1、L1 1. Nucleic acid is the genetic material (to explain via four examples)(1)DNA是細(xì)菌的遺傳物質(zhì)：細(xì)菌轉(zhuǎn)化(zhunhu)實(shí)驗(yàn)為DNA是遺傳物質(zhì)提供了首要證據(jù)。從第一個菌株抽提DNA，然后加入到第二個菌株中，能使遺傳特性從一個細(xì)菌菌株傳遞到另一個菌株。肺炎球菌屬能引起肺炎導(dǎo)致老鼠死亡，其莢膜多糖有S型和R型兩種，S型肺炎球菌能與活的S型菌一樣，能同時殺死老鼠，這說明其中存在一種轉(zhuǎn)化物質(zhì)，這種轉(zhuǎn)化物質(zhì)純化(chn hu)后發(fā)現(xiàn)是DNA，所以DNA是細(xì)菌的遺傳物質(zhì)。(2) DNA是病毒(bngd)的遺傳物質(zhì)：噬菌體感染大

2、腸桿菌的實(shí)驗(yàn)證明DNA是病毒的遺傳物質(zhì)。當(dāng)細(xì)菌的DNA和蛋白質(zhì)組分被標(biāo)記上不同的放射性同位素32P及35S時，實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)僅有DNA被傳遞到感染細(xì)菌所產(chǎn)生的子代噬菌體中，這就很好的證明了DNA是病毒的遺傳物質(zhì)。(3) DNA也是動物細(xì)胞的遺傳物質(zhì)：當(dāng)DNA加入到某種在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的真核單細(xì)胞生物群落中，核酸就會進(jìn)入到細(xì)胞中去，其中有一部分就會合成出一些新的蛋白質(zhì)。例如胸腺嘧啶核苷激酶（TK）的合成實(shí)驗(yàn)，DNA被導(dǎo)入受體細(xì)胞中后，便成為受體細(xì)胞的一部分，與其他部分按相同的方式遺傳，導(dǎo)入DNA的表達(dá)將使細(xì)胞產(chǎn)生一些新的特性，初期這些實(shí)驗(yàn)僅僅在那些培養(yǎng)基中培養(yǎng)的單細(xì)胞中獲得了成功。現(xiàn)在人們已經(jīng)成功的通

3、過顯微注射技術(shù)將DNA導(dǎo)入老鼠的受精卵并使之成為其遺傳物質(zhì)的一個穩(wěn)定的組成部分。這些實(shí)驗(yàn)直接說明DNA不僅是真核生物的遺傳物質(zhì)，而且能夠在不同物種間相互轉(zhuǎn)移并保持功能活性。(4)有一些病毒如煙草花葉病毒（TMV）等就使用另一種核酸核糖核酸（RNA）作為遺傳物質(zhì)，其化學(xué)組成結(jié)構(gòu)與DNA只是略有不同。煙草TMV重建實(shí)驗(yàn)很好的說明了RNA在生命體中起著相同的作用。由此可見，遺傳物質(zhì)的本質(zhì)就是核酸。實(shí)際上，除了一些RNA病毒外，其余生物的遺傳物質(zhì)都是DNA。2.(1)3即一個核苷酸中五碳糖第3個C原子所連接的羥基端，它可與另一分子核苷酸的5-磷酸基形成3,5-磷酸二酯鍵。 (2)5即一個核苷酸中五碳糖

4、第5個C原子所連接的磷酸端，它可與另一分子核苷酸的5-磷酸基形成3,5-磷酸二酯鍵。3.(1)A：腺嘌呤（Adenine） (2)C：胞嘧啶（Cytosine）(3)T：胸腺嘧啶(m dn)（Thymine）(4)G：鳥嘌呤（Guanine），4. Melting temperature：DNA的熔解溫度。是指通過加熱由雙鏈變?yōu)閱捂溸@一系列溫度的位于(wiy)中部的那一點(diǎn)(y din)。 5. Spontaneous mutations：自發(fā)突變。凡自然界中發(fā)生的突變，不管其產(chǎn)生原因是由于DNA復(fù)制發(fā)生錯誤還是環(huán)境的損傷，都統(tǒng)稱為自發(fā)突變。6.Transition：轉(zhuǎn)換。即指一種嘧啶被另一種嘧

5、啶代替，一種嘌呤被另一種嘌呤代替，G-C對被A-T對替換，或者相反。Transversion：顛換。即嘌呤被嘧啶代替或者相反，因此A-T對變成了T-A或C-G。7.Hotspot：突變熱點(diǎn)。是突變發(fā)生頻率高的位點(diǎn)或重組頻率高的位點(diǎn) 。8.Modified bases：修飾堿基。是除了那些在DNA(T、C、A、G)、RNA(U、C、A、G) 合成時的四種通用堿基之外的一些堿基，由核酸合成后修飾產(chǎn)生。9.Denaturation：變性。描述DNA從雙鏈轉(zhuǎn)變?yōu)閱捂湹臓顟B(tài)，鏈分開的過程經(jīng)常伴隨著加熱過程。10.Hybridization：雜交。RNA和DNA鏈互補(bǔ)配對形成RNA-DNA雜合鏈的過程。1

