1、2010年版藥典附錄無菌檢查和微生 物限度檢查方法增修定內容 泰州藥品檢驗所 季大偉 起草的指導思想一、以科學發展觀為統領，服務于資源節約型社會、環境友好型社會的要求；落實科學監管理念，著力解決發展中的問題。二、與時俱進，廣泛吸納先進技術與成果；堅持自主與創新；積極推進藥品標準化戰略，提高我國藥品標準總體水平，著力提升中國藥典在國際社會中的地位和作用，提高綜合競爭力，促進醫藥產業的健康發展，為構建社會主義和諧社會作出貢獻。2010版藥典無菌檢查法主要增修訂內容國內外藥典微生物學檢驗 發展的宗旨： 提高方法撿出率、保證檢驗結果的準確性、可靠性。 1、 實驗環境、設施的發展； 2、 培養基的品種和

2、適用性要求； 3、 檢驗數量、檢驗量符合統計學要求； 4、 檢驗方法和儀器的改進 （薄膜過濾法、全封閉過濾培養器） 5、 驗證試驗；（ICH、USP、EP、BP、JP均有規定） 6、 培養時間； 7、 結果 的分析和判斷等。 回顧國際無菌檢查法發展歷史 1925年 直接接種法首先使用在英國1932年 英國藥典推薦使用無菌測試1936年 美國藥典第十一章首先引用單個培養基的直接接種法1950年 美國藥典第十六章推薦使用FTG和SB兩種培養基分別 培養需、厭氣 菌和真菌1957年 美國FDA和MILLIPORE公司介紹膜過濾法用于抗生素無菌測試1963年 英國藥典63版收載薄膜過濾法無菌測試196

3、5年 美國藥典引用薄膜過濾法用于非抑菌性藥品的無菌測試1971年 歐洲藥典第二版公布參照薄膜過濾法無菌測試1978年 歐洲藥典修訂版發行公布推薦使用薄膜過濾法無菌測試1988年 美國FDA規定：假如第一次無菌檢查不符合規定的樣品不再復試，這 一批次的藥品應報廢。實際上排除了藥品無菌陽性后再測試的機會1998年 英國藥典1998無菌測試以一次檢出為準，取消復試。2000年 美國藥典24版無菌測試以一次檢出為準，取消復試。 檢視我國歷版藥典無菌檢查法發展歷史 1953版 實驗環境僅要求為半無菌操作箱；僅收載一種直接接種法； 用一種培養基檢查1963版 僅一種直接接種法；用三種培養基分別培養細菌和霉

4、菌1977版 開始收載薄膜過濾法（簡單裝置），用二種培養基分別培 養細菌和霉菌1985版 收載薄膜過濾法限于抗生素樣品；用需、厭氣菌培養基及 霉菌培養基；要求實驗環境為紫外線滅菌的無菌室。1990版 與85年版相同1995版 開始要求對培養基進行靈敏度檢查。2000版 規定實驗環境為100級潔凈度；檢驗數量從2支/瓶增加為 611支/瓶；明確薄膜過濾法為首選方法包括大容量液體樣品 首次引用、收載全封閉過濾技術。 對比國際無菌檢查發展歷史 ， 我國2000版以前藥典無菌檢查法因技術和認識的不足，對提高方法撿出率、保證檢驗結果的準確性、可靠性方面的規定與先進國家藥典中的要求嚴重脫節。2005版無菌

5、檢查法取得長足發展 實驗環境要求 、驗證試驗、 延長培養時間至少為14天、以一次檢出為準，取消復試等亮點。 是2005年版藥典無菌檢查法的大步發展，從而使2005年版無菌檢查法比歷版無菌檢查法有了突破性的提高。基本與國際先進藥典無菌檢查法接軌。 2010年版藥典無菌檢查法的發展，主要是在總結和鞏固實施驗證試驗以來所取得經驗及認識的基礎上，作兩方面的發展： 一、附錄無菌檢查法（一部附錄 B） （二部附錄 H） （三部附錄 A） 圍繞著保證實驗結果的準確性、可靠性作進一步的增、修訂。 二、品種各論中【無菌】各論化的發展一、附錄無菌檢查法中的增、修訂 （一）總則部分 （二）培養基部分 （三）靈敏度檢

