1、蛋白質與氨基酸的測定教學目標 了解蛋白質區別于其他有機化合物的主要標志；掌握凱氏定氮法、雙縮脲法、茚三酮比色法、氨基態氮的測定方法及原理。 重點掌握：蛋白質系數的概念；凱氏定氮中各種試劑的用途；凱氏定氮裝置的原理及操作技能；掌握PH計甲醛滴定法測定氨基態氮的原理、方法及其操作技能。 教學內容（重點及難點）1、凱氏定氮法（蛋白質系數，氮與蛋白質之間的關系，各種試劑的用途，各種步驟的目的及注意事項）2、氨基態氮的測定（甲醛固定氨基的作用；不同PH值指示的滴定意義）第一節 概述蛋白質是生命的物質基礎，也是食品中重要的營養指標。食品中的蛋白質種類非常復雜，蛋白質分子量的變化范圍通常為50001000,

2、000道爾頓，它們包括氫、 碳、 氮、氧和硫等元素。測定原理食物中碳水化合物、脂肪中只含有C、H、O，不含有氮，含氮是蛋白質區別于其他有機化合物的主要標志，是存在于蛋白質中最為特征的元素。 蛋白質由氨基酸以不同比例構成；氨基酸由C、H、O、N以不同方法構成； 由于氨基酸種類不同和蛋白質中氨基酸構成比例不同導致蛋白質的含氮量不同 不同食品中蛋白質的含氮量為13.4%19.1% 因此，一般蛋白質含氮量為16%， 1份氮相當于6.25份蛋白質，此數值（6.25）稱為蛋白質系數，是一個平均值。*蛋白質系數16%有一前提：這些氮元素都是指的是蛋白質里的氮元素，因此，當這些氮元素來源于氮元素含量極高的三聚

3、氰胺時，是無法用蛋白質系數返算為產品中蛋白含量的。 食品中的總有機氮主要來自于蛋白質，小部分來自于非蛋白質組份的有機氮，會干擾蛋白質的測定。 食品中脂類和碳水化合物可能會干擾 一些具有相似的物化性質的組份干擾分析。干擾蛋白分析物質:凱氏定氮法包括有：常量法、微量法、經改進后的改良凱氏定氮法這三種方法的不同之處在于：儀器、裝置、試劑等都有了改進二、凱氏定氮法凱氏定氮法測定的是粗蛋白的含量 因樣品中常含有核酸、生物堿、含氮類脂、卟啉以及含氮色素等作蛋白質的含氮化合物，故凱氏定氮法通常將測定結果稱為粗蛋白質含量。2.1.2 凱氏定氮過程步驟：樣品制備(自學) 消化 蒸餾 吸收與滴定*學習中特別需要注

4、意掌握各個過程中所使用的試劑都有哪些作用2.1常量凱氏定氮法1. 原理 消化： 樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱，使蛋白質分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機氮轉化為氨與硫酸結合成硫酸銨。堿化蒸餾：然后加堿蒸餾，使氨蒸出。吸收與滴定： 用H3BO3吸收后生成硼酸氨； 再以標準HCl溶液滴定； 根據標準酸消耗量可以計算出蛋白質的含量。2.1.2.2 濕法消化蛋白質中的氮形成銨離子和硫酸結合成硫酸銨，硫酸氧化有機物使碳元素和氧元素被轉化成二氧化碳和水。樣品中的有機物消化至透明澄清. 加硫酸作用：濃硫酸具有脫水性，使有機物脫水并炭化為碳、氫、氮。 濃硫酸又有氧化性，使炭化后的碳氧化為

5、二氧化碳，硫酸則被還原成二氧化硫加入量不能太大：否則消化體系溫度過高，生成的銨鹽發生熱分解放出氨而造成損失。也可以加入硫酸鈉、氯化鉀提高沸點，效果較差硫酸鉀：增溫劑，提高溶液沸點加速蛋白質的分解，縮短消化時間，加入催化劑：加硫酸銅作用：加速有機物的氧化與分解有機物全部被消化完后，不再有硫酸亞銅褐色生成，溶液呈現清澈的二價銅的籃綠色，可指示消化終點的到達2.1.2.3 堿化、蒸餾 消化完全的樣品溶液中加入濃氫氧化鈉使溶液呈堿性，加熱蒸餾，釋放出氨氣2.1.2.4吸收與滴定 4%硼酸吸收； 鹽酸標準溶液滴定； 指示劑為混合指示劑（甲基紅溴甲基酚綠混合指示劑）。甲基紅溴甲基酚綠混合指示劑終點判斷：指

