1、基因重組與基因工程1生物工程定義 生物工程是生物技術(shù)的總稱，是對(duì)生命有機(jī)體在分子水平、細(xì)胞水平、組織水平、個(gè)體水平進(jìn)行不同層次的創(chuàng)造性設(shè)計(jì)和改造，使之能定向組建具有特定性狀的新物種或新品系，從而造福人類的現(xiàn)代應(yīng)用技術(shù)學(xué)科。2生物技術(shù)的四大體系基因工程細(xì)胞工程酶工程發(fā)酵工程3 重組DNA技術(shù)（recombinant DNA technique），又叫DNA克隆（DNA cloning）。在體外將各種來(lái)源的遺傳物質(zhì)同源的或異源的、真核的或原核的、天然的或人工合成的DNA與載體DNA結(jié)合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子（復(fù)制子），繼而通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增

2、，以獲得該DNA分子的大量拷貝。這類克隆是在分子水平上操作，故又稱分子克隆（molecular cloning）。一、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念（一）DNA克隆4 由于DNA克隆研究對(duì)象常常是特異的基因片段，所以又稱作基因克隆（gene cloning）。實(shí)現(xiàn)基因克隆所采用的方法及相關(guān)工作統(tǒng)稱為基因工程（genetic engineering）。51997年2月23日英國(guó) Wilmut6 從復(fù)雜的生物有機(jī)體基因組中，分離出目的基因片段。 用合適的酶切割目的基因和載體，產(chǎn)生匹配的末端 在體外，將目的基因片段連接到能自我復(fù)制的并且具有 選擇標(biāo)記的載體分子上，形成重組DNA分子。 將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到

3、適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞（亦稱宿主細(xì)胞）， 并與之一起增殖。 篩選出獲得了重組DNA分子的受體細(xì)胞克隆。從篩選出的陽(yáng)性克隆中提取出擴(kuò)增的目的基因片段，供進(jìn)一步研究使用。基因克隆的基本步驟7基因克隆的基本步驟8粘性末端質(zhì)粒目的基因粘性末端匹配的粘性末端9酶切后的目的基因片段接(連接)連接后的重組質(zhì)粒DNA分子10重組質(zhì)粒目的基因大腸桿菌轉(zhuǎn)(轉(zhuǎn)化)染色體真好玩!11篩(篩選)分解抗生素的酶含抗生素的培養(yǎng)基還活著!玩完啦!大腸桿菌大腸桿菌12大量生長(zhǎng)提取大量質(zhì)粒酶切鑒定13您已經(jīng)掌握基因克隆的主要步驟！分離目的基因和載體DNA。用合適的酶切割上述兩者，產(chǎn)生匹配的末端。連接酶將目的基因裝入載體。轉(zhuǎn)入細(xì)菌。篩選具

4、有抗藥性克隆。14（二）重組DNA中的工具酶 限制性核酸內(nèi)切酶 連接酶 聚合酶 多聚核苷酸激酶 堿性磷酸酶151. 限制性核酸內(nèi)切酶（restriction endonuclease）定義：能識(shí)別DNA的特異序列，并在識(shí)別位點(diǎn)或其周?chē)懈铍p鏈DNA的一類核酸內(nèi)切酶。 主要來(lái)源于原核生物，可將侵入宿主細(xì)胞的外源性DNA迅速降解，而對(duì)細(xì)菌自身的DNA，則通過(guò)甲基化酶在該限制酶切位點(diǎn)甲基化修飾而保護(hù)自身的DNA不被降解。限制性內(nèi)切酶和甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制和修飾系統(tǒng)。限制性內(nèi)切酶由于能限制外源DNA的“入侵”而得名。16限制酶的命名 限制酶的命名是根據(jù)含有該酶的微生物種屬而定。通常有三個(gè)斜體字母

