1、細胞凋亡與腫瘤 學 習 要 求 1 掌握細胞凋亡的概念及與壞死的區別 2 掌握細胞凋亡的基因調控機制及其與腫瘤 發生的關系 3 了解細胞凋亡的常用檢測方法及其特點 前 言對細胞死亡的認 識Nature Reviews, Molecular cell biology. 2001; 2: 545P C D Apoptosis1858年，Virchow開始研究細胞死亡1951年, Glucksman提出程序化細胞死亡 (Programmed Cell Death, PCD) 1972年, Kerr提出細胞凋亡 （Cell Apoptosis） Sydney Brenner H. Robert Hor

2、vitz John E. Sulston2002年英國人悉尼布雷諾爾、美國人羅伯特霍維茨和英國人約翰蘇爾斯頓，因在細胞凋亡研究工作中取得的杰出成就 獲諾貝爾生理與醫學獎主 講 內 容細胞凋亡特點細胞凋亡檢測發生調控機制細胞凋亡與腫瘤主 講 內 容細胞凋亡檢測發生調控機制細胞凋亡與腫瘤細胞凋亡特點細胞凋亡特點 概念意義 形態變化 基本特征 與壞死區別細胞凋亡特點 概念意義 形態變化 基本特征 與壞死區別細胞凋亡是機體生長發育、細胞分化和病理狀態中細胞自主性死亡的過程(dropping off , falling off) 細胞凋亡特點 概念意義 形態變化 基本特征 與壞死區別細胞凋亡是高度有序的

3、基因控制的一系列活性酶參與的過程，是多細胞動物生命現象的重要屬性細胞凋亡特點 概念意義 形態變化 基本特征 與壞死區別細胞凋亡與胚胎發生發展、個體形成、器官的細胞平衡穩定等有密切的關系蝌蚪尾消失發育過程手足成形過程脊椎動物神經系統發育細胞凋亡特點 概念意義 形態變化 基本特征 與壞死區別近年來研究表明，腫瘤的發生與細胞凋亡的異常密切相關；細胞凋亡受抑作為細胞增殖紊亂的對應面在腫瘤發生發展和轉歸方面均有重要作用。 細胞凋亡特點 概念意義 形態變化 基本特征 與壞死區別該“死”的細胞不死，如自身免疫性疾病，惡性腫瘤等不該死的細胞死了，可能與老年性癡呆、帕金森癥等有關細胞凋亡特點 概念意義 形態變化

4、 基本特征 與壞死區別細胞凋亡與衰老密切相關細胞凋亡對維持機體的遺傳穩定性起著重要的作用老 化細胞凋亡特點 概念意義 形態變化 基本特征 與壞死區別程序性死亡是功能上的概念，而細胞凋亡是形態學上的概念，不是所有的程序性死亡都表現為凋亡，即不一定存在凋亡的形態學改變細胞凋亡特點 概念意義 形態變化 基本特征 與壞死區別凋亡細胞形成多個大小不等有膜包裹的 凋亡小體（apoptotic bodies）內含形態保存完好的細胞器和/或濃縮的細胞核碎片，后期被吞噬細胞清除細胞凋亡特點 概念意義 形態變化 基本特征 與壞死區別1 受基因調控，死亡過程具有程序性，需要某些基因的啟動并合成新的RNA和蛋白質細胞

5、凋亡特點 概念意義 形態變化 基本特征 與壞死區別2 形態學上表現為細胞皺縮、染色質沿核膜聚集、胞體胞核裂解包裹形成凋亡小體細胞凋亡特點 概念意義 形態變化 基本特征 與壞死區別3 常單個存在于組織中4 周圍組織無炎癥反應細胞凋亡特點 概念意義 形態變化 基本特征 與壞死區別5 DNA片段化：瓊脂凝膠電泳可見特殊的階梯狀由不同倍數的l80200bp核苷酸組成DNA梯帶圖 6 合成一些大分子物質細胞凋亡特點 概念意義 形態變化 基本特征 與壞死區別細胞凋亡與細胞壞死的區別 特 點 細胞凋亡 細胞壞死發生原因形態特征 受累范圍 細胞膜 細胞體積 染色質 細胞核 細胞器 凋亡小體 周圍組織生化特征