6、示劑在反應過程中色澤變化: （酸性條件下為甲基紅所顯的紅色，當體系變為綠色時則呈現溴甲基酚綠所有的綠色，因此，稱為混合指示劑）指示劑先加入硼酸中，呈現酸性紅色，通入氨氣后呈現變藍綠色；用HCL一滴定，到后來又顯了稍過量鹽酸的酸性紅色定氮裝置一、1、電爐； 2、水蒸氣發生器；3、螺旋夾a；4、小漏斗及棒狀玻璃塞（樣品入口處）；5、反應室；6、反應室外層；7、橡皮管及螺旋夾b；8、冷凝管9、蒸餾液接收瓶。 定氮裝置二2.1.3定氮裝置的檢查與洗滌 檢查微量定氮裝置是否裝好。在蒸氣發生瓶內裝水約三分之二，加甲基紅指示劑數滴及數毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入數粒玻璃珠（或沸石）以防止暴沸。 測定前定氮

7、裝置如下法洗滌23次：從樣品進口入加水適量（約占反應管三分之一體積）通入蒸汽煮沸，產生的蒸汽沖洗冷凝管，數分鐘后關閉夾子a，使反應管中的廢液倒吸流到反應室外層，打開夾子b由橡皮管排出，如此數次，即可使用。 本實驗的定量以氮原子的去向為準一開始是蛋白-氨氣-硼酸胺所以必須關注這三種物質不能在檢測過程中的損失，無論在消化還是吸收或是滴定過程中，都要保證其不損失2.1.4 計算新鮮食品中的含氮化合物大多以蛋白質為主體，先測定總氮量，然后乘以蛋白質換算系數，得到蛋白質含量。換算系數一般為6.25（100/16 = 6.25）。 即：%N 6.25 = %蛋白質 2.1.5消化過程操作注意事項： 消化時

8、不用強火，保持和緩沸騰，以免黏附在凱氏瓶內壁上的含氮化合物在無硫酸存在的情況下未消化完全而造成氮損失。 消化過程中應不時轉動凱氏燒瓶，利用冷凝酸液將附在瓶壁上的固體殘渣洗下，促進其消化完全。 問題1:為什么凱氏定氮所用試劑溶液應用無氨蒸餾水配制,如何配制。 問題二：加硫酸銅作用起催化劑的作用。 還可指示消化終點的到達，為清澈的藍綠色。 指示蒸餾時的堿加入量是否足夠。 問題三：消化過程中是否有大量的泡沖到瓶頸，原因是什么，如何解決？ 樣品中若含脂肪或糖較多 開始消化時應用小火加熱，并時時搖動；或者加入少量辛醇或液體石蠟或硅油消泡劑，并同時注意控制熱源強度。 消化至呈透明后，繼續消化30分鐘即可，

9、含有特別難以氨化的氮化合物的樣品，需適當延長消化時間。有機物如分解完全，消化液呈藍色或淺綠色，但含鐵量多時，呈較深綠色。問題四：如何判斷消化的終點？ 問題五：蒸餾前若加堿量不足會出現什么現象，為什么，如何解決？ 若加堿量充足，消化液變為深藍色，或產生黑色氫氧化銅沉淀，若加堿量不足，則消化液呈藍色而無沉淀，此時需再增加氫氧化鈉用量。 蒸餾完畢 先將冷凝管下端提離液面清洗管口 再蒸1分鐘，用表面皿接幾滴餾出液，以奈氏試劑檢查如無紅棕色物生成，表示蒸餾完畢，即可停止加熱。 （避免吸收液倒吸）問題六：蒸餾完畢拆下裝置時的注意事項 不能超過40，否則對氨的吸收作用減弱而造成損失，可置于冷水浴中使用。問題

10、七：為何要控制硼酸吸收液的溫度？問題八：混合指示劑顏色： 在堿性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色。問題九：硫酸與鹽酸滴定的區別注意：H2SO4 與 HCL的區別1/2（H2SO4）= HCL優點：1可用于所有食品的蛋白質分析。 2操作比較簡單。 3實驗費用低。 4結果準確，是一種測定蛋白質的經典方法。 5用微量法可測定樣品中微量的蛋白質。缺點 1最終測定的是總氮含量，而不只是蛋白質氮。 2實驗時間太長。 3所用試劑有腐蝕性。 本實驗方法的優、缺點2.2 微量凱氏定氮法1、原理及適用范圍同前2、與常量法不同點：加入硼酸量有50 ml 10 ml,滴定用鹽酸濃度由0.1 mol