6、1.Renaturation(annealing)：復(fù)性。DNA雙螺旋分子變性后的互補(bǔ)單鏈再結(jié)合成雙鏈的過程。 12.如何理解結(jié)構(gòu)決定功能（舉2個以上的實(shí)例說明）L2(1) Viroid：類病毒。是一類沒有(mi yu)蛋白質(zhì)外殼包裹的、僅具有小分子量環(huán)狀單鏈RNA的植物(zhw)病毒。 (2) PSTV：（potato spindle tuber virus）土豆(tdu)紡錘體管狀病毒。由359個核苷酸組成的單鏈閉合環(huán)狀RNA，分子中包括26個由堿基配對組成的雙螺旋區(qū)和27個單鏈內(nèi)環(huán)，呈棒狀，沒有折疊的三級結(jié)構(gòu)。(3) Prion：朊病毒。是一種蛋白質(zhì)樣感染因子，不含核酸但表現(xiàn)出可遺傳的特

7、性。例如PrPSC，羊騷癢病和牛海綿體腦病。PrPC朊病毒相關(guān)蛋白（prion related protein）。正常腦組織中產(chǎn)物，并可被蛋白酶完全水解，是28kD的疏水性球狀蛋白。PrPSC被感染腦組織中的產(chǎn)物，不能被蛋白酶水解。(4)Scrapie (羊瘙癢病)：羊瘙癢病是由蛋白質(zhì)組成的感染劑。(5) allele：等位基因。是指位于染色體同一位置分別控制兩種不同性狀的基因。如基因型Aa，A和a就互為等位基因。(6) How to assign mutations to genes via the cis/trans test (give an example)? 通過順反試驗(yàn)如何將突變分

8、配給基因(jyn)？（舉一例）互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)可以用來決定兩個突變(tbin)是否存在于相同基因或不同基因中，該實(shí)驗(yàn)包括構(gòu)建包含兩種突變的雜合子。互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)對照組中，如果兩個突變位于同一條基因中，可看到在反式和順式配置中，存在著不同的表型。反式配置是突變型的，因?yàn)槊恳粭l等位基因都有（不同的）突變；但順式配置是野生型的，因?yàn)橐粭l等位基因有兩個突變，而另一條等位基因就沒有突變。實(shí)驗(yàn)組中，如果兩個突變位于不同的基因中，我們總能看到野生型，因?yàn)槊織l基因總有一條野生型和一條突變型等位基因，且配置是不相關(guān)的。因而，不能互補(bǔ)意味著兩個突變是處于同一遺傳單位內(nèi)，不能互相補(bǔ)償?shù)耐蛔儽徽J(rèn)為組成了一部分相同的互補(bǔ)群。另一種用

9、來描述由互補(bǔ)試驗(yàn)定義的遺傳單位是順反子，它等同于基因。這也很好的解釋了基因的互補(bǔ)性。(7) Gain-of-function mutation：功能獲得型突變(tbin)。該突變蛋白質(zhì)獲得新的活性(或功能)，這種性質(zhì)是顯性的。Null mutation：無效突變。該突變使基因的活性完全消失，因?yàn)樵摶蛞驯粍h除。Loss-of-function mutation：功能喪失型突變。即該突變使某一基因失活，這種性質(zhì)是隱性的。Leaky mutants：遺漏突變。突變后基因仍存在部分功能，因?yàn)橥蛔兒蟮牡鞍踪|(zhì)存在部分活性(錯義突變)，或者因?yàn)楫a(chǎn)生了少量的野生型蛋白質(zhì)(無義突變)。(此突變不影響表型，功能

10、并不是必需的)。(8) Each allele has a different phenotype, why (illustrate by example)? 為什么每個等位基因都有一種不同的表型（請例證）基因座可有許多不同的突變等位基因，復(fù)等位基因的存在可允許雜合子發(fā)生任何形式的等位基因組合。如果每一種變化都產(chǎn)生一個隱性突變，并且它會阻止活性蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，那么一條基因內(nèi)就會有很多這樣的突變。多種可改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的氨基酸替換均能有效地減弱它的功能。同一條基因的變異體稱為復(fù)等位基因，它們的存在使突變體之間能夠形成雜合子，這些復(fù)等位基因之間的關(guān)系有各種形式。除了最簡單的情況外，通常一系列等位基因往

11、往具有不同的表型。例如，黑腹果蠅的w基因座上有一系列的等位基因所表現(xiàn)的從紅眼一直到白眼的多種眼色，其顏色從深到淺均有。在黑腹果蠅控制眼色的w基因座的雜合子中，紅色（野生型）相對于其他基因來說是顯性的，它們有很多不同的突變等位基因，盡管一些突變基因并未產(chǎn)生眼睛顏色，但是一些基因產(chǎn)生了顏色。因此，每一種突變等位基因代表了該基因的不同突變，這些突變不會完全破壞基因的功能，而會保留一定的活性，由此會產(chǎn)生特征性的表型。 (9) The specificity determines the blood group for human (illustrate by example) . 決定人類血型的特異性