5、的縮寫(xiě)表示。第一個(gè)大寫(xiě)字母取自細(xì)菌屬名的第一個(gè)字母；第二、三個(gè)小寫(xiě)字母取自微生物種名的頭兩個(gè)字母；第四個(gè)字母代表該微生物同種內(nèi)不同的株系；如果同一株名發(fā)現(xiàn)幾種限制酶，則根據(jù)其被發(fā)現(xiàn)和分離的先后順序，用羅馬數(shù)字表示。例如，從大腸桿菌（Escherichia Coli）RY13株中發(fā)現(xiàn)分離的第一種限制酶，稱為EcoR I。17限制性內(nèi)切酶的分類和特點(diǎn) 根據(jù)限制酶的組成、輔因子及切割DNA方式不同，可分為 I、II、III型。重組DNA技術(shù)中常用的是II型限制性內(nèi)切酶。II型酶作用特點(diǎn)是有嚴(yán)格的識(shí)別、切割順序，以內(nèi)切方式水解雙鏈DNA中的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生的DNA片段5 端為磷酸基，3 端為羥基。識(shí)別

6、順序一般為46個(gè)堿基，通常是回文結(jié)構(gòu)（palindrome）。18回文結(jié)構(gòu) II類限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別DNA 位點(diǎn)的核苷酸序列呈二元旋轉(zhuǎn)對(duì)稱，通常稱這種特殊的結(jié)構(gòu)順序?yàn)榛匚慕Y(jié)構(gòu)。 EcoR I 5 GAATT C3 3 C TTAAG5 19II型酶切割雙鏈DNA產(chǎn)生3種不同的切口： 在對(duì)稱軸中心同時(shí)切割雙鏈，產(chǎn)生平末端或稱鈍性末端（blunt end），如Hpa I：5 GTTAAC3 Hpa I 5 GTT AAC33 CAATTG5 3 CAA TTG 5 20 在對(duì)稱軸兩側(cè)相對(duì)位點(diǎn)分別切割一條鏈。從 5 端切割產(chǎn)生 5 端突出的粘性末端，如EcoRI ：5 GAATT C3 EcoR

7、I 5 G AATTC33 C TTAAG5 3 CTTAA G 5 從3 端切割產(chǎn)生3 端突出的粘性末端。如Pst I：5 C TGCAG3 Pst I 5 CTGCA G33 GACGT C5 3 G ACGTC 5 21表15-2一些常用的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)22 一些限制酶雖然識(shí)別序列不完全相同，但能產(chǎn)生相同類型的粘性末端，稱為同尾酶，所產(chǎn)生的末端稱配伍末端（compatible end），可進(jìn)行相互連接。產(chǎn)生平末端的酶切割DNA后，也可彼此連接。23 連接酶可催化DNA分子中相鄰5 磷酸和3 羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接。常用的有T4（噬菌體）

8、DNA連接酶和E.Coli DNA連接酶。2. DNA連接酶3. 聚合酶 重組DNA技術(shù)中，聚合酶（polymerase）的最重要作用是以DNA或RNA為模板在體外合成DNA或RNA。可分為DNA聚合酶和RNA聚合酶兩大類。24 名稱 功能及應(yīng)用大腸桿菌DNA聚合酶I 以DNA為模板，催化5 3 核酸鏈的延長(zhǎng)，另有3 5 的外切酶 大片段 （klenow） 活性。常用于DNA 3 末端的標(biāo)記和填充、cDNA第二鏈的合成、 DNA測(cè)序。Taq DNA聚合酶 以DNA為模板，催化5 3核酸鏈的延長(zhǎng)，另有弱的5 3的外切 酶活性，耐高溫。常用于PCR及DNA測(cè)序。末端轉(zhuǎn)移酶 催化NTP中的NMP通過(guò)

9、其磷酸基與DNA 3 -OH連接而使DNA鏈 延長(zhǎng)，無(wú)需模板。常用于3 端標(biāo)記或形成DNA共聚尾巴。逆轉(zhuǎn)錄酶 以RNA為模板，合成cDNA鏈（5 3），另有RNA酶H活性。常 用于cDNA第一、二鏈的合成及反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）。RNA聚合酶 以DNA為模板合成RNA。常用于離體條件下，合成單鏈RNA作為 雜交探針。25 T4多核苷酸激酶（polynucleotide kinase）催化ATP的-磷酸基轉(zhuǎn)移至DNA或RNA的5 末端羥基上。常用于單鏈或雙鏈DNA和RNA探針的5 端標(biāo)記。4. 多聚核苷酸激酶5. 堿性磷酸酶 牛小腸堿性磷酸酶（calf intestinal alkalin

