1、開放性實驗實驗報告實驗名稱：大腸桿菌染色體DNA的分離及限制性內切酶酶切實驗時間：2011年11月12日一13日實驗地點：中國藥科大學實驗樓D105實驗人員：朱漫杰（1053516），邵雅麗（1043232）實驗目的：了解大腸桿菌染色體DNA制備和酶切的原理掌握制備大腸桿菌染色體DNA和DNA酶切的基本技術方法。實驗原理：1、DNA分離DNA是一個環形的大分子DNA,真核生物的DNA是以染色體的形式 存在于細胞核內。DNA的分離原則是將DNA與蛋白質、脂類和糖類等 分離，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般過程是將分散好的組織細胞在含十二烷基硫酸 鈉（SDS）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋

2、白質，再用酚和氯仿除去 殘余蛋白質，得到的DNA溶液用75%的酒精洗滌以除去鹽分和殘留的 有機溶劑。（SDS的作用機理是由于其能結合蛋白，中和蛋白的電性， 使蛋白質的非共價鍵受到破壞，失去二級結構，從而變形失活，蛋白 酶K的重要特性是能在SDS和EDTA存在的情況下保持很高的活性。 在勻漿后提取DNA的反應體系中，SDS可通過失活蛋白破壞細胞膜、核膜，并使組織蛋白與DNA分離；而蛋白酶K可將蛋白質降解成小肽 或氨基酸，使DNA分子完整地分離出來。)2、限制性內切酶切消化DNAII型DNA限制性內切酶是一類可以識別雙鏈DNA的特異堿基序 列的核酸水解酶。其以內切方式水解DNA鏈中的磷酸二酯鍵，結

3、果分 別在兩條雙鏈的末端留下5端磷酸基團和3端羥基。瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作為支持介質的一種電泳方法，是分 離、鑒定和純化DNA片段最為常用的方法之一。不同大小、不同形狀 和不同構象的DNA分子在相同的電泳條件下有不同的遷移率，所以可 通過電泳使其分離。溴化乙啶可插入到DNA分子鏈中，在紫外光的照 射下，插入溴化乙啶的DNA呈橙紅色熒光，可以指示DNA的含量和位 置。經過酶切的DNA和正常DNA分子大小形狀不同，因此位置也是不 同的。實驗材料：1、試劑大腸桿菌染色體DNA制備試劑：LB培養基(1%胰蛋白月東(Tryptone)，0.5%酵母提取物(Yeast Extract)，1% NaCl

4、，加蒸餾水配制，分裝，高壓蒸汽(1.03X 105Pa) 滅菌20 min)TNE 緩沖液(10mmol/L Tris-HCl, pH8.0, 10mmol/L NaCl, 0.1mmol/L EDTA)TE 緩沖液(10mmol/L Tris-HCl, pH8.0, 0.1mmol/L EDTA)THE 緩沖液(50mmol/L Tris-HCl, pH8.0, 20mmol/L EDTA)胰RNA酶A (10mg/ml,溶于TE緩沖液中，80C預熱10分鐘，使其中的DNA酶失活)蛋白酶K (10mg/ml，溶于TNE緩沖液中，37C預熱15分鐘， 消化所有存在的DNA酶)2%十二烷基肌氨酸

5、鈉(溶于THE緩沖液中)苯酚:氯仿(1:1,以 0.5mol/L Tris-HCl, pH8.0 平衡)；該氯仿為氯仿和異戊醇(24:1 V/V)的混合物3.0 mol/L 醋酸鈉異丙醇(儲存于-20C)70%乙醇(室溫)乙醚(通風櫥內)聚乙二醇(PEG) 400，用水按照1： 1的比例稀釋，用于沖洗 苯酚燒傷。限制性內切酶酶切DNA試劑：染色體DNA；限制性內切酶 BamHI (5 units/L)；10X限制性內切酶緩沖液(含牛血清白蛋白)；無菌去離子水； 瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA試劑：1%瓊脂糖EB溶液 溴化乙啶(10mg/ml)，用時稀釋10倍加樣緩沖液50%甘油+0.25%溴酚藍PH