6、查部分 （四）稀釋液、沖洗液部分 （五）方法驗證部分 （六）薄膜過濾法部分 （七）培養及觀察部分 （八） 結果判斷部分 （九） 表1、表2和表3 （一）總則部分 新增規定1、“ 防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。”2、“ 日常檢驗還需要對環境進行監控。”3、“ 無菌檢查人員必須具備微生物專業知識，并經過無菌技術的培訓。 （二）培養基部分1、刪除： 硫乙醇酸鹽流體培養基 后括號（用于培養好氧菌、厭氧菌）的說明2、刪除： 改良馬丁培養基 后括號（用于培養真菌）的說明3、刪除： 選擇性培養基項下加入適量中和劑或表面活性劑 “ 如對氨基苯甲酸（用于磺胺類供試品）、聚山梨酯80（用于非水溶性供

7、試品）或-內酰胺酶（用于-內酰胺類供試品）”等說明。 修訂為： 在培養基滅菌或使用前加入適宜的中和劑、滅活劑或表面活性劑，其用量同驗證試驗。 增訂：表1 常見干擾物的中和劑或滅活方法 (見微生物限度檢查法中）干擾物可選用的中和劑或滅活方法 戊二醛酚類、乙醇、吸附物醛類季銨類化合物（QACs）、對羥基苯甲酸酯汞類制劑雙胍類化合物碘酒、洗必泰類鹵化物乙二胺四乙酸（EDTA）磺胺類-內酰胺類抗生素亞硫酸氫納稀釋法稀釋法、甘氨酸、硫代硫酸鹽卵磷脂、聚山梨酯亞硫酸氫納、巰基乙酸鹽、硫代硫酸鹽卵磷脂聚山梨酯硫代硫酸鹽鎂或鈣離子對氨基苯甲酸-內酰胺酶表1 常見干擾物的中和劑或滅活方法 4、將原排列第 6.的

8、 0.5%葡萄糖肉湯培養基（用于硫酸鏈霉素等抗生素的無菌檢查） 修訂排列為第 4. 按順序歸類培養基1.4. 均為直接用于無菌檢查的液體培養基。 （三）培養基靈敏度檢查部分1、在菌液制備中，修訂黑曲霉的孢子懸液制備方法：規定應使用含0.05（v/v）聚山梨酯80的0.9無菌氯化鈉溶液，洗脫孢子及稀釋孢子液，制成每1ml中含孢子數小于100 cfu的孢子懸液。 刪除了：（用管口帶有薄的無菌棉花或紗布能過濾菌絲的無菌毛細吸管） 吸出孢子懸液的操作方法2、新增加稀釋后的工作用菌液的保存條件和保存期限： 菌液制備后“若在室溫下放置，應在2小時內使用，若保存在28，可在24小時內使用。黑曲霉孢子懸液可保

9、存在28，在驗證過的貯存期內使用。” （四） 稀釋液、沖洗液及其制備方法部分 原有 1. 0.1%蛋白胨水溶液 2. pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液新增加： 可根據供試品的特性，選用其他經驗證過的適宜的溶液作為稀釋液、沖洗液。（五）方法驗證試驗部分1、驗證試驗用菌種及菌液制備在培養基靈敏度所用菌種的基礎上，刪除銅綠假單胞菌，增訂大腸埃希菌。 是因在驗證試驗的實踐中，發現作為革蘭氏陰性桿菌代表的銅綠假單胞菌在驗證試驗中對大部分抗生素不敏感，而大腸埃希菌對抗革蘭氏陰性桿菌為主的抗生素敏感性較好。2、驗證試驗中樣品用量的規定：刪除了原：“ 將規定量供試品按 ”修訂為 薄膜過濾法： “ 取每種培養基規

10、定接種的供試品總量按 薄膜過濾法過濾” 直接接種法： “接入每支培養基規定的供試品接種量” 明確了驗證試驗所需樣品量是供試品的檢驗量而不是供試品的檢驗數量。（六）供試品的無菌檢查部分1、陽性對照用量的修訂： 原：“若采用直接接種法，應增加供試品1支（或瓶）作陽性對照用。”修訂為 ：若采用直接接種法，應增加供試品無菌檢查時每個培養基容器接種的樣品量作陽性對照用。因若是液體制劑，應該采用薄膜過濾法，若是固體制劑每管接種量可能不止1支（或瓶），應按驗證的方法確定。2、薄膜過濾法中的增、修訂：2.1 新增規定：抗生素供試品應選擇低吸附的濾器及濾膜2.2 新增規定：對每片濾膜的總沖洗量不得過1000ml