10、e phosphatase, CIP），催化DNA或RNA的5 磷酸基水解。常用于去除線狀載體DNA兩端的5 磷酸基團(tuán)，防止載體自身連接環(huán)化；也用于用32P標(biāo)記DNA的5 末端之前除去原來(lái)的5 磷酸基。26 應(yīng)用重組DNA技術(shù)有時(shí)是為分離、獲得某一感興趣的基因或DNA片段，或是獲得感興趣的表達(dá)產(chǎn)物 蛋白質(zhì)。這些感興趣的基因或DNA序列就是目的基因。目的基因有兩種類型，即cDNA和基因組DNA。（三）目的基因（target gene）27（四） 基因工程載體基因載體：或稱克隆載體（cloning vector）,是在基因工程中為“攜帶”感興趣的外源DNA（目的基因、外源基因）、實(shí)現(xiàn)外源DNA的無(wú)

11、性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子，具有自我復(fù)制和表達(dá)功能。其中，為使插入的外源DNA 序列可轉(zhuǎn)錄、進(jìn)而翻譯成多肽鏈而特異設(shè)計(jì)的克隆載體又稱表達(dá)載體。 28 能自主復(fù)制并能帶動(dòng)插入的目的基因一起復(fù)制。 具有一個(gè)以上的單一限制性酶切位點(diǎn)（多克隆位點(diǎn)，multiple cloning sites），以便目的基因的 插入。 具有合適的篩選標(biāo)記（如抗藥性基因，酶基因等），以 便篩選陽(yáng)性克隆。 載體分子量小，以便容納較大目的基因，拷貝數(shù)高。 在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性高，以便確保重組體穩(wěn)定傳代而不易丟失。理想載體應(yīng)具備的基本條件29載體的分類 質(zhì)粒（plasmid） 噬菌體（phage） 病毒（vir

12、us） 克隆載體（cloning vector） 表達(dá)載體（expression vector）常用的載體按來(lái)源分為載體按得到的產(chǎn)物分類可分為30質(zhì)粒（plasmid） 質(zhì)粒是存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子，能在宿主細(xì)胞獨(dú)立自主地進(jìn)行復(fù)制，并在細(xì)胞分裂時(shí)保持恒定地傳給子代細(xì)胞。質(zhì)粒帶有某些遺傳信息，會(huì)賦予宿主細(xì)胞新的遺傳性狀。因?yàn)橘|(zhì)粒DNA有自我復(fù)制功能及攜帶遺傳信息等特性，可作為重組 DNA操作的載體。染色體質(zhì)粒31 pBR322 質(zhì)粒圖譜氨芐青霉素抗性基因四環(huán)素抗性基因多克隆位點(diǎn)32噬菌體載體 噬菌體是一種細(xì)菌病毒，可作為克隆載體。目前使用的噬菌體載體主要有噬菌體衍生物載體、M

13、13噬菌體載體等。除M13噬菌體載體外，這類載體的特點(diǎn)是其容量比質(zhì)粒載體大，即可插入較大的外源DNA片段（如20kb以上）。可以在體外包裝產(chǎn)生感染性很高的噬菌體顆粒。33噬 菌 體頭部尾部尾絲34 噬菌體 噬菌體（lambdla bacteriophage）是一種大腸桿菌病毒，為線性雙鏈DNA，它的兩端各有12個(gè)堿基的互補(bǔ)粘性末端，稱COS位點(diǎn)。當(dāng)噬菌體侵入宿主細(xì)胞，兩個(gè)粘性末端互補(bǔ)結(jié)合，形成環(huán)狀分子。DNA在體外可包裝成病毒顆粒，并高效感染大腸桿菌。35 噬菌體侵入細(xì)菌后，即可裂解生長(zhǎng)（環(huán)狀DNA在細(xì)菌中多次復(fù)制，合成大量噬菌體基因產(chǎn)物，裝配成噬菌體顆粒，裂解宿主菌），又可以溶源生長(zhǎng)（噬菌體