6、調控 DNA降解 蛋白質合成 對ATP要求生理性或病理性多為單個或散在細胞仍保持完整固縮變小聚集在核膜下，呈半月形先固縮后降解仍保持完整有，被臨近細胞或巨噬細胞吞噬無炎癥反應整個過程受基因調控主動進行有規則，電泳呈梯狀DNA譜帶有必需病理性多為連續大片組織細胞完整性破壞腫脹增大分散凝集，呈絮狀溶解腫脹，內質網明顯崩解無，后期細胞破裂溶解，殘屑被巨噬細胞吞噬有炎癥反應整個過程均被動進行無規則，電泳多呈彌散狀無無需主 講 內 容細胞凋亡特點凋亡調控機制細胞凋亡與腫瘤細胞凋亡檢測細胞凋亡檢測 形態學觀察 細胞膜完整性 DNA斷裂 凋亡定量檢測 凋亡定位檢測細胞凋亡檢測 形態學觀察 細胞膜完整性 DN

7、A斷裂 凋亡定量檢測 凋亡定位檢測1 光學顯微鏡觀察 優點：光鏡技術簡單、快速，能短時間內 進行大樣本分析 缺點：樣本制備復雜、耗時 形態計數常受到主觀因素干擾 重復性差 細胞形態學的檢測2 電子顯微鏡觀察 優點：可顯示凋亡細胞的許多形態學特點 尤其是膜結構和細胞器的變化 主要用于獲取細胞凋亡的定性資料 缺點：樣本制備復雜、耗時細胞形態學的檢測細胞凋亡檢測 形態學觀察 細胞膜完整性 DNA斷裂 凋亡定量檢測 凋亡定位檢測1 臺盼蘭（Trypan blue）染色法 臺盼蘭為細胞膜非通透性活性染料，壞死細胞著色，而活細胞與早期凋亡細胞不著色意義： 方法簡單、便捷； 常常用于細胞死亡的初步評估細胞膜

8、完整性的檢測2 丫啶橙（acridine orange, AO）和溴化乙啶（ethidium bromide, EB）雙染法 AO和EB都能結合DNA的熒光染料，可 分別產生蘭色和橙色熒光，其中 AO能透過 完整的細胞膜，而 EB 則只能染色胞膜受損 的細胞細胞膜完整性的檢測AO/EB雙染法意義 可用于熒光顯微鏡或流式細胞儀區分活細胞或早期凋亡細胞和壞死細胞或繼發性壞死細胞 較臺盼蘭染色精確、詳細細胞膜完整性的檢測細胞凋亡檢測 形態學觀察 細胞膜完整性 DNA斷裂 凋亡定量檢測 凋亡定位檢測瓊脂糖電泳法 瓊脂糖凝膠電泳中 細胞凋亡呈現具有特征性的“階梯” （DNA ladder）樣條帶外觀 壞

9、死細胞則因DNA的隨機降解卻常出 現彌散樣外觀DNA斷裂的檢測J Clin Pathol: Mol Pathol 2000;53:5563J Clin Pathol: Mol Pathol 2000;53:5563瓊脂糖電泳法 缺點： 目前已被更為敏感的同位素標記、 原位末端標記技術所替代DNA斷裂的檢測細胞凋亡檢測 形態學觀察 細胞膜完整性 DNA斷裂 凋亡定量檢測 凋亡定位檢測 流式細胞儀檢測（flow cytometry, FCM） 幾乎所有凋亡細胞的特征性代謝、生化和分子特點都可利用FCM的單參數和/或多參數分析進行檢測 優點：單個細胞分散相中辨別凋亡細胞； 快速、準確；應用范圍廣快速

10、準確的定量分析細胞凋亡檢測 細胞膜完整性 形態變化 DNA斷裂 凋亡定量檢測 凋亡定位檢測Annexin V檢測技術原理：磷脂酰絲氨酸（PS）外翻是早期凋 亡細胞的重要形態特征之一，而依 賴Ca2+的磷脂結合蛋白Annexin V則 具有與PS高親和結合特性，將其作 為檢測細胞膜表面PS的敏感探針試 劑，用于凋亡細胞檢測 敏感的定位檢測Annexin V檢測技術優點：1 對凋亡細胞進行定性及定位檢測 2 同時使用膜非通透性DNA染料如 PI等，就能從Annexin V染色細 胞中將凋亡和壞死細胞區別開 來：凋亡細胞(-)，壞死細胞(+)敏感的定位檢測Apoptotic HeLa cells w