11、2.3 新增規定：所用沖洗量、沖洗方法同驗證試驗 2.4 修訂：無菌氣（噴）霧劑供試品的檢驗方法： 規定置至少-20冰室冷凍1小時。并新增開啟容器后 “將供試品轉移至無菌容器中”的操作步驟。2.5 修訂：裝有藥物的注射器供試品的檢驗方法：刪除 原 “裝上無菌針頭（非包裝中所配帶的）” 修訂為 “取規定量，排出注射器中的內容物，若需要可吸入稀釋液或標簽所示的溶劑溶解，直接過濾，” 沒有必要將原裝配好的針頭取下來 3、 直接接種法中的增、修訂：刪除了原直接接種法中-內酰胺類或黃胺類供試品項 。因該兩類供試品的無菌檢查以采用薄膜過濾法加中和劑更好。4、 培養及觀察中的增、修訂： 對于培養14天后，不

12、能從外觀上判斷有無微生物生長時，刪除了：“或劃線接種于斜面培養基上” 的規定。必然刪除：可根據斜面是否有菌生長而判斷的規定。（七）結果判斷部分新增訂：陽性對照管應生長良好，陰性對照管不得有菌生長。否則，試驗無效。強調陽性對照、陰性對照在無菌檢查實驗成立與否中的作用。 （八） 表1、表2和表3部分 表1將表1第3列的表題原 “每種培養基最少檢驗數量” 修訂為：“接種每種培養基所需的最少檢驗數量” 更明確指出接種到培養基中去的檢驗量。修訂了表1下的 注: 對供試品容器裝量不夠接種兩種培養基的情況，明確規定最少檢驗數量應加倍。 表2將表2原名稱：“上市抽驗樣品（液體制劑）的最少檢驗數量” 修訂為：“

13、 液體制劑最少檢驗量及上市抽驗樣品的最少檢驗數量”明確液體制劑最少檢驗量見表2的第2列，供試品最少檢驗數量見表2的第3列。 修訂了表2下的 注: 對供試品容器裝量不夠接種兩種培養基的情況，明確規定最少檢驗數量應加倍。表3 將表3原名稱：“上市抽驗樣品（固體制劑）的最少檢驗量” 修訂為：“ 固體制劑最少檢驗量及上市抽驗樣品的最少檢驗數量” 明確固體制劑最少檢驗量見表3第2列；供試品最少檢驗數量見表3的第3列。修訂了表3下的 注: 對供試品容器裝量不夠接種兩種培養基的情況，明確規定最少檢驗數量應加倍。二、各論中【無菌】各論化的發展 舉例如下：乙酰谷酰胺注射液、丁溴東莨菪堿注射液 無菌：取本品，經薄

14、膜過濾法處理，用0.1無菌蛋白胨水溶液分次沖洗（每膜不少于100ml），以金黃色葡萄球菌為陽性對照菌，依法檢查（附錄H），應符合規定。舉例如下：頭孢曲松鈉、頭孢拉定、頭孢哌酮鈉、頭孢硫脒、注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀、鹽酸林可霉素注射液 無菌：取本品，用適宜溶劑溶解后轉移至不少于500ml的0.9%無菌氯化鈉溶液中，用薄膜過濾法處理后，依法檢查（附錄H），應符合規定。氧氟沙星氯化鈉注射液 無菌：取本品，經薄膜過濾法處理，用0.1無菌蛋白胨水溶液分次沖洗（每膜不少于500ml）每管培養基中加入0.1mol/L硫酸錳溶液1ml,以大腸埃希菌為陽性對照菌，依法檢查（附錄H），應符合規定。 微生物限度檢

15、查增修定內容 修改內容 1、培養條件 控制菌培養溫度3537修改為3035(細菌、控制菌培養溫度相同)。 修改理由 此溫度適于所有中溫菌生長，一些高溫菌在該溫度下也可以生長。 增修訂內容 2、結果報告 特殊品種可以最小包裝單位報告 特殊品種包括 藥典規定微量包裝藥品的檢驗量可以酌減。 還有一些貴重藥品也應考慮檢驗量。3、檢驗量增修訂內容 中藥膜劑檢驗量50 cm2 修改為100cm2 。 沙門菌檢驗量修改為檢驗量為20 g或20ml并注明（其中10 g用于陽性對照）。 4、供試液的制備增修訂內容 供試品檢查時使用表面活性劑應證明其對微生物生長和存活無影響修改為無毒性。供試液的制備若需（水浴）（