14、DNA整合到細(xì)胞染色體基因組DNA中，與染色體DNA一起復(fù)制，并遺傳給子代細(xì)胞，宿主細(xì)胞不被裂解）。36噬菌體感染細(xì)菌示意圖裂解生長(zhǎng)37 噬菌體基因組中有較大區(qū)域僅與溶源生長(zhǎng)有關(guān)，而對(duì)裂解生長(zhǎng)并非絕對(duì)需要，因此可以缺失或被外源DNA取代。經(jīng)改造的噬菌體衍生載體可分兩類: 一類是插入型載體，即外源基因插入到載體上單一的限制酶位點(diǎn)，如gt系列等。 另一類是置換型，即兩個(gè)限制酶位點(diǎn)之間的DNA片段可被外源DNA取代，如Charon，EMBL系列等。3839 M13噬菌體載體 M13噬菌體基因組是單鏈環(huán)狀DNA，當(dāng)它侵犯宿主菌后，在細(xì)菌胞內(nèi)酶的作用下，單鏈DNA轉(zhuǎn)變成復(fù)制型雙鏈DNA，可提取出來(lái)做基因

15、重組。 經(jīng)改造的M13噬菌體有M13 mp系列和pUC系列。40 M13噬菌體載體pUC19互補(bǔ)：?jiǎn)为?dú)存在的及 片段都沒(méi)有半乳糖苷酶的活性，只有宿主細(xì)胞與克隆載體同時(shí)表達(dá)兩個(gè)片段時(shí)，宿主細(xì)胞內(nèi)才有 半乳糖苷酶活性，使特異性作用物（X-gal）變?yōu)樗{(lán)色化合物。突變型lac- E.coli表達(dá)-半乳糖苷酶的 片段。如果插入的外源基因是在lacZ基因內(nèi)，就會(huì)影響lacZ的表達(dá)，利用lac- E.coli為轉(zhuǎn)染或感染細(xì)胞，在含X-gal的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色菌落；若無(wú)外源基因插入，則出現(xiàn)藍(lán)色菌落。多克隆位點(diǎn)編碼-半乳糖苷酶的片段41病毒載體 是一類真核載體，能把基因引入到 真核細(xì)胞中，并在其中被表

16、達(dá)。因此是研究真核細(xì)胞表達(dá)及調(diào)控的有力工具。如:腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乳頭瘤病毒等。42二、重組DNA技術(shù)基本原理 目的基因的獲取 克隆載體的選擇和構(gòu)建 外源基因與載體的連接 重組DNA導(dǎo)入受體菌 重組體的篩選 克隆基因的表達(dá)43（一）目的基因的獲取 化學(xué)合成法 基因組DNA cDNA 聚合酶鏈反應(yīng)441. 化學(xué)合成法 已知某種基因的核苷酸序列，或根據(jù)某種基因產(chǎn)物的氨基酸序列推導(dǎo)出編碼該多肽鏈的核苷酸序列，再利用DNA合成儀通過(guò)化學(xué)合成原理合成目的基因。 利用該法合成的基因有：人生長(zhǎng)激素釋放抑制因子、 胰島素原、 腦啡肽、干擾素基因等452. 基因組DNA 利用限制性核酸內(nèi)切酶將染色體DNA切割

17、成一定基因水平的許多片段，將這些片段與適當(dāng)?shù)目寺≥d體拼接成重組DNA分子，繼而轉(zhuǎn)入受體菌擴(kuò)增，使每個(gè)細(xì)菌內(nèi)都攜帶一種重組DNA分子的多個(gè)拷貝。 不同細(xì)菌所包含的重組DNA分子可能為不同的染色體DNA片段，這樣全部轉(zhuǎn)化細(xì)菌所攜帶的各種染色體片段就代表了染色體的整個(gè)基因組。存在于轉(zhuǎn)化細(xì)菌內(nèi)、由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA片段的集合稱為基因組DNA文庫(kù)（genomic DNA library）。基因組DNA文庫(kù)涵蓋了基因組全部的遺傳信息。46 建立基因組文庫(kù)后，需結(jié)合適當(dāng)篩選方法從眾多轉(zhuǎn)化子菌落中選出含有某一基因的菌落，再進(jìn)行擴(kuò)增，將重組DNA分離、回收，以獲得目的基因。473. cDNA 把細(xì)