12、（舉例(j l)闡述）基因座可能會有不止一條野生型等位基因，即基因座可能會有等位基因的多態(tài)分布，而無任何一條等位基因可以被認(rèn)為(rnwi)是野生型的。在任何一個遺傳位點(diǎn)上并非一定要有一個野生型基因。人類血型系統(tǒng)的比較就提供了一個例子，ABO血型基因座編碼半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，其特異性決定了血型的差別。功能缺失(qu sh)可由空白型表示，即O型。但是功能性的A型和B型是共顯性的，并且對O型表現(xiàn)出顯性。在所有的個體中都產(chǎn)生O型或者H型抗原，它們含有特殊的碳水化合物基團(tuán)連接到蛋白質(zhì)。ABO等位基因編碼一種半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，能夠在O抗原加上糖基，其特異性決定了血型。A、B等位基因表達(dá)相應(yīng)的轉(zhuǎn)移酶并利用相應(yīng)的

13、碳水化合物輔因子產(chǎn)生了A、B抗原，O等位基因無法表達(dá)產(chǎn)生轉(zhuǎn)移酶，因此O抗原沒有發(fā)生修飾。但A和B都不能被認(rèn)為是野生型的，因?yàn)樗麄儽磉_(dá)出一種功能，而沒有存在功能缺失或者新功能的產(chǎn)生。這種現(xiàn)象，即一個群體中存在多條功能型等位基因，被稱為多態(tài)性。L3 (1) DMD：杜興氏肌營養(yǎng)不良癥（Duchenne Muscular Dystrophy）。是一種肌肉退化失調(diào)疾病，X染色體連鎖疾病。(2) DHFR：二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase）。哺乳動物的DHFR基因較大，含有6個外顯子，相當(dāng)于2000個堿基的mRNA，但是由于內(nèi)含子較大，使得DNA的長度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于mRNA。哺乳

14、動物的該基因具有相似的構(gòu)成，即它有較短的外顯子和較長的內(nèi)含子，但相應(yīng)的內(nèi)含子之間的長度變化廣泛。 (3)Conservation of exons and its application：外顯子就是在DNA序列中被轉(zhuǎn)錄成mRNA片段的一段序列。外顯子序列通常處于編碼氨基酸序列的選擇壓力下，因而它們很少發(fā)生變化，且很多改變不影響密碼子意義，同時其不利突變可因不利選擇而被有效地去除，因而它在進(jìn)化中具有保守性。應(yīng)用：通過外顯子的保守性可以分離基因。通過確定那些在許多生物中都存在的序列片段可以鑒定編碼區(qū)域，而外顯子的保守性可以作為這種鑒定的基礎(chǔ)。許多生物中含有這樣功能保守的基因區(qū)域，這些代表蛋白質(zhì)的序

15、列應(yīng)當(dāng)具有兩個特性：它必須有一個開放閱讀框 (ORF)；在其他生物中很可能存在與它相關(guān)的序列。這些特征就可以用來分離基因。在鑒定一些具有醫(yī)學(xué)意義的基因時，一種可行方法已經(jīng)被證實(shí)：從一定區(qū)域中篩選相對短的片段，尋找具有上述兩個特性的保守基因。(4)translocation：易位。染色體片段(pin dun)位置的改變稱為易位（用t表示），它伴有基因(jyn)位置的改變。(5)Chromosome walking and its application：染色體步移。即從第一個重組克隆插入片段的一端分離出一個片段作為探針從文庫中篩選第二個重組克隆，該克隆插入片段含有與探針重疊的順序和染色體的其他順

16、序。從第二個重組克隆的插入片段再分離出末端小片段篩選第三個重組克隆，如此重復(fù)，得到一個相鄰的片段，等于在染色體上移了一步。該技術(shù)(jsh)通過逐一克隆來自染色體基因組DNA的彼此重疊的序列，從而慢慢靠近目的基因。應(yīng)用：染色體步移技術(shù)是一種重要的分子生物學(xué)研究技術(shù)，使用這種技術(shù)可以有效獲取與已知序列相鄰的未知序列，即側(cè)翼序列。染色體步移技術(shù)主要有以下幾方面的應(yīng)用：根據(jù)已知的基因或分子標(biāo)記連續(xù)步移，獲取人、動物和植物的重要調(diào)控基因，可以用于研究結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)調(diào)控。如分離克隆啟動子并對其功能進(jìn)行研究；步查獲取新物種中基因的非保守區(qū)域，從而獲得完整的基因序列；鑒定T-DNA或轉(zhuǎn)座子的插入位點(diǎn)，鑒定基因

17、槍轉(zhuǎn)基因法等轉(zhuǎn)基因技術(shù)所導(dǎo)致的外源基因的插入位點(diǎn)等；用于染色體測序工作中的空隙填補(bǔ)，獲得完整的基因組序列；用于人工染色體PAC、YAC和BAC的片段搭接。(6)exon trapping and its application：外顯子捕獲技術(shù)。即通過對基因組片段迅速掃描從而得知外顯子的存在的一種技術(shù)。應(yīng)用：外顯子捕捉技術(shù)用了一種特殊的載體，它要求這種載體帶有強(qiáng)啟動子且在兩個外顯子之間只有一個內(nèi)含子，當(dāng)這個載體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞后，可轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生大量的含有兩個外顯子序列的RNA。如果基因組片段中含有一個外顯子，那么它的序列可以在細(xì)胞質(zhì)RNA中被發(fā)現(xiàn)，但如果基因組片段中只由內(nèi)含子中的序列組成，那么剪接就不會發(fā)