16、刪除水浴兩字）加溫時，可采用其他經驗證的方法，但應均勻加熱，且溫度不應超過45。 新增貼劑供試液制備 取規定量供試品，去掉貼劑的保護層，放置在無菌玻璃或塑料片上，粘貼面朝上。用適宜的無菌多孔材料（如無菌紗布）覆蓋貼劑的粘貼面以避免貼劑粘貼在一起。然后將其置于適宜體積并含有滅活劑（如聚山梨酯80或卵磷脂）的稀釋劑中，用力振蕩至少30分鐘，或以其他方法制備成供試液。 具抑菌活性的供試品增修訂內容 刪除應消除供試液的抑菌活性修改為當供試品具有抑菌活性時，應盡量選擇操作簡便、快速的方法，應避免損傷供試品中污染的微生物。在供試品溶液性狀允許的情況下，應盡量選用薄膜過濾法。 離心沉淀集菌法 兩次離心修改為

17、一次離心； 500轉/分離心，不超過3分鐘，取全部上清液用于檢查。 影響因素 供試品 污染菌特性 適用范圍 僅使用于微生物限度檢查供試液的制備。 盡量避免使用，不可使用快速離心。 細菌、霉菌及酵母菌計數增修訂內容新增計數培養基的適用性檢查 菌種 大腸埃希菌（Escherichia coli）CMCC（B） 44102 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC（ B） 26 003 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）CMCC（B） 63 501 白色念珠菌（Candida albicans）CMCC（F） 98 001 黑曲霉（Aspergillus

18、niger）CMCC（F） 98 003 增加了菌懸液的制備及保存條件。 菌懸液制備后在室溫下放置應在2小時內使用，若保存在28可以在24小時內使用。黑曲霉孢子懸液可保存在 28，在驗證過的貯存期內使用，每株試驗菌平行制備2個平皿，混勻，凝固，按規定條件培養計數，同時用相應的對照培養基替代被檢培養基進行上述試驗。 增加了對照培養。 2.新增常見干擾物的中和劑和滅活方法 參見 表1常見干擾物的中和劑或滅活方法干擾物可選用的中和劑或滅活方法 戊二醛酚類、乙醇、吸附物醛類季銨類化合物（QACs）、對羥基苯甲酸酯汞類制劑雙胍類化合物碘酒、洗必泰類鹵化物乙二胺四乙酸（EDTA）磺胺類-內酰胺類抗生素亞硫

19、酸氫納稀釋法稀釋法、甘氨酸、硫代硫酸鹽卵磷脂、聚山梨酯亞硫酸氫納、巰基乙酸鹽、硫代硫酸鹽卵磷脂聚山梨酯硫代硫酸鹽鎂或鈣離子對氨基苯甲酸-內酰胺酶表1 常見干擾物的中和劑或滅活方法 6、供試品檢查增修訂內容 平皿法 刪去采用平皿法進行菌數測定時，連續23個稀釋級的供試液。修改為按計數方法的驗證試驗確認的程序進行供試液制備。 培養時間修改內容 除另有規定外，細菌培養48小時改為3天，霉菌、酵母菌培養72小時改為 5天，必要時，可適當延長培養時間至7天進行菌落計數并報告。菌數報告規則增修訂內容 若同稀釋級兩個平板的菌落平均數不小于15，則兩個平板的菌落數不能相差1倍或以上。 細菌、酵母菌和霉菌平均菌

20、落數在30300 、30100之間的稀釋級修改為選取菌落數小于300cfu（細菌）和100cfu（霉菌）的稀釋級作為菌數報告的依據。薄膜過濾法增修訂內容 新增內容 采用其它直徑的濾膜，沖洗量應相應的進行調整（如使用膜直徑增大沖洗液量也應相應增加，可保證沖洗液覆蓋整個濾膜）。 刪去每片濾膜的總過濾量不宜過大，修改為總沖洗量不得超過1000ml。 7、控制菌檢查增修訂增加控制菌檢查用培養基的適用性檢查； 檢查項目包括促生長、抑制及指示能力檢查，參照表2 新增培養基適用性檢查方法液體培養基促生長能力檢查。固體培養基促生長能力檢查。培養基抑制能力檢查。液體培養基指示能力檢查。固體培養基指示能力檢查。