18、胞總mRNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄合成總cDNA，再與適當(dāng)載體連接后轉(zhuǎn)入受體菌，從而得到含有某種生物體全部cDNA集合（稱為cDNA 文庫(kù)，cDNA library）。然后用適當(dāng)?shù)姆椒◤腸DNA文庫(kù)中篩選出目的cDNA。48 cDNA文庫(kù)的特點(diǎn)是它只包括已經(jīng)被轉(zhuǎn)錄成mRNA的那些基因序列，且不包括內(nèi)含子及調(diào)控序列，所以cDNA文庫(kù)的復(fù)雜性要比基因組文庫(kù)低的多。 但由于不同的細(xì)胞類型、發(fā)育階段以及細(xì)胞所處的特定狀態(tài)是由特定基因的表達(dá)所決定的，因此各自的mRNA種類就不同，由此產(chǎn)生的cDNA又是獨(dú)特的。與基因組DNA文庫(kù)類似，由總mRNA制作的cDNA文庫(kù)包含了細(xì)胞表達(dá)的各種mRNA信息，自然也含有我們感興趣

19、的編碼cDNA。494. 聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR） 參見(jiàn)437頁(yè)50Chain ReactionPolymerase chain reactionPCR的產(chǎn)物數(shù)目以指數(shù)級(jí)方式增長(zhǎng)中子的釋放數(shù)目以指數(shù)級(jí)方式增長(zhǎng)中子原子核短時(shí)間內(nèi)巨大的能量釋放，原子爆炸DNA片段Cycle 1Cycle 2Cycle 3Cycle N理論上可達(dá)2n個(gè)拷貝原料（pg） 產(chǎn)物(ug)51PCR 的基本原理體外高效、快速、特異地?cái)U(kuò)增目的基因或DNA片段的技術(shù)。其原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制，只是在試管中給DNA的體外合成提供一種合適條件模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合

20、酶，合適的緩沖液系統(tǒng)和DNA變性、復(fù)性及延伸的溫度與時(shí)間等，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增 52DNA的體內(nèi)復(fù)制：原料：模板DNA（基因組DNA），隨機(jī)小分子RNA引物，dNTPs酶：DNA聚合酶，解旋酶，引發(fā)酶反應(yīng)條件：胞液環(huán)境，37 反應(yīng)過(guò)程：模板DNA解旋、引發(fā)體的形成、延長(zhǎng)（三階段）產(chǎn)物：模板DNA （基因組DNA）拷貝數(shù)增加一倍 原料：模板DNA（基因組DNA ，cDNA）一對(duì)特異性寡核苷酸引物，dNTPs酶：Taq DNA聚合酶反應(yīng)條件：合適的緩沖液，三種變化的溫度（94，50-70，72 ），一定的循環(huán)數(shù)（25-35）反應(yīng)過(guò)程：DNA模板變性（解鏈）、 模板與引物退火 、引物延伸 （三

21、階段，多循環(huán)）產(chǎn)物：目的DNA（特異性）拷貝數(shù)增加2n倍PCR：53DNA模板變性與體內(nèi)DNA解鏈過(guò)程不同，PCR中作為模板的雙鏈DNA是通過(guò)95左右的高溫使其發(fā)生變性，形成單鏈DNA 54模板與引物退火 PCR通常需要兩條寡核苷酸鏈作為DNA合成時(shí)的引物（primer）,這兩個(gè)引物分別與待擴(kuò)增模板DNA的目標(biāo)片段兩端的序列互補(bǔ)。在降低溫度的過(guò)程中，通過(guò)控制退火條件，引物就能準(zhǔn)確地與擴(kuò)增區(qū)域的兩端配對(duì)。primers55引物短，不易纏繞；設(shè)計(jì)的引物是與模板DNA兩端序列互補(bǔ)；引物的量遠(yuǎn)大于模板分子的量，引物與模板DNA形成雙鏈的幾率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于DNA分子自身的復(fù)性。 56引物延伸在PCR反應(yīng)體系中