18、生，且mRNA也不會運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中。(7) 5-UTR、3-UTR：5-UTR從mRNA起點(diǎn)的甲基化鳥嘌呤核苷酸帽延伸至AUG起始密碼子。3-UTR從編碼區(qū)末端的終止密碼子延伸至多聚A尾巴（Poly-A）的末端。globin：珠蛋白。具有攜帶氧能力的蛋白質(zhì) Rubisco：1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶。是一種酶(EC 9)，分子量約為53kD，由8個大亞基和8個小亞基組成，是光合作用中決定(judng)碳同化速率的關(guān)鍵酶。Whats the function of the Rubisco and why it can be used for animals?L4(1) shot-gun

19、approach：鳥槍法。在進(jìn)行基因(jyn)克隆的第一步，基因組DNA的片段化時，如果待克隆(k ln)的給體材料是雙鏈的基因組DNA，有好幾種方法都可以用來制備片段化的DNA群體。其中最簡單的一種辦法是利用限制酶消化給體基因組DNA。這種消化產(chǎn)物，不經(jīng)過凝膠電泳分部分離，就直接用來同載體分子作連接反應(yīng)的克隆方法，叫做鳥槍法(shot-gun approach)。(2)銜接物：是一種用人工方法合成的DNA短片段，具有一個或數(shù)個在其要連接的受體DNA上并不存在的限制酶識別位點(diǎn)。(3)末端轉(zhuǎn)移酶：（Terminaltransferase,TdT）是一種無需模板的DNA聚合酶，催化脫氧核苷酸結(jié)合到

20、DNA分子的3羥基端。(4) Saccharomyces cerevisiae：釀酒酵母，又稱面包酵母或者出芽酵母。釀酒酵母是與人類關(guān)系最廣泛的一種酵母，不僅因?yàn)閭鹘y(tǒng)上它用于制作面包和饅頭等食品及釀酒，釀酒酵母還是第一個完成基因組測序的真核生物，它在現(xiàn)代分子和細(xì)胞生物學(xué)中用作真核模式生物，其作用相當(dāng)于原核的模式生物大腸桿菌。釀酒酵母是發(fā)酵中最常用的生物種類，它的細(xì)胞為球形或者卵形，直徑510 m，繁殖的方法為出芽生殖。(5) C. elegans：秀麗隱桿線蟲，是一種可以獨(dú)立生存的線蟲，長度約1mm，生活在溫度恒定的環(huán)境中。C. elegans大部分是雌雄同體個體，其基因組很小且與原核生物相似

21、。它被做為一種模式生物被大量應(yīng)用于現(xiàn)代發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)、基因組學(xué)的研究中，尤其在研究細(xì)胞分化方面特別有貢獻(xiàn)，而且是第一個基因組完全被測序的多細(xì)胞生物。(6)非互補(bǔ)粘性(zhn xn)末端DNA分子間的連接(linji)方法。具有非互補(bǔ)粘性(zhn xn)末端的兩種DNA片段之間，經(jīng)過專門作用于單鏈DNA的Sl核酸酶處理變成平末端之后，可以使用T4 DNA連接酶進(jìn)行有效連接。可以使用附加銜接物的辦法來提高平末端間的連接作用的效率。銜接物是一種用人工方法合成的DNA短片段，具有一個或數(shù)個在其要連接的受體DNA上并不存在的限制酶識別位點(diǎn)。如果要連接的是具有非互補(bǔ)的粘性末端的載體分子和外源DNA片段

22、，可先用Sl核酸酶除去粘性末端，形成平末端的片段，便可按平末端連接法分別給它們加上相同的一段銜接物。如此帶有銜接物的載體分子和外源DNA片段，隨后再用只在銜接物中具有的唯一識別位點(diǎn)的限制酶切割，結(jié)果就會產(chǎn)生出能夠彼此互補(bǔ)的粘性末端。這樣就可以按照常規(guī)的辦法，用T4 DNA連接酶將它們連接起來。此外，應(yīng)用附加接頭或同聚物加尾技術(shù)也能夠有效地連接DNA分子。(7) How to prevent the formation of circular molecule for linear vector？如何阻止線性載體形成環(huán)化分子？阻止經(jīng)限制酶切割后的線性載體分子自身的再環(huán)化作用，可以提高DNA片段的

