1、膿毒癥病理的生理基礎(chǔ)以及其研究相應進展研 究 背 景 膿毒癥(Sepsis)是嚴重創(chuàng)(燒、戰(zhàn))傷、休克、感染、外科大手術(shù)患者常見的并發(fā)癥，進一步發(fā)展可導致膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征 (MODS)，是臨床危重患者的最主要死亡原因之一。膿毒癥和MODS來勢兇猛、病情進展迅速、預后險惡，給臨床救治工作帶來極大困難，已成為現(xiàn)代危重病醫(yī)學面臨的突出難題。Sands KE et al. JAMA. 1997; 278: 234-40; Based on data for septicemia. Murphy SL. National Vital Statistics Reports. Angus D

2、C et al. Crit Care Med. 2001 Reflects hospital-wide cases of severe sepsis as defined by infection in the presence of organ failure. 膿毒癥 新世紀對人類健康和經(jīng)濟發(fā)展的重大挑戰(zhàn)全球性的威脅和挑戰(zhàn)，患病率約為人口的 3/1000，全球總病例數(shù)約1800萬/年，相當于丹麥、芬蘭、愛爾蘭和挪威人口的總和；美國患病人數(shù)為75萬/年；歐洲為萬/年。 全世界死亡人數(shù)超過萬/天；美國萬/年，并成為美國非心臟 ICU 死亡的主因。尚有相當?shù)乃劳霾±龥]有計算在內(nèi)，而歸咎于原發(fā)病。

3、在美國平均治療費用約萬/例，年耗資近$200億；歐洲年耗資近$100億；截至1995年，總研發(fā)費用已經(jīng)超過$10億。發(fā)病人數(shù)正以年的比例增長；過去10年間，增加病例139%，且有繼續(xù)增加的趨勢。膿毒癥與其他嚴重病癥的比較National Center for Health Statistics, 2001. American Cancer Society, 2001. *American Heart Association. 2000. Angus DC et al. Crit Care Med. 2001. AIDS*ColonBreastCancerCHFSevere SepsisCase

4、s/100,000 膿毒癥的發(fā)生率膿毒癥的病死率AIDS*SevereSepsisAMIBreast Cancer1750110130300211000215000膿毒癥與急性心梗死亡率變化的比較1960年 1995年10%20%30%40%50%膿毒癥急性心梗 2002年巴塞羅那宣言 全社會要像當年重視“中風”和“急性心梗”一樣，重視對膿毒癥的研究和治療，爭取把膿毒癥的發(fā)生率和死亡率降低到可接受的水平。研 究 背 景 盡管膿毒癥新概念與臨床特征的認識有所進步，但膿毒癥、MODS的臨床試驗性治療相繼失敗，其病死率仍居高不下(5080%)。究其原因，關(guān)鍵是有關(guān)膿毒癥和MODS的根本發(fā)病環(huán)節(jié)及作用

5、機制尚未充分闡明，缺乏早期有效的預防與治療措施。因此，開展其研究具有極其重要的理論意義和實用價值。膿毒癥基礎(chǔ)研究進展遺傳背景 (基因多態(tài)性研究) 重要誘發(fā)因素 (微生物及其產(chǎn)物、內(nèi)/外毒素作用)晚期炎性介質(zhì)與效應分子 (高遷移率族蛋白-1、BH4)細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導機制 (MAPK通路, JAK/STAT通路)網(wǎng)絡(luò)效應與器官間相互作用 (神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫 凝血-纖溶-炎癥)基因組學與蛋白組學調(diào)節(jié)方法與干預途徑 (活化蛋白C)嚴重損傷后全身性炎癥反應失控及器官損害受體內(nèi)眾多基因的調(diào)控，但為何有的人群易于并發(fā)膿毒癥和MODS？對MODS患者采取相似的治療方案，但機體反應和預后可能完全不同。這些現(xiàn)象是