22、的DNA聚合酶，能夠催化反應(yīng)體系中游離的單核苷酸（dNTPs）由引物53方向，按堿基配對(duì)的原則延伸，形成兩條與模板DNA互補(bǔ)的復(fù)制鏈。Taq 酶dNTPS 新合成的鏈又可作為下輪循環(huán)反應(yīng)的模板。 57 熱變性-復(fù)性-延伸的過(guò)程就是一個(gè)PCR循環(huán) 每一循環(huán)后的模板均比前一循環(huán)增加1倍。理論上講，擴(kuò)增DNA產(chǎn)量是呈指數(shù)上升的，即n個(gè)循環(huán)后，產(chǎn)量為2n拷貝。而實(shí)際上，PCR的擴(kuò)增倍數(shù)為（1+X）n，X為擴(kuò)增效率，平均為75% 熱變性-復(fù)性-延伸25-35 次循環(huán)百萬(wàn)倍擴(kuò)增58盡管PCR擴(kuò)增DNA非常有效，但目的DNA序列的指數(shù)擴(kuò)增并不是一個(gè)無(wú)限制的過(guò)程。在正常的反應(yīng)條件下，經(jīng)30次循環(huán)之后，酶的催化

23、反應(yīng)趨于飽和，就會(huì)出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng) (Plateau) ，產(chǎn)物的量不再增加。“平臺(tái)效應(yīng)”出現(xiàn)的遲早還取決于酶的性能、模板DNA的拷貝數(shù)、dNTP濃度等多種因素。 59（三）外源基因與載體的連接（二）克隆載體的選擇 粘性末端連接 平端連接 同聚物加尾連接 人工接頭連接601. 粘性末端連接 外源DNA片段與載體用同一種限制性內(nèi)切酶切割，獲得相同的粘性末端，相互互補(bǔ)配對(duì)，在DNA連接酶作用下，形成重組DNA分子。5CCG G3 5C CGG33G GCC5 3G GC C 5Hpa II612. 平端連接 因載體分子和目的DNA分子之間并不一定都產(chǎn)生互補(bǔ)的粘性末端，有的限制性內(nèi)切酶只能切成平末端。平末

24、端仍用T4DNA連接酶連接，只是效率低，需要的DNA濃度更高。623. 同聚物加尾連接 同聚物加尾連接是利用同聚物序列，如polyG與poly C之間的退火作用完成連接。 在末端轉(zhuǎn)移酶作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列，如將poly（dC）加到雙鏈DNA片段3 羥基上，而將poly（dG）加到質(zhì)粒載體3 羥基上，制造出粘性末端，然后進(jìn)行粘性末端連接。634. 人工接頭連接 接頭（linker）是指人工合成的一段雙鏈寡核苷酸，其中包含一個(gè)（或兩個(gè)）酶切位點(diǎn)。首先將接頭與目的DNA片段進(jìn)行平末端連接，繼而用適當(dāng)?shù)膬?nèi)切酶將接頭部位切出粘性末端，最后與載體進(jìn)行粘性末端連接。64（四）重組體導(dǎo)入受體

25、細(xì)胞 在分子克隆中，將質(zhì)粒或以它為載體構(gòu)建的重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的過(guò)程稱為轉(zhuǎn)化（transformation）。 以噬菌體和真核病毒作載體構(gòu)建的重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的過(guò)程稱為轉(zhuǎn)染（transfection）。 基因片段（特別是純化的DNA）很難直接導(dǎo)入受體細(xì)胞，通常將受體細(xì)胞預(yù)先加以處理，使其提高基因?qū)爰?xì)胞的效率。例如用低溫CaCl2（冰浴）處理大腸桿菌，可以大大提高質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率。這種經(jīng)過(guò)預(yù)處理的、容易導(dǎo)入外源核酸分子的受體細(xì)胞被稱作“感受態(tài)細(xì)胞”（competent cell）。65（五）重組體的篩選 通過(guò)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染等方式，重組體DNA分子被導(dǎo)入受體細(xì)胞，經(jīng)適當(dāng)涂布的培養(yǎng)基培養(yǎng)得到大量轉(zhuǎn)