23、插入效率。目前阻止線性載體形成環(huán)化分子通用的方法有三種：第一，用堿性磷酸酶處理由限制酶消化產(chǎn)生的線性載體分子；第二，使用同聚物加尾連接技術(shù)；第三，應(yīng)用柯斯質(zhì)粒。 (8) gene amplification：基因擴(kuò)增。是指帶有外源DNA片段的重組體分子在體外構(gòu)成之后，導(dǎo)入適當(dāng)?shù)募闹骷?xì)胞進(jìn)行繁殖，從而獲得大量的單一的重組體DNA分子的過程。(9) transformation：轉(zhuǎn)化。在基因操作中，感受態(tài)的大腸桿菌細(xì)胞捕獲和表達(dá)質(zhì)粒載體DNA分子的生命過程。(10) How to clone the gene via complementation?如何通過互補(bǔ)作用克隆基因？（舉例）如果被克隆的D

24、NA片段，同重組體DNA分子的寄主細(xì)胞的染色體DNA是同源的，那么使用互補(bǔ)作用進(jìn)行基因克隆，是一種十分有效的方法。它的一種最簡單的方式是，將大腸桿菌DNA的克隆片段“庫”，即一組含有大腸桿菌基因組全部DNA序列結(jié)構(gòu)的重組體DNA分子的異源群體，導(dǎo)入一種大腸桿菌營養(yǎng)缺陷型菌株的受體細(xì)胞。然后將此受體細(xì)胞涂布在一種缺少該菌株所需要的底物的基本培養(yǎng)基上。因此，只有那些獲得了營養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)基因的受體細(xì)胞才會長成轉(zhuǎn)化子菌落，從而得到目的DNA片段克隆。例如a-互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，由a-互補(bǔ)產(chǎn)生的LacZ+細(xì)菌在誘導(dǎo)劑IPTG的作用下，在有生色底物X-Gal存在(cnzi)的培養(yǎng)基中產(chǎn)生藍(lán)色菌落，因而易于識別。然而

25、，當(dāng)外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后，導(dǎo)致無a-互補(bǔ)功能的氨基端片段，使得帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。這種重組子的篩選，又稱藍(lán)白篩選。(11) How to produce cDNA library?如何構(gòu)建(u jin)cDNA文庫？cDNA克隆的基本過程(guchng)是通過一系列的酶催作用，使總poly(A) mRNA制劑轉(zhuǎn)變成雙鏈cDNA群體，并插入到適當(dāng)?shù)妮d體分子上，然后再轉(zhuǎn)化給大腸桿菌寄主菌株的細(xì)胞內(nèi)，如此便構(gòu)成了包含著所有基因編碼序列的cDNA基因文庫。其具體步驟如下：分離細(xì)胞總RNA，然后從中純化出主要含mRNA的部分。一段僅由脫氧胸腺嘧啶核苷酸組成的寡聚核苷酸oligo

26、(dT)，能夠同惰性物質(zhì)如纖維素（或瓊脂糖）結(jié)合。當(dāng)細(xì)胞總 RNA制劑通過已用oligo(dT)處理過的纖維素柱時，mRNA分子的pol(A)尾巴便會同oligo(dT)序列雜交而粘附到柱子的填充物纖維素上，而其余的rRNA及tRNA分子則流出柱子。經(jīng)過處理，可從纖維素柱子中洗脫下了純凈的mRNA分子。合成第一鏈 cDNA。其中一種方法叫做oligo(dT)引導(dǎo)的cDNA合成法。另外一種叫做隨機(jī)引物引導(dǎo)的cDNA合成法（randomly primed cDNA synthesis）。此法的基本原理是，根據(jù)許多可能的序列，合成出610個核苷酸長的寡核昔酸短片段（混合物），作為合成第一鏈cDNA的

27、引物。在這種情況下，cDNA的合成可以從mRNA模板的許多位點(diǎn)同時發(fā)生。將mRNA-DNA雜交分子轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈cDNA分子。可采用自我引導(dǎo)合成法或置換合成。將合成的雙鏈cDNA重組到質(zhì)粒載體或噬菌體載體上，導(dǎo)入大腸桿菌寄主細(xì)胞增殖。重組的方式是先用末端轉(zhuǎn)移酶給雙鏈cDNA分子加尾，或者更常用的是將人工合成的銜接物加到雙鏈cDNA分子的兩端，爾后再同經(jīng)適當(dāng)處理而具有相應(yīng)末端的載體分子連接。將如此構(gòu)成的重組體分子導(dǎo)入大腸桿菌寄主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，于是便得到了所需的cDNA文庫。(12) How to clone gene for genome?如何克隆基因組DNA？基因組DNA克隆與cDNA克隆不同，它

28、的出發(fā)材料是基因組DNA。由于cDNA分子比較小，可以在質(zhì)粒載體上克隆。高等(godng)真核生物染色體基因組DNA的基因文庫，通常是用噬菌體或柯斯質(zhì)粒作載體(zit)構(gòu)建的。應(yīng)用(yngyng)噬菌體載體構(gòu)建基因組文庫。第一步是，從給體生物制備基因組DNA，并用限制酶消化法產(chǎn)生出適于克隆的DNA片段。然后，在體外將這些DNA片段同適當(dāng)?shù)氖删w連接成重組體分子，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌的受體細(xì)胞中去。最后，從轉(zhuǎn)化子克隆群體中挑選出含有目的基因的克隆。應(yīng)用柯斯質(zhì)粒載體構(gòu)建基因組文庫。為了使真核基因組DNA克隆到柯斯質(zhì)粒載體上，需用核酸內(nèi)切限制酶Sau3A局部消化基因組DNA。然后分離收集分子量為3545