6、8.3 Tris硼酸一EDTA 緩沖液2 .器材菌株：大腸桿菌，LB培養基培養至對數生長期末期電熱恒溫培養箱；標準凈化工作臺；高壓滅菌鍋；恒溫水浴鍋；冷凍離心機；微量移液器(20p L或100p L)；旋渦混合器；滅菌的Eppendorf管(1.5和0.5ml微量離心管)和Eppendorf離心管架；水平瓊脂糖凝膠電泳槽；穩壓電泳儀；核酸蛋白紫外檢測儀；滅菌的移液器槍頭；照相器材；滅菌的Eppendorf管(1.5和0.5ml微量離心管)和Eppendorf離心管架；【實驗流程】1 .大腸桿菌染色體DNA制備1.5 ml 菌液置于 EP 管內，100000r/min 離心 1min。將菌體懸浮

7、于0.3 ml THE緩沖液中，確保沒有菌塊。在菌體懸浮液中加入0.35 ml 2%十二烷基肌氨酸鈉。將離心 管顛倒數次，充分混勻。加入5p l RNA酶，37C水浴保溫15min。 再加入35p l蛋白酶K,在50C水浴加熱直至細胞裂解完全(30min)。旋渦振蕩細胞裂解液2 min以剪切DNA。酚：氯仿抽提：加入0.70ml苯酚：氯仿1： 1的混合物，短暫(幾秒鐘)旋渦振蕩混合，12000rpm/min離心5min，使其分層，將 頂層部分小心移至一新的EP管中。沉淀DNA:加入70p l醋酸鈉溶液，混勻，再加入0.7ml異丙 醇，顛倒混勻5-6次。冰浴10 min。12000rpm/min

8、離心10 min，傾 去上清。漂洗DNA沉淀：加入70%乙醇約1.0ml，稍加混勻，12000rpm/min 離心10 min，傾去上清。重復兩次。冰箱中4C干燥以除去乙醇。溶解DNA沉淀于50p l的TE緩沖液中。作好標記，-20C保存。限制性內切酶酶切染色體DNA與鑒定-20 C冰箱中取出實驗的樣品，讓其升至室溫。樣品中加入50p L ddw振蕩使其溶解在1.5 mLEP管中依次加入：dd H2o2p L10XBamHI Buffer2p L15p LDNA SampleBamHIEP 管 37C保溫 1h。制備瓊脂糖凝膠取酶切DNA和未酶切DNA進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定紫外光下照射觀察DN

9、A位置并拍照實驗結果:本組實驗圖像分析：分子越小遷移速度越快，遷移距離越遠。原 DNA分子沒有被酶切，分子大小、形狀接近，遷移速度接近，位置比 較集中。酶切以后的DNA分子被分成多個大小形狀不等的片段，遷移 速度不等，位置比較分散。其他組實驗圖像分析：1、原DNA和酶切DNA的位置都很集中的可能原因：DNA沒有被限制性內切酶切割：a、限制性內切酶失活b、DNA不純，含有SDS、有機溶劑、EDTA等仇非限制性內切酶最佳反應條件d、酶切位點被修飾、不存在該酶的識別順序（2）DNA切割不完全：a、限制性內切酶活性下降或稀釋不正確b、DNA不純或反應條件不佳c、酶切位點被修飾d、酶切后DNA粘性末端退

10、火2、原DNA和酶切DNA的位置都很分散或看不見的可能原因：（1）顯色劑與DNA沒有結合（2）原DNA被分離時發生機械斷裂，產生大小不同的片段（3）無DNA片段存在：DNA分離時被降解實驗討論：1、DNA提取的主要步驟包括破碎細胞，去除蛋白、多糖、脂類等大 分子，去除RNA分子，沉淀DNA，去除鹽、有機溶劑等雜物，純化DNA 等。2、如果提取的DNA不易溶解，可能是：（1）、DNA不純，含雜質較多（2）、加溶解液太少使其濃度過大（3）、沉淀物太干燥3、影響限制性內切酶酶切效果的因素：（1）樣品DNA的用量（2）酶的用量、純度、星活性（3）酶切反應體積（4）反應緩沖液的成分、濃度、PH（5）反應時間、溫度4、影響DNA純度的因素以及控制方法：（1）菌體量可能過大，裂解不充分，或裂解液與中和液比例不適當；（調整菌液量或緩沖液量）（2）混合時過于劇烈，可能會帶來基因組DNA片段的污染；（輕 柔