6、否與體內(nèi)存在某種MODS相關(guān)的“易感基因”或基因表達特性的改變影響宿主對應激狀態(tài)的敏感有關(guān)？基因多態(tài)性TNF-2 純合子患者 TNF-水平和病死率均高于雜合子或TNF-1 純合子患者，證實TNF-2基因型可能是嚴重膿毒癥患者出現(xiàn)高TNF-水平和不良預后的基因標志之一。TNF-雙等位基因Nco1多態(tài)性與嚴重膿毒癥和器官損害的發(fā)生密切相關(guān), 分析其多態(tài)性有助于評估并發(fā)膿毒癥和MODS的易感性及明確對抗TNF免疫治療的反應性。基因多態(tài)性 (基因組序列上的變異) 是決定人體對應激打擊易感性與耐受性、臨床表型多樣性及藥物治療反應差異性的重要因素。基因多態(tài)性 基因大規(guī)模直接測序，明確了中國人群中一些在創(chuàng)、

7、燒傷感染發(fā)病中起關(guān)鍵作用的效應分子的基因多態(tài)性分布，并初步進行了臨床關(guān)聯(lián)分析和功能研究。 已明確 TLR4受體 5 區(qū)-1892GA、-1837 AG、 CD14 啟動子區(qū) -1145G/A 和 -159C/T、IL-1啟動子區(qū)-1470 GC 、-511TC和 -31 CT與創(chuàng)傷感染易感性存在密切的內(nèi)在聯(lián)系。 12CD14 C-159T基因多態(tài)性對 TNF- mRNA表達的影響13CD14 C-159T基因多態(tài)性對LBP濃度的影響攜帶不同CD14基因多態(tài)性燒傷患者單核細胞表面HLA-DR的表達* * * 燒傷膿毒癥患者預后與單核細胞HLA-DR結(jié)合量的關(guān)系* * *16 CD14 C-159

8、T基因多態(tài)性與 MODS發(fā)生率及死亡率的關(guān)系基因型例 數(shù)（n）MODS例數(shù)（n）死亡例數(shù)（n）-159CC700-159CT1064-159TT43371例特重度燒傷患者基因型與膿毒癥及死亡率的關(guān)系 基因型例數(shù)非膿毒癥（例）膿毒癥（例）死亡率（%）CC73（42.9）4（57.1）2（28.6）TC4618（39.1）28（60.9）11（23.9）*TT185（27.8）13（72.2）9（50.0）18 臨床試驗性治療膿毒癥的實踐中，應當考慮基因的因素。如果對照和治療組CD14C-159T或其他易感基因多態(tài)性的分布頻率不一致，那么結(jié)果無論是支持或是否定試驗性治療，其判定很可能會產(chǎn)生偏差。

9、膿毒癥早期識別與判定預后的輔助工具。在不久的將來，基因多態(tài)性的檢測很可能會幫助患者選擇個體化的有針對性的治療 ，從而有利于降低膿毒癥 和/ 或MODS 的發(fā)病率。細菌內(nèi)毒素內(nèi)毒素血癥與細菌感染關(guān)系密切, 是創(chuàng)傷感染的重要致病因素之一。創(chuàng)傷膿毒癥中, 內(nèi)毒素常常與細菌協(xié)同致病, 兩者同時并存。內(nèi)毒素具有極廣泛而又復雜的生物學效應，膿毒癥、MODS病理過程中出現(xiàn)的失控炎癥反應、免疫機能紊亂、高代謝狀態(tài)及多臟器功能損害均可由內(nèi)毒素直接或間接觸發(fā)。 G- 菌細胞壁最外層結(jié)構(gòu), 主要成分為脂多糖 (LPS) 。由三部分組成： 外層為O-特異性多糖鏈, 為細菌特異性抗原; 中層為R-核心多糖, 為細菌類屬