26、化子菌落或轉(zhuǎn)染噬菌斑。因?yàn)槊恳恢亟M體只攜帶某一段外源基因，而轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染時(shí)每一受體菌又只能接受一個(gè)重組體分子，所以設(shè)法將眾多的轉(zhuǎn)化菌落或噬菌斑區(qū)分開(kāi)來(lái)，并鑒定哪一菌落或噬菌斑所含的重組DNA分子確實(shí)帶有目的基因，即可得到目的基因的克隆，這一過(guò)程即為篩選（screening）。66 根據(jù)載體體系、宿主細(xì)胞特性及外源基因在受體細(xì)胞表達(dá)情況不同，可采取不同的篩選方法。1.直接篩選法 （1）抗藥性標(biāo)志篩選 （2）標(biāo)志補(bǔ)救 （3）分子雜交法2.非直接篩選法 免疫學(xué)方法67抗藥性標(biāo)志篩選 如果克隆載體攜帶有某種抗藥性標(biāo)志基因，如Ampr或Tetr，轉(zhuǎn)化后只有含這種抗藥基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)菌才能在含該抗生素的培養(yǎng)板

27、上生存并形成菌落，這樣就可將轉(zhuǎn)化菌與非轉(zhuǎn)化菌區(qū)別開(kāi)來(lái)。 如果重組DNA時(shí)將外源基因插入標(biāo)志基因內(nèi)，如插入Tetr內(nèi)，使標(biāo)志基因Tetr失活，陽(yáng)性重組子則不能在含有Tet的培養(yǎng)板上生長(zhǎng)。用插入失活篩選的重組子載體往往帶有另一個(gè)抗生素抗性基因如Ampr，因此可以通過(guò)雙抗生素對(duì)照篩選，即陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子可以在含Amp的培養(yǎng)板上生長(zhǎng)而不能在含Tet的培養(yǎng)板上生長(zhǎng)。68標(biāo)志補(bǔ)救 若克隆的基因能夠在宿主菌內(nèi)表達(dá)，且表達(dá)產(chǎn)物與宿主菌的營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)，則可以利用營(yíng)養(yǎng)突變菌株進(jìn)行篩選，這就是標(biāo)志補(bǔ)救（marker rescue）。-互補(bǔ)：通過(guò)藍(lán)白斑篩選可以篩選、鑒定重組體與非重組體載體。69當(dāng)外源基因插入后，LacZ基

28、因被破壞，不能合成完整的-半乳糖苷酶，因此不能分解底物X-gal，菌落成白色-半乳糖苷酶能分解X-gal，形成藍(lán)色菌落。70分子雜交法（molecular hybridization）參見(jiàn)435頁(yè)71核酸分子雜交（molecular hybridization）：指用標(biāo)記的已知DNA或RNA片段（探針）檢測(cè)樣品中未知核酸序列，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則發(fā)生同源性結(jié)合，再經(jīng)顯影或顯色的方法，將結(jié)合的核酸序列的位置或大小顯示出來(lái)。探針：帶有可檢測(cè)標(biāo)記的已知序列的DNA或RNA片段。核酸分子雜交的基本原理變性（denaturation）復(fù)性（renaturation） 雜交（hybridization）

29、預(yù)雜交（prehybridization）72變性（denaturation）概念：在某些理化因素的作用下，核酸雙鏈分子堿基對(duì)的氫鍵斷裂，疏水作用被破壞，雙股螺旋或發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開(kāi)，有規(guī)則的結(jié)構(gòu)被破壞，形成單鏈分子。變性的因素：加熱、酸、堿、尿素、甲酰胺等增色效應(yīng)（hyperchronic effect）：核酸變性時(shí)，紫外吸收值A(chǔ)260隨之升高的現(xiàn)象。73熱變性 DNA的熔解曲線Tm值（melting temperature）:熱變性時(shí)，50%DNA分子變性的溫度。又叫解鏈溫度、熔解溫度。74復(fù)性（renaturation） 概念：在適當(dāng)條件下，變性DNA的兩條互補(bǔ)單鏈重新締合，形成雙鏈的過(guò)程。

