埃希菌、腸桿菌等細菌產生。 初篩試驗 使用1種以上藥物，其抑菌環直徑滿足以下條件： 對 頭孢泊肟、頭孢他啶（10ug片）抑菌圈 22mm 或 氨曲南、頭孢噻肟（30 ug片） 27mm 為初篩試驗陽性即為產ESBL菌株。 確證試驗 經頭孢他啶（30ug片）、頭孢他啶克拉維酸（3010ug）； 頭孢噻肟30ug、頭孢噻肟克拉維酸（3010ug） 兩組中任何一組藥物加克拉維酸與不加克拉維酸相比，其抑菌環增大5mm者，判斷為產ESBL菌株。 同K-B法單紙片擴散法（初篩試驗）將0.5麥氏單位的待檢菌液涂抹

23、于MH瓊脂平板上，稍干后，在瓊脂培養基上貼頭孢他啶(Ceftazidime,CAZ)、頭孢噻肟(Cefotaxime,CTX)、頭孢曲松(Ceftriaxone,CRO)、氨曲南(Aztreonam,ATM)、頭孢泊肟(Cefprozil,CPD)紙片，置35過夜培養，若抑菌環直徑CAZ22mm、CTX27mm、CRO25mm、ATM27mm、CPD22mm時可疑為產ESBLs菌株。 雙紙片增效法（確認試驗）將0.5麥氏單位的待檢菌液涂抹于MH瓊脂平板上，稍干后，在瓊脂培養基上分別貼頭孢他啶/克拉維酸、頭孢噻肟/克拉維酸、頭孢曲松/克拉維酸、氨曲南/克拉維酸、頭孢泊肟/克拉維酸紙片，置35過夜

24、培養后量取抑菌環直徑，與單紙片平皿對照，若加克拉維酸紙片較未加克拉維酸紙片抑菌環直徑5mm，即為ESBL陽性。 3臨床意義 產ESBL克雷伯菌和大腸埃希 菌不論其體外藥物敏感試驗結果如何， 對青霉素、頭孢菌素和氨曲南治療無 效。 第五節 抗分枝桿菌藥物敏感性試驗 一、抗分枝桿菌藥物 第一線藥物為異煙肼、利福平、吡酸胺、 乙胺丁醇和鏈霉素； 第二線藥物包括對氨基水楊酸、乙硫異 煙胺、環絲氨酸、卷曲霉素、卡那 霉素、丁胺卡那霉素和利福布丁。 二、結核分枝桿菌和緩慢生長分枝桿菌體外抑菌試驗 （一）結核分枝桿菌體外藥敏試驗指征 首次分離的分枝桿菌需做藥敏試驗，有助于合理用藥和監測藥物敏感性。 另外經過

25、三個月正規治療，標本分離培養仍為陽性患者，或感染的嚴重疾患（如播散性結核病和結核性腦膜炎）以及來自高耐藥流行區的患者，均須做體外藥敏試驗。1培養基 Middlebrook7H10瓊脂添加油 酸、白蛋白、葡聚精觸酶是慢生菌比例 法的推薦培養基；2藥敏試驗藥物 抗菌藥物直接來自廠商， 不能用治療的抗結核藥物作為試驗用 藥。藥物原液濃度至少為1000g/ml， 20貯存期6個月。3細菌接種直接比例法藥敏試驗采用涂片陽性患者標本；接種物是充分消化、無雜菌污染的標本,接種菌液的稀釋方法如下：抗酸染色（1000 ）未見細菌，熒光染色（450）25，菌液不稀釋?？顾崛旧?000）l10，熒光染色（450）25250，菌液稀釋或 101，102。觀察含藥瓊脂格細菌生長情況用以4 表示：（：50100個菌落；2：100200個菌落；3：200500個菌落；4 ：500個以上菌落）。若測試菌生長數大于對照格菌落數1，即判讀為耐藥菌。 6質量控制結核分枝桿菌 H37RV ATCC 27294為一線、二線藥的敏感質控菌株；H37RV ATCC35820為鏈霉素耐藥質控菌株；H37RV ATCC35822為異煙耐藥質控菌株；H37RV ATCC35826為環絲氨酸耐藥質控菌株；H37RV ATCC35827為卡那霉素耐藥質控菌株；三、快速生長分枝桿菌體外藥敏試驗