10、共同的抗原; 內(nèi)層為類脂A, 主要決定其生物活 性。 分子結(jié)構(gòu)特征1. 刺激單核巨噬細胞、內(nèi)皮細胞、粒細胞合成、釋放介質(zhì)、蛋白酶類物質(zhì)等，介導機體內(nèi)組織、細胞的損傷; 2. 促進血小板凝集，激活凝血、纖溶系統(tǒng)，從而觸發(fā)DIC; 生物學活性生物學活性3. 對免疫系統(tǒng)的影響, 可激活補體、促進淋巴細胞有絲分裂、誘導干擾素, 并有抗腫瘤及免疫佐劑作用; 4. 引起病理生理改變: 發(fā)熱反應、血壓降低、代謝改變、局部過敏反應。1. 全身網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)功能障礙, 免疫機能下降, 腸道吸收的內(nèi)毒素過多超過機體之清除能力;2. 胃腸道粘膜缺血、壞死, 屏障功能破壞, 通透性增高, 大量內(nèi)毒素釋放入血;內(nèi)毒素血癥

11、發(fā)生原因3. 腸道來源的內(nèi)毒素因肝功能障礙由側(cè)支循環(huán)直接入體循環(huán); 4. 某些組織、器官G- 菌感染病灶持續(xù)產(chǎn)生的內(nèi)毒素吸收入血。內(nèi)毒素血癥發(fā)生原因 燒傷早期即出現(xiàn)內(nèi)毒素水平升高, 傷后 3 4天達高峰, 2 3周又出現(xiàn)回升。 內(nèi)毒素水平隨燒傷面積的增加而增加。 內(nèi)毒素血癥發(fā)生率達 74.7%, 而 菌血癥陽性率僅 38.2%。 發(fā)病過程及規(guī)律 既往多認為來源于創(chuàng)面或血循環(huán)G- 菌 感染后大量釋放。 早期主要不是源于創(chuàng)面 , 腸道蓄積內(nèi) 毒素侵入血循環(huán)可能是最重要的來源。 后期內(nèi)毒素水平的再度升高，與難以 控制的創(chuàng)面膿毒癥相關(guān)。燒傷后內(nèi)毒素血癥來源 與感染、免疫的關(guān)系 與膿毒癥、多臟器功能障礙

12、綜合 征的關(guān)系 循環(huán)內(nèi)毒素含量監(jiān)測的臨床價值內(nèi)毒素血癥的臨床意義 內(nèi)毒素血癥與細菌感染關(guān)系密切, 是創(chuàng)傷感染中的重要致病因素之一。在燒傷膿毒癥中, 內(nèi)毒素常常與細菌協(xié)同致病, 兩者同時并存。但有時血液內(nèi)毒素檢測呈陽性反應, 而細菌培養(yǎng)不一定陽性, 提示內(nèi)毒素血癥可單獨存在。 不同燒傷面積內(nèi)毒素血癥及菌血癥陽性率比較燒傷面積 內(nèi)毒素血癥 菌血癥 組別() 例數(shù) 例數(shù) III.III 70-98 65/87 18/47 *# 燒傷后內(nèi)毒素血癥出現(xiàn)時間早于菌血癥, 內(nèi)毒素可促進細菌移位。內(nèi)毒素血癥與嚴重創(chuàng)傷后全身播散性感染的發(fā)生亦緊密相關(guān)。內(nèi)毒素血癥與膿毒癥相關(guān)率達70%, 當內(nèi)毒素持續(xù)升高時, 應

13、警惕播散性細菌感染的發(fā)生。細胞免疫異常表現(xiàn)為淋巴細胞對促有絲分裂因子刺激反應降低, 伴Ts增多、Th減少。細胞免疫障礙與血清中過量內(nèi)毒素有關(guān)。 多粘菌素B可部分恢復NK細胞活性及逆轉(zhuǎn)Th/Ts異常, 且能消除燒傷血清對IL-2抑制反應。內(nèi)毒素在燒傷后免疫抑制中的作用休克初期發(fā)生內(nèi)毒素血癥，Re-LPS抗血清輸注后血漿 PGE2明顯降低。燙傷后脾細胞對 Con A或PHA刺激反應及誘生 IL-2活性抑制。SDD可顯著降低內(nèi)毒素水平，同時脾細胞增殖應答及誘生IL-2明顯升高。腸源性內(nèi)毒素對全身免疫的影響 脾細胞對Con A刺激增值反應的改變 *脾細胞 IL-2 活性的改變 *1. 通過PGE2對免