29、kb的片段群體，并同線性化處理的柯斯質(zhì)粒載體DNA連接重組。經(jīng)體外包裝之后，感染給大腸桿菌寄主細(xì)胞。在細(xì)胞內(nèi)，柯斯質(zhì)粒載體按質(zhì)粒特性進(jìn)行復(fù)制擴(kuò)增，形成基因組文庫。L51.Plasmid：質(zhì)粒。是一類在細(xì)菌染色體外能自主復(fù)制的環(huán)形雙鏈DNA。Phage：噬菌體。它是一種感染大腸桿菌寄主細(xì)胞的溫和噬菌體，已成為主要的基因克隆載體，可以攜帶較長的外源DNA片段，其最大容量為18-22kb。線性噬菌體分子的兩端各有一條由12個核苷酸組成的彼此互補(bǔ)的單鏈延伸末端，由這段粘性末端結(jié)合形成的雙鏈區(qū)域叫cos位點(diǎn)。Cosmid：柯斯質(zhì)粒。一類人工建造的，含有噬菌體DNA的cos位點(diǎn)和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的質(zhì)粒

30、載體，其DNA可以在體外被包裝到噬菌體的外殼內(nèi)。所以柯斯質(zhì)粒兼具噬菌體與質(zhì)粒載體的特性，具有高容量的克隆能力，可用于克隆大片段的DNA分子，它克隆外源DNA的片段約為35-45kb。2.舉例闡述互補(bǔ)作用基因克隆。（參見L4）3.利用cDNA克隆某基因(舉例)。cDNA克隆的基本過程是通過一系列的酶催作用，使總poly(A) mRNA制劑轉(zhuǎn)變成雙鏈cDNA群體，并插入到適當(dāng)?shù)妮d體分子上，然后再轉(zhuǎn)化給大腸桿菌寄主菌株的細(xì)胞內(nèi)。如此便構(gòu)成了包含著所有基因編碼序列的cDNA基因文庫。例如，具有poly(A)的mRNA在oligo(dT)引物和反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，可合成出雙鏈cDNA。隨后將它與質(zhì)粒載體構(gòu)

31、成重組分子，并轉(zhuǎn)化給大腸桿菌寄主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增。應(yīng)用這種方法能夠分離和擴(kuò)增我們所期望研究的基因或DNA片段。4.GATC：即同尾酶酶切后產(chǎn)生(chnshng)的粘性(zhn xn)末端GACT序列。同尾酶是一組來源不同，識別序列各異，但能夠切割(qig)形成相同粘性末端GACT序列的限制性內(nèi)切酶。例如BamHI、BglI和Sau3A即是一組同尾酶。5.舉例說明基因定位克隆的使用。基因定位克隆（map-based cloning）是用于分離其編碼產(chǎn)物尚不知道的目的基因的一種有效的方法。舉例如下：具體的步驟是先將目的基因，亦即目的基因的突變定位到染色體上，并在目的基因的兩側(cè)確定一對緊密連鎖的RFLP

32、或RAPD分子標(biāo)記；接著利用最緊密連鎖的一對兩側(cè)分子標(biāo)記作探針，通過染色體步移技術(shù)將位于這兩個分子標(biāo)記之間的含目的基因的特定的基因組片段克隆并分離出來；最后是根據(jù)其同突變體發(fā)生遺傳互補(bǔ)的能力從此克隆中鑒定出目的基因。成功地應(yīng)用基因定位克隆技術(shù)分離目的基因的兩個必要條件是，以酵母人工染色體YAC（yeast artificial chromosome）為載體構(gòu)建含有大片段DNA的YAC庫；另一個必要條件是要有可用的同目的基因緊密連鎖的DNA探針。6. genome：基因組。即生物體所擁有的全部DNA序列，包括所有的基因及基因間的序列。因此，基因組應(yīng)該指單倍體細(xì)胞中包括編碼序列和非編碼序列在內(nèi)的全

33、部 HYPERLINK /view/758.htm t _parent DNA分子。（說的更確切些，核基因組是單倍體 HYPERLINK /view/32286.htm t _parent 細(xì)胞核內(nèi)的全部 DNA分子； HYPERLINK /view/19423.htm t _parent 線粒體基因組則是一個線粒體所包含的全部DNA分子； HYPERLINK /view/28826.htm t _parent 葉綠體基因組則是一個葉綠體所包含的全部DNA分子）。 7. genetic map（linkage map）：根據(jù)遺傳重組實(shí)驗(yàn)的重組頻率結(jié)果繪制的，用來表示同一條染色體上不同基因（或特

34、定DNA序列區(qū)）之間的排列順序及其相對距離的線性圖，叫做遺傳圖譜或連鎖圖譜。8. genetic polymorphism：遺傳多態(tài)性。即在一個基因座上有多條等位基因的現(xiàn)象。9.SNP：單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism），它是指來自不同生物有機(jī)體基因組DNA同一部位上的單個核苷酸的差異，是第三代分子遺傳標(biāo)記。10.蛋白組學(xué)研究中所用的方法及原理。 蛋白質(zhì)組學(xué)研究中以前最常用的方法是二維電泳（2DE），二維電泳的第一維過程中，利用等電聚焦原理，蛋白質(zhì)依其等電點(diǎn)的不同被分離開來，第二維的過程是用SDS將蛋白質(zhì)依分子量的不同加以分離，電泳結(jié)束后可將膠片以銀