21、試驗結果與對照培養基比較控制菌檢查用培養基的適用性檢查控制菌檢查用培養基的促生長、抑制及指示能力檢查控制菌檢查 培養基 特性 試驗菌株大腸埃希菌 膽鹽乳糖 促生長能力 大腸埃希菌 抑制能力 金黃色葡萄球菌 MUG 促生長能力+指示能力 大腸埃希菌 曙紅亞甲藍 或麥康凱 促生長能力+指示能力 大腸埃希菌大腸菌群 乳糖膽鹽 促生長能力 大腸埃希菌 抑制能力 金黃色葡萄球菌 乳糖發酵 促生長能力+指示能力 大腸埃希菌 曙紅亞甲藍 或麥康凱 促生長能力+指示能力 大腸埃希菌 沙門菌 營養肉湯 促生長能力 乙型付傷寒沙門菌 四硫磺酸鈉亮綠 促生長能力 乙型付傷寒沙門菌 抑制能力 金黃色葡萄球菌 膽鹽硫乳

22、瓊脂或沙門、 志賀氏屬瓊脂培養基 促生長能力+指示能力 乙型付傷寒沙門菌 曙紅亞甲藍瓊脂 或麥康凱瓊脂 培養基 促生長能力+指示能力 乙型付傷寒沙門菌 三糖鐵瓊脂 培養基 指示能力 乙型付傷寒沙門菌銅綠假單 膽鹽乳糖 促生長能力 銅綠假單胞菌胞菌 抑制能力 金黃色葡萄球菌 溴化十六烷基三 促生長能力 銅綠假單胞菌 甲銨瓊脂 抑制能力 大腸埃希菌 綠膿菌素測定 用培養基 促生長能力+指示能力 銅綠假單胞菌金黃色葡 亞碲酸鹽肉湯 促生長能力 金黃色葡萄球菌 萄球菌 抑制能力 大腸埃希菌 卵黃氯化鈉瓊脂促生長能力+指示能力 金黃色葡萄球菌 或甘露醇鹽瓊脂 抑制能力 大腸埃希菌梭菌 梭菌增菌培養基 促

23、生長能力 生孢梭菌 哥倫比亞瓊脂 促生長能力 生孢梭菌 白色念 沙氏葡萄糖肉湯 促生長能力 白色念珠菌珠菌 沙氏葡萄糖瓊脂 促生長能力+指示能力 白色念珠菌 念珠菌顯色培養基 促生長能力+指示能力 白色念珠菌 吐溫80玉米瓊脂 促生長能力+指示能力 白色念珠菌控制菌檢查法增修訂內容疑似致病菌的確證微生物控制菌檢查中沒有規定進一步確證疑似致病菌的方法。選擇已被認可的菌種鑒定方法。如伯杰氏細菌鑒定手。控制菌檢查方法驗證 刪去陰性菌對照組。 大腸菌群檢查用膽鹽乳糖培養基改為乳糖膽鹽。改梭菌檢查用庖肉培養基為梭菌增菌培養基。 改梭菌培養時間7296小時為48小時。 增加了白色念珠菌檢驗方法 增菌培養

24、沙氏葡萄糖肉湯培養基。 分離培養 劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養基平板上。鑒定試驗 典型菌落 沙氏葡萄糖瓊脂培養基 菌落呈乳白色偶見淡黃色，表面光滑有濃 酵母氣味，時間稍久則菌落增大，顏色變 深、質地變硬或有皺摺。 念珠菌顯色培養基 菌落呈綠色或翠綠色菌落生長。 確認試驗取1%吐溫80-玉米瓊脂 培養基培養物進行染色，鏡檢及芽管 試驗。結果判斷非革蘭陽性菌，顯微鏡下未見厚膜孢子、假菌絲、芽管判未檢出白色念珠菌。 新增微生物限度檢查法指導原則一、抑菌劑效力檢查法指導原則二、藥品微生物檢驗替代方法驗證指 導原則三、微生物限度檢查法應用指導原則四、藥品微生物實驗室規范指導原則 一、抑菌劑效力檢查法指導