14、疫系統(tǒng)下向調(diào)控引起多方面抑制效應;2. 導致單核細胞提呈抗原表達能力降低, 并抑制中性粒細胞趨化性受體的表達; 3. 激活單核巨噬細胞誘生細胞因子, 介導對機體防御機能及多器官損害效應;4. 經(jīng)替代途徑活化補體, 生成補體裂解產(chǎn)物。內(nèi)毒素介導燒傷免疫抑制的機制MODS家兔內(nèi)毒素含量升高幅度大、持續(xù)較高水平，且與多器官功能相關(guān)顯著。輸注 Re-LPS 抗血清后，內(nèi)毒素升高幅度及持續(xù)時間顯著降低，MODS發(fā)生率休克早期給予rBPI21可完全中和循環(huán)內(nèi)毒素，能減輕肝、肺、腎及腸道損害等。 內(nèi)毒素與膿毒癥、MODS的關(guān)系 MODS與非MODS患者內(nèi)毒素水平比較 * 血漿內(nèi)毒素水平與MSOF發(fā)生頻率內(nèi)毒

15、素 例數(shù)(EU/ml) MSOF NMSOF 死亡 0.05 0.05 敏感性 特異性 準確性 陽性 陰性 預測值 預測值新喋呤 內(nèi)毒素 新喋呤合并內(nèi)毒素 新喋呤、內(nèi)毒素、新喋呤合并內(nèi)毒素 對MODS的診斷有效率比較（%) 內(nèi)毒素 外毒素細胞壁 等 炎癥介質(zhì)(TNF-, IFN-、IL-1等)iNOSGTP-CHI精氨酸胍氨酸 +NO血管擴張循環(huán)障礙Mon/M 細胞平滑肌細胞內(nèi)皮細胞等DAHPiNOS活性生物喋呤對iNOS的調(diào)控機制BH4?GTP-CHIDAHP生物喋呤原生型NOS 誘生型NOS NO基礎(chǔ)水平 抑制大量NO釋放DAHP對膿毒性休克的防護效應基因組與蛋白組學 傳統(tǒng)模式中多數(shù)實驗性

16、研究集中于某一信號分子、動物模型中的幾個相關(guān)分子或者培養(yǎng)獨立的細胞及細胞系。為了達到全面理解的目的，需要同時分析許多不同的分子及其相互作用，并運用定量的模擬方法總結(jié)這些數(shù)據(jù)以闡明能夠用于直接治療的關(guān)鍵信號結(jié)點。 膿毒癥蛋白組學 蛋白組被定義為細胞、組織或機體中表達的所有蛋白的含量和種類；蛋白組方法可分為三種不同的類型：即表達蛋白組、結(jié)構(gòu)蛋白組和功能蛋白組；功能蛋白組探討蛋白質(zhì)之間的相互作用和翻譯后的修飾并對其進行調(diào)節(jié)，集中于調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導過程中分子的相互作用，是深入了解膿毒癥分子機制的核心環(huán)節(jié)。膿毒癥蛋白組學 利用蛋白組學研究策略，將來人們可以精確計算并鑒定導致膿毒癥分子病理學改變的信號網(wǎng)絡(luò)中重