11、/L 0.01 mol/L ,可用微量滴定管。2.3常量改良凱氏定氮法2.3.1 原理及適用范圍同前 在凱氏法改良中主要的問題是： 氮的完全氮化、縮短時間、簡化操作 這里主要需解決的是催化劑的種類、硫酸和鹽類的添加量等。 2.3.2 特點：（1）消化裝置用優質玻璃制成的凱氏消化瓶，紅外線加熱的消化爐。（2）快速：一次可同時消化8個樣品，30分鐘可消化完畢。（3）自動：自動加堿蒸餾，自動吸收和滴定，自動數字顯示裝置。可計算總氮百分含量并記錄，12分鐘完成1個樣。為什么在蒸汽發生瓶中要加入指示劑甲基橙和硫酸？加入數粒玻璃珠的作用是什么？凱氏定氮瓶的結構對于定氮操作：內層加消化液、加堿液是反應發生器

12、。外層加無氨蒸餾水、加熱產生蒸汽-蒸汽從內外兩層連接小口處通入，對反應液進行水蒸氣蒸餾。還有一部分是氨氣冷凝裝置。對于定氮瓶清洗操作：倒吸-需有壓力差（內層壓力應大，外層壓力應小才能產生倒吸）-由于本實驗裝置中無產生壓力裝置，是利用了大氣壓力，和冷卻水快速流過細玻璃管所產生的負壓之間的壓差-找尋大氣壓力入口，找尋負壓產生入口及負壓的封閉系統三、雙縮脲法原理： 堿性條件下，銅離子和多肽（至少有二個肽鍵，如多肽和所有的蛋白質）生成的復合物呈紫紅色，吸收波長為560nm，比色所得的吸光度值和樣品中蛋白質的含量成正比。樣品的測定： 自學氨基酸態氮的測定雙指示劑甲醛滴定法電位滴定法四、氨基酸態氮的測定4

13、.1 雙指示劑甲醛滴定法原理： 氨基酸具有酸性的-COOH基和堿性的-NH2基。它們相互租用而使氨基酸成為中性的內鹽。 當加入甲醛溶液時，-NH2基與甲醛結合，從而使其堿性消失。 這樣就可以用強堿標準溶液來滴定 -COOH基，并用間接的方法測定氨基酸的總量。 吸取含氨基酸約20mg的樣品溶液于100ml容量瓶中，加水至標線，混勻后吸取20.0ml置于200ml燒杯中，加水60ml，開動磁力攪拌器，用0.05mol/l氫氧化鈉標準溶液滴定至酸度計指示pH8.2，記錄消耗氫氧化鈉標準溶液ml數（V10），供計算總酸含量。 加入10.0ml甲醛溶液，混勻。再用上述氫氧化鈉標準溶液繼續滴定至pH9.2

14、，記錄消耗氫氧化鈉標準溶液體積。而真正樣品中強堿標準溶液滴定 -COOH基的過程是指: 此法準確快速，適用于測定食品中游離氨基酸。 固體樣品應先進行粉碎，準確稱樣后用水萃取，然后測定萃取液；液體試樣如醬油、飲料等可直接吸取試樣進行測定。 但不適合顏色較深或渾濁的樣品測定。說明及注意事項4.2 電位滴定法原理： 根據氨基酸的兩性作用，加入甲醛以固定氨基的堿性，使羧基顯示出酸性，將酸度計的玻璃電極及甘汞電極同時插入被測液中構成電池，用氫氧化鈉標準溶液滴定，依據酸度計指示的pH值判斷和控制滴定終點。五、茚三酮比色法原理 氨基酸（酰氨鍵）在堿性溶液中能與茚三酮作用，生成藍紫色化合物（除脯氨酸外均有此反

15、應），可用吸光光度法測定。 該藍紫色化合物的顏色深淺與氨基酸含量成正比，其最大吸收波長為570nm，故據可以測定樣品中氨基酸含量。1、凱氏定氮法是通過對樣品總氮量的測定換算出蛋白質的含量，這是因為 。2凱氏定氮法消化過程中H2SO4的作用是 ；CuSO4的作用是 。3凱氏定氮法的主要操作步驟分為消化、蒸餾、吸收、滴定；在消化步驟中，需加入少量辛醇并注意控制熱源強度，目的是 ；在蒸餾步驟中，清洗儀器后從進樣口先加入 ，然后將吸收液置于冷凝管下端并要求 ，再從進樣口加 入 20%NaOH至反應管內的溶液有黑色沉淀生成或變成深藍色，然后通水蒸汽進行蒸餾；蒸餾完畢，首先應 ，再?；饠鄽?。凱氏定氮法共分四個步驟、。消化時還可加入、助氧化劑。消化加熱應注意，含糖或脂肪多的樣品應加入作消泡劑。消化完畢時，溶液應呈顏色。凱氏定氮法加堿進行蒸餾時，加入NaOH 后溶液呈 色。4. K2SO4在