35、染或考馬斯亮藍(lán)染色，讓蛋白質(zhì)顯現(xiàn)出來。目前(mqin)基于色譜分離(fnl)與質(zhì)譜的大規(guī)模蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)已成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的中心(zhngxn)。這種技術(shù)可以大規(guī)模地對蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，通過質(zhì)譜儀把蛋白質(zhì)或肽段的組成信息以一級圖譜與二級圖譜的形式表現(xiàn)出來，最后把這些圖譜與蛋白質(zhì)或肽段產(chǎn)生的理論圖譜相比較確定相似性（也即搜庫），并最終確定樣品中包含那些肽段，并通過肽段與蛋白質(zhì)的對應(yīng)關(guān)系，最終推斷樣品中包含的蛋白質(zhì)。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，定量蛋白質(zhì)組學(xué)（比較蛋白質(zhì)組學(xué)）也獲得了廣泛研究。它不僅檢測基因表達(dá)的全部蛋白質(zhì)，而且要檢測其表達(dá)蛋白質(zhì)的含量。定量蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究內(nèi)容可以說是蛋白質(zhì)定量技術(shù)

36、，而這種技術(shù)是生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)的重要途徑。例如Label-free蛋白質(zhì)組學(xué)非標(biāo)記定量技術(shù)，其原理是利用DeCyder MSTM軟件對液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)由譜峰形式轉(zhuǎn)化為直觀的類似雙向凝膠的圖譜，譜圖上每一個點(diǎn)代表一個肽段，而不是蛋白質(zhì)，再比較的不同樣本上相應(yīng)肽段的強(qiáng)度，從而對肽段對應(yīng)的蛋白質(zhì)進(jìn)行相對定量。 12.限制性位點(diǎn)能否體現(xiàn)孟德爾遺傳的特性。限制性位點(diǎn)能體現(xiàn)孟德爾遺傳的特性，限制位點(diǎn)多態(tài)性的遺傳規(guī)律符合孟德爾定律。兩個個體之間的限制圖譜的不同稱作限制性片段長度多態(tài)性(RFLP）。基本上，一個RFLP 就是一個SNP，只是這個SNP位于一個酶切位點(diǎn)中，它能夠與任何其他遺傳標(biāo)記一樣，也可同樣

37、用來作為遺傳標(biāo)記。只是它檢測的不是一些特征性表型，而是通過檢測限制圖譜來直接揭示基因型。已有實(shí)驗(yàn)很好的證明了限制性位點(diǎn)能體現(xiàn)孟德爾遺傳的特性，書上展示了一個祖孫三代的限制性多態(tài)家譜，那個圖譜表明了DNA 分子標(biāo)記片段的孟德爾分離規(guī)律，在所有可能的配對重組中，某個限制標(biāo)記的4條等位基因都能找到，并且它們都可以在每一代中獨(dú)立地分離。 13.RFLP可以作為一種遺傳標(biāo)記。RFLP，即DNA限制片段長度多態(tài)性，它是指應(yīng)用特定的核酸內(nèi)切限制酶切割有關(guān)的DNA分子，所產(chǎn)生出來的DNA片段在長度上的簡單變化。由于核酸內(nèi)切限制酶是以一種序列特異的方式切割DNA分子，來自一個完整的純合子個體（所有的基因及DNA

38、序列）的每一種同源的DNA分子，都會在同樣的位點(diǎn)被準(zhǔn)確地切割。從不同的生態(tài)型或不同的地理隔離群植株分離的總DNA中，同源DNA分子通常會表現(xiàn)出序列的趨異性，形成RFLP。這些RFLP是由于DNA序列上的特定變化（突變）引起的，因此它們也能夠像其他任何遺傳標(biāo)記一樣進(jìn)行定位，成為一種十分有用的分子標(biāo)記。基本上，一個RFLP 就是一個SNP，只是這個SNP位于一個酶切位點(diǎn)中，它能夠與任何其他遺傳標(biāo)記一樣，也可以同樣用來作為遺傳標(biāo)記。只是它檢測的不是一些特征性表型，而是通過檢測限制圖譜來直接揭示基因型。14.genetic markers：通過一定方法可以識別、并可遺傳(ychun)的指標(biāo)或性狀就叫遺

39、傳標(biāo)記。其特點(diǎn)是它可與被標(biāo)記基因同時遺傳。15.目前遺傳研究中所使用用的四類(s li)遺傳標(biāo)記。Morphological markers(形態(tài)學(xué)標(biāo)記(bioj) (Plant height，leave color and shape)； Cytological markers (細(xì)胞學(xué)標(biāo)記) (Nuclear type，triplet)；Biochemical markers (生化標(biāo)記) (Soluble protein，isozyme)；Molecular markers (分子標(biāo)記) (DNA，RNA，rRNA)。16.SSR:（Simple Sequence Repeat）簡單重復(fù)