25、原則 指導原則的目的 是為測定滅菌、非滅菌制劑中抑菌劑的活性，以評價最終產品的抑菌效力及生產企業在制劑研發階段抑菌劑的確定提供指導。 為防止藥品由于微生物污染而引起變質，對服用者造成不良反應，在藥品生產過程中加入一定劑量的抑菌劑。抑菌劑不能用于替代藥品生產的GMP管理，不能作為非滅菌制劑降低微生物污染的唯一途徑，也不能作為控制多劑量包裝制劑滅菌前的生物負載的手段。使用范圍及原則 使用范圍 如果藥物本身不具有充分的抗菌活性，應根據制劑特性添加適宜的抑菌劑，以防止制劑在正常貯藏和使用過程中可能發生的微生物污染和繁殖，對患者造成傷害。 使用原則 所有抑菌劑都具有一定的毒性，添加抑菌劑時應注意以下原則

26、: 抑菌劑的用量應為最低有效量。 具有抗菌活性的制劑應確認其抗菌效力。 應驗證最終容器中的抑菌劑效力在效期內不因貯藏條件而降低。 本試驗方法和抑菌劑抑菌效力判斷標準用于包裝未啟開的成品制劑。 抑菌劑抑菌效力的測定 供試品的分類 分為四類，但對于一些抗酸性制劑和含活生物制劑應考慮會降低有益菌的生物活性。見表1 表1 產品分類 類別 藥品 1 類 注射劑、 其他非腸道制劑， 包括 乳劑、耳用制劑、無菌鼻用制劑及眼 用制劑 2 類 局部給藥制劑、非滅菌鼻用制劑及用于 黏膜的乳劑 3 類 口服非固體制劑（非抗酸制劑） 4 類 非固體抗酸制劑 培養基 培養基的制備 胰酪胨大豆肉湯瓊脂培養基 胰酪胨大豆肉

27、湯培養基 沙氏葡萄糖肉湯培養基 培養基的適用性檢查 同控制菌培養基 的適用性檢查抑菌劑效力測定方法 菌種 菌液制備 菌種 同培養基適用性檢查，制劑中常見的污 染微生物也可作為試驗菌。 菌液制備 制成每1ml含菌數約為108cfu的菌懸液。 供試品接種影響因素給予指導 容器的材質、形狀、體積、封口方式及容器的PH等分別給予了指導。 接種菌量 接種菌液的體積不得超過供試品體積的0.5%1%。 放置 2025，避光貯存，貯存溫度的變化應盡可能控制在最小范圍，并防止被污染。 存活菌數測定 采用經驗證的方法進行試驗，計算1ml(g)供試品各試驗菌所得的菌數及各間隔時間的菌數，并換算成lg值。 結果判斷

28、結果符合表3要求，可判斷該產品抑菌效力符合規定。 表3 抑菌劑抑菌效力判斷標準 1 類 供 試 品 細菌 7天菌數下降不少于1.0 lg，14天菌數下降不少于 3.0lg,14天到28天菌數不增加。 真菌 與初始值比，7、14、28天菌數均不增加。 2 類 供 試 品 細菌 14天菌數下降不少于2.0 lg，14天到28天菌數不增加。 真菌與初始值比，14、28天菌數均不增加。 3 類 供 試 品 細菌 14天菌數下降不少于1.0 lg，14天到28天菌數不增加。 真菌 與初始值比，14、28天菌數均不增加。 4 類 供 試 品 細菌，真菌 與初始值比，14、28天菌數均不增加。 注：1、表中

29、“不增加”是指對前一個測定時間，試驗菌增加的數量 不超過0.5 lg。 2、0時菌數(初試值) 供試品加入試驗菌，搖勻，立即取樣檢 查，培養，計數，為0時菌數。 二、藥品微生物檢驗替代方法驗證指導原則 目的 是為所采用的試驗方法能否替代藥典規定的 方法用于藥品微生物的檢驗提供指導。 在控制藥品微生物質量中，需要采用替代方 法 時，應進行方法的驗證，確認其應用效果優于或等同于藥典的方法。 微生物檢驗的類型及驗證參數 藥品微生物檢驗方法主要分兩種類型 定性試驗 定量試驗 生物試驗的特殊性 抽樣誤差 操作誤差 稀釋誤差 培養誤差 計量誤差 計數誤差 藥品質量標準分析方法驗證指導原則不完全 宜于微生物

30、替代方法的驗證。 表1、 不同微生物檢驗類型驗證參數表 參數 定性檢驗 定量檢驗 準確度 精密度 專屬性 檢測限 定量限 線性 范圍 耐用性 重現性 注： 表示需要驗證的參數 表示不需要驗證的參數 逐項按替代方法驗證的要求進行驗證和評價以便操作者了解方法的關鍵操作點替代方法驗證的一般要求 適用性驗證前，對替代方法有一個全面的了解； 由替代方法的研發者提供，或由方法使用者完成。 驗證應至少使用2 個批號的樣品，每批樣品應平行進行至少3 次獨立實驗。 在開展各參數驗證時，除規定的菌株外，還應根據替代方法及樣品的特點增加相應的菌株。 三、藥品微生物限度檢查法應用指導原則 目的 為更好的應用微生物限度