30、熱變性后，緩慢降低溫度至比Tm值低20-30時(shí)，變性的單鏈DNA可恢復(fù)其雙鏈結(jié)構(gòu)，稱為退火。雜交（hybridization） 來(lái)源不同的兩條單鏈核酸分子通過(guò)堿基互補(bǔ)可形成異源雙螺旋。如DNA/DNA、DNA/RNA、RNA/RNA雜交分子。75預(yù)雜交（prehybridization） 概念：為了減少探針與廣泛存在的非互補(bǔ)核酸的非特異性結(jié)合，在雜交前用封閉物將這些非特異性位點(diǎn)封閉。這一雜交前的處理過(guò)程稱為預(yù)雜交。 常用的封閉物：變性的非特異性DNA，如鮭魚(yú)精子DNA、小牛胸腺DNA，又稱為覆蓋DNA。76變性、復(fù)性、雜交示意圖77核酸探針：帶有可檢測(cè)標(biāo)記的已知DNA或RNA片段，用于檢測(cè)待測(cè)

31、樣品中的靶核酸序列。探針?lè)诸惙派湫詷?biāo)記核酸探針?lè)欠派湫詷?biāo)記核酸探針78印跡雜交 概念：指將待測(cè)核酸序列結(jié)合到一定的支持物上，然后與存在于液相中的核酸探針進(jìn)行雜交的過(guò)程。 探針與待測(cè)核酸片段中的同源序列形成雜交分子，探針?lè)肿语@示的位置及其量的多少可反應(yīng)出待測(cè)的核酸分子是否存在相應(yīng)的基因序列及其大小。 分類DNA印跡雜交（Southern blotting）RNA印跡雜交（Northern blotting）79提取DNA限制性內(nèi)切酶消化瓊脂糖凝膠電泳堿變性轉(zhuǎn)移到NC膜與DNA或RNA探針雜交放射自顯影DNA印跡雜交（Southern blotting）檢測(cè)靶分子為DNA, 檢測(cè)靶分子是否含有目的

32、基因80將瓊脂糖凝膠上的DNA分子轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上81 菌落原位雜交（In situ hybridization）含有與探針互補(bǔ)序列的菌落或噬菌斑經(jīng)放射自顯影后，在X光底片上出現(xiàn)雜交點(diǎn)。將轉(zhuǎn)化后得到的菌落或噬菌斑原位轉(zhuǎn)移到NC膜上，得到一個(gè)與平板菌落或噬菌斑分布完全一致的復(fù)制品。原位裂解細(xì)胞，堿變性，核酸分子被固定于膜上加入標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行雜交根據(jù)陽(yáng)性反應(yīng)位置，可從保留的母板上挑出所需的陽(yáng)性克隆。82RNA印跡雜交（Northern blotting） 檢測(cè)靶分子為RNA。主要用于檢測(cè)某一組織或細(xì)胞中已知的特異mRNA的表達(dá)水平，或比較不同組織或細(xì)胞的同一基因的表達(dá)情況。 與S

33、outhern blotting不同的是在轉(zhuǎn)移前不需進(jìn)行限制性內(nèi)切酶切割。 83核酸雜交分類表雜交方法適 用 范 圍Southern 印跡檢測(cè)經(jīng)凝膠電泳分開(kāi)的DNA分子，需轉(zhuǎn)印到膜上Northern 印跡檢測(cè)經(jīng)凝膠電泳分開(kāi)的RNA分子，需轉(zhuǎn)印到膜上斑點(diǎn)雜交檢測(cè)未經(jīng)分離的、固定在膜上的DNA或RNA分子菌落或噬菌斑雜交檢測(cè)固定在膜上的、經(jīng)裂解后從細(xì)菌或噬菌體中釋放出的DNA分子原位雜交檢測(cè)細(xì)胞或組織中的DNA或RNA分子84免疫學(xué)方法 免疫學(xué)篩選是利用特異抗體與目的基因表達(dá)的抗原產(chǎn)物相互作用進(jìn)行篩選，特異性和敏感性也較高，尤其適用于篩選不為宿主菌提供任何選擇標(biāo)記的基因，或者是已獲得了該基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的多克隆或單克隆抗體，用這些抗體來(lái)檢測(cè)目的基因表達(dá)的產(chǎn)物。免疫學(xué)方法很多，如We