40、順序，即微衛(wèi)星DNA標(biāo)記；RAPD:（Randomly Amplified Polymorphic DNA）即隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA；AFLP:（Amplified Fragment Length Polymorphism）即擴(kuò)增片段長度多態(tài)性；Satellite: 即衛(wèi)星DNA（重復(fù)單位為幾百-幾千堿基對）；MS: Microsatellite: 即微衛(wèi)星DNA (重復(fù)單位為2-5堿基對）；Satellite DNA：衛(wèi)星DNA。是位于真核細(xì)胞染色體中，由許多相同或相關(guān)的短小重復(fù)序列高度串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列區(qū)。它主要存在于染色體的著絲粒部位，通常不被轉(zhuǎn)錄。因其堿基組成中GC含量少，與染色體

41、其他部分DNA相比具有不同的浮力密度，在氯化銫密度梯度離心后呈現(xiàn)與大多數(shù)DNA有差別的“衛(wèi)星”帶而得名。Minisatellite：小衛(wèi)星DNA。是一種存在于真核生物基因組DNA中比衛(wèi)星DNA短的串聯(lián)重復(fù)序列，重復(fù)序列單位長度在10-100bp 之間, 且在其重復(fù)單元之間并不存在間隔序列。Microsatellite：微衛(wèi)星DNA。它是存在于真核基因組DNA中的一種具有比小衛(wèi)星DNA更短重復(fù)單元(24bp)的衛(wèi)星DNA，重復(fù)序列單位長度小于10 bp(一般是2-5，最多為6) ,例如真核生物染色體末端的端粒就是一種微衛(wèi)星DNA。STR：短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat，S

42、TR），又稱微衛(wèi)星DNA(microsatellite DNA)。VNTR：(Variable number of tandem repeat)，即數(shù)目可變的串聯(lián)(chunlin)重復(fù)序列，又稱小衛(wèi)星DNA (Minisatellite DNA)。17.人類基因組的數(shù)目、人類蛋白質(zhì)組的成員(chngyun)，為什么后者大大多于前者。人類(rnli)基因組的數(shù)目約為3.3109bp，約含有30004000條基因，而人類蛋白質(zhì)組約有5000060000個蛋白質(zhì)成員。由此可見，盡管人類基因組只有25%是基因，而蛋白質(zhì)編碼區(qū)域只占其中的一小部分，人類蛋白質(zhì)組成員數(shù)還是大大多于人類基因組基因數(shù)。這是由于

43、存在可變剪接，所以基因的總數(shù)比潛在的蛋白質(zhì)數(shù)目少。人類的可變剪接程度比昆蟲和線蟲的大，約60%的人類基因可能存在可變剪接。因此跟其他真核生物相比，人類蛋白質(zhì)組增加的程度大于基因組增加的程度。從人類基因組其中的兩條染色體上抽出一些基因進(jìn)行可變剪接研究，我們發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致蛋白質(zhì)序列發(fā)生改變的基因可變剪接的比率高達(dá)80%，如此就可使得蛋白質(zhì)組的成員增加到5000060000種。 L6 1.PLoS：公共科學(xué)圖書館（Public Library of Science）。它是一個由科學(xué)家和醫(yī)生組成的非營利機(jī)構(gòu)，致力于把世界上科學(xué)和醫(yī)學(xué)的文獻(xiàn)作為免費(fèi)資源向公眾開放。2.Redundancy：冗余。若兩個或更多個

44、基因行使著同樣的功能，那么這些基因中沒有一個基因是必需的。4.RNA saturation hybridization (RNA-driven hybridization)：RNA飽和雜交試驗(yàn)(RNA saturation hybridization)，它可以求出在非重復(fù)序列DNA中能與mRNA 雜交部分的百分率。將少量非重復(fù)序列DNA變性后與過量mRNA混合，使每個與mRNA互補(bǔ)的DNA 序列都能有機(jī)會和mRNA形成雙鏈雜合體。這種雜交又叫RNA驅(qū)動的雜交(RNA-driven hybridization)。5.Rot：即RNA濃度和反應(yīng)時間的乘積(Rot)。RNA飽和雜交試驗(yàn)的雜交程度受其制約，Rot越大，雜交就越徹底，直到趨于飽和。 6.abundance：在每一個細(xì)胞中，每一種mRNA的平均數(shù)量被稱作這個分子的豐度。4.biochip：生物芯片。指采用光導(dǎo)原位合成或微量點(diǎn)樣等方法，將大量生物大分子（比如核酸片段、多肽分子甚至組織切片）、（細(xì)胞等）生物樣品有序地固化于支持物（如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝膠、尼龍膜等載體）的表面，組成密集二維分子排列，然后與已標(biāo)記的待測生物樣品中靶分子雜交，通過特定的儀器（比如激光共聚焦掃描或電荷偶聯(lián)攝影像機(jī)（CCD）對雜交信號的強(qiáng)度進(jìn)行快速、并行、高效地檢測分析，從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。由于常用玻片/硅片作為