31、檢查法及限度標準的合理執行提供指導。 用途 用于判斷非規定滅菌制劑及原料、輔料是否符合藥典的規定，也可用于指導制劑、原料、輔料的微生物質量標準的制定，及指導生產過程中間產品微生物質量的監控。 本指導原則將對標準和方法中的特定內容及標準的應用做進一步的說明。 1.微生物限度檢查過程中，如需要使用表面活性劑、滅活劑及中和劑，應對其用量、有效性、無毒性進行確認，無毒性確認，試驗的菌株應包括產品中可能污染的微生物。 2.檢驗方法的選擇 供試液制備應盡量選擇微生物限度檢查法中操作簡便、快速的方法，且應避免損傷供試品中污染的微生物。 對于抑菌作用較強的供試品，在供試品溶液性狀允許的情況下，應盡量選用薄膜過

32、濾法進行試驗。3. 供試液制備 本指導原則對離心沉淀法使用范圍、方法及對檢驗結果影響的因素進行了分析和指導 4.驗證試驗存在的問題及處理方法 自藥典收載方法驗證以來在實施過程中存在一些具體問題，對這些存在問題進行了指導； 進行驗證試驗時，因沒有適宜的方法消除供試品中的抑菌作用而導致微生物回收的失敗。 處理方法 應采用能使微生物生長的更高稀釋級供試液進行方法驗證試驗 。 若采用允許的最高稀釋級供試液進行驗證試驗還存在一株或多株試驗菌的回收率達不到要求。 處理方法 應選擇回收情況最接近要求的方法進行供試品的檢測。在以上情況下，生產單位或研制單位應進行全面的風險評估以保證檢驗方法的可靠性，從而保證產

33、品質量。 . 控制菌的確證 沒有規定進一步確證疑似致病菌的方法。僅規定若供試品檢出疑似致病菌，確證的方法應選擇已被認可的菌種鑒定方法。微生物限度標準 該指導原則對標準執行中存在的問題進行了分析和指導； 明確了微生物限度標準使用范圍 標準執行 必檢項目原則性要求 （丸劑、口服片劑、膠囊劑、顆粒劑），應對其被微生物污染的風險進行評估。 用于手術、燒傷及嚴重創傷的局部給藥制劑應符合無菌檢查法要求。 用于創傷程度難以判斷的局部給藥制劑，若沒有證據證明藥品不存在安全性風險則應符合無菌檢查法要求。 眼用制劑應符合無菌檢查法要求。 含動物類原藥材粉的口服中藥制劑要求不得檢出沙門菌。其中的動物類原藥材粉是指除

34、蜂蜜、王漿、動物角、阿膠外的所有動物類原藥材粉，如牡蠣、珍珠等貝類，海蜇、冬蟲夏草、人工牛黃等。 制定合理、安全和嚴格的微生物限度標準 四、藥品微生物實驗室規范指導原則 目的 該指導原則用于指導藥品微生物檢驗實驗室的質量控制。 藥品微生物的檢驗的對象具特殊性； 活的生物、 分布不均勻、重現性差 必須使用經驗證的檢測方法并嚴格按照藥品微生物實驗室規范要求進行試驗。藥品微生物實驗室規范包括以下幾個方面人員、培養基、菌種、實驗室的布局和運行、設備、文件、實驗記錄、結果的判斷等。人員從事藥品微生物試驗工作的人員應具備微生物學或相近專業知識的教育背景 檢驗人員和管理人員培訓 進行崗前培訓 檢驗人員技能培訓熟悉相關檢測 方法、程序、檢測目的和結果評價。 管理人員 其專業技能和經驗水平應與他們的職責范圍相符。不斷接受系統的教育與職責范圍相關的培訓。 客觀評估檢驗人員的能力，必要時對其進行再培訓并重新評估。 培養基培養基是微生物試驗的基礎，直接影 響微生物試驗結果。適宜的培養基制備方法、貯藏條件和質量控制試驗是提供優質培養基的保證。 該指導原則對培養基的制備