17、要的結(jié)合點。一旦找出其關(guān)鍵的信號中樞，就可以進行標準化合理的藥物設(shè)計，從而生產(chǎn)出體內(nèi)更有效、副作用更小的特異性調(diào)節(jié)劑。神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò) 電刺激迷走神經(jīng)傳出支激活膽堿能抗炎途徑可抑制膿毒癥多器官TNF-產(chǎn)生，減少膿毒性休克的發(fā)生率。迷走神經(jīng)切除顯著提高炎癥刺激下 TNF-合成與釋放 ，增強內(nèi)毒素對動物的致死性。膽堿能抗炎途徑可特異性抑制局部炎癥。利用膿毒癥的神經(jīng)調(diào)節(jié)機制來探討其防治策略是一個較新的研究領(lǐng)域，目前尚處于探索階段。近年來的研究證實，免疫功能紊亂在膿毒癥發(fā)生、發(fā)展過程中確實具有重要作用。機體往往有短暫的SIRS，隨后是長期的CARS和MARS。SIRS表現(xiàn)為非特異性免疫系統(tǒng)高度活

18、躍和炎癥反應亢進；CARS表現(xiàn)為特異性免疫系統(tǒng)的抑制 。 膿毒癥與炎癥及免疫功能紊亂 TCRCD28CD152MHC-B7B7NFATAP-1IL-2RIL-2 DCT cellT淋巴細胞的克隆無反應狀態(tài)抑制性細胞因子作用細胞凋亡和凋亡細胞作用DC/巨噬細胞IL-12IFN-IL-10PGE2Th0Th2Th1CD4+T淋巴細胞的功能性分化細胞凋亡本是細胞死亡的被動和正常生理過程。但膿毒癥中，細胞凋亡加速，成為主動的病理過程。已證實，誘導膿毒癥細胞凋亡加速的主要物質(zhì)是促炎細胞因子，如TNF、FasL、顆粒酶等和糖皮質(zhì)激素。T 細 胞TNFFasL顆粒酶糖皮質(zhì)激素TNFFasL顆粒酶糖皮質(zhì)激素抗

19、原刺激無刺激主 動 凋 亡被 動 凋 亡細胞的正常凋亡與加速凋亡 膿毒癥誘導器官凋亡的實驗研究作 者 模型 胸腺 脾臟 肝臟 肺臟 腸道 Fukuzuka, 1999 燒傷 Mignon, 1999 LPS Chung, 1998 CLP Hotchkiss, 1997 CLP Hiramatsu, 1997 CLP Ayala, 1996 CLP Wang, 1994 G+菌血癥 注：廣泛凋亡；明顯凋亡；輕度凋亡；無凋亡 膿毒癥時間愈長,T細胞和B細胞的缺失愈加明顯,大部分患者死于長期的低免疫狀態(tài)期。 -新英格蘭醫(yī)學雜志 The New England Journal of Medicine

20、 (2003). 348; 138-150.膿毒癥免疫反應示意圖打 擊化學物質(zhì)：自由基、蛋白酶物理損傷：機械、熱力抗 體補 體細胞膜損傷細胞壞死炎癥反應MONKCD8Th1激素TNF顆粒酶FasL非細胞膜損傷細胞凋亡非特異性全身炎癥反應 特異性免疫功能胸腺肽對膿毒癥的免疫調(diào)理作用激活低下的特異性免疫： 促進淋巴細胞分化成熟和單核細胞抗原呈遞，阻止特異性免疫細胞凋亡。拮抗亢進的非特異性免疫反應： 降低循環(huán)內(nèi)毒素及促炎介質(zhì)水平, 增加抗炎介質(zhì)的水平。Th1IFN-LT巨噬細胞(增強殺菌能力)+嗜中性細胞(增強殺菌能力)IL-2+調(diào)節(jié)CD4+/CD8+比例(增強機體免疫水平)胸腺肽1胸腺肽對內(nèi)毒素攻擊小鼠炎癥介質(zhì)的影響Alan Goldstein, Thymosin a1 reduces blood level of IL-1, PAF and metabolites in mice treated with lethal doses of endotoxin增