11、ere stained with FITC-AnnexinV+PIDNA檢測技術原理：根據DNA聚合酶能夠填補雙鏈DNA中 單鏈的堿基缺失部分的基本原理， 應用同位素或非同位素（如生物 素，FITC等）標記的三磷酸核苷酸 （dNTP）形成新的DNA，以了解DNA 是否斷裂和發生DNA斷裂的細胞數量原位末端標記檢測優點：常用熒光素FITC標記物，故可以 通過FCM或熒光顯微鏡檢測相應細 胞的攜帶熒光強度，進行快速定 性、定位、定量及大批量細胞懸液 或涂片的回顧性研究，是當前較流 行的一類細胞凋亡評判方法原位末端標記檢測 標記方法（1）DNA 聚合酶I或Klenow 大片段介導的原位缺口平移(in

12、 situ nick translation，INST)（2）末端DNA轉移酶dUTP缺口末端標記法(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick endlabeling, TUNEL)原位末端標記檢測TUNEL法的優點1 定性和定位：對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，能準確的反映凋亡細胞最典型的生物化學和形態特征2 可用于多種來源標本：如細胞懸液、福爾馬林固定或石蠟處理的組織、細胞培養物等3 操作簡單，靈敏度高：直接標記步驟少，操作簡便，且間接標記有信號放大的作用 原位末端標記檢測1 端粒酶檢測：90%的凋亡都具

13、有端粒酶活性2 mRNA水平檢測：通過檢測fas, Bax-和 bcl-X基因的 mRNA表達水平可反映細胞凋亡的水平 3 細胞內氧化還原狀態：谷胱甘肽狀態檢測4 細胞色素C定位檢測：細胞色素C存在于線粒體內外膜之間，凋亡信號刺激使其從線粒體釋放至細胞質，結合Apaf-1 啟動級聯反應5 線粒體膜電位變化：線粒體膜電位耗散啟動凋亡其它凋亡檢測方法細胞凋亡檢測方法小結定性和定量定 性：瓊脂糖凝膠電泳、形態學觀察（普通光學顯微鏡、透射電子顯微鏡和熒光顯微鏡）定量或半定量：流式細胞儀法、原位末端標記法、ELISA定量、瓊脂糖凝膠電泳區分凋亡與壞死可區分：瓊脂糖凝膠電泳、形態學觀察（透射電子顯微鏡最可

14、靠）、PI雙染色法流式細胞儀檢測無法區分：原位末端標記法、PI單染法流式細胞檢測 細胞凋亡檢測方法小結標本來源不同組織：主要用形態學方法(HE染色，透射電鏡、石蠟包埋組織切片進行原位末端標記，ELISA或將組織碾碎消化做瓊脂糖凝膠電泳)培養細胞：幾乎所有方法凋亡時期不同早期：細胞外膜磷脂酰絲氨酸的檢測、細胞內氧化還原狀態改變檢測、細胞色素C定位檢測、線粒體膜電位變化的檢測晚期：原位末端標記法、瓊脂糖凝膠電泳、端粒酶檢測主 講 內 容細胞凋亡特點細胞凋亡檢測細胞凋亡與腫瘤發生調控機制凋亡發生調控機制 凋亡發生過程 凋亡相關因素 凋亡調控機制 凋亡信號通路 凋亡調控基因凋亡發生調控機制 凋亡發生過

15、程 凋亡相關因素 凋亡調控機制 凋亡信號通路 凋亡調控基因誘導啟動信號傳遞凋亡實施吞噬搬運各種凋亡誘導分子(細胞內/外)線粒體途徑(P53 bcl-2家族)死亡受體途徑(Fas-Fas配體)Caspase 8Caspase 9Caspase 3細胞凋亡 1 接受凋亡信號 2 凋亡調控分子間的相互作用 3 蛋白水解酶（Caspases）的活化 4 凋亡的級聯反應凋亡發生過程誘導期：誘導期是由特定的凋亡誘導信號所 決定的效應期：活化的“中央處理器”（central executioner）啟動和“宣判”細胞迅 速進入降解期降解期：出現特征性形態學和生物化學改變凋亡過程分期凋亡全過程需時約數分鐘至數

16、小時不等從凋亡信號轉導到凋亡執行的各個階段都有負調控因子存在，以形成完整的反饋環路，使凋亡過程受到精確嚴密的調控 凋亡發生調控機制 凋亡發生過程 凋亡相關因素 凋亡調控機制 凋亡信號通路 凋亡調控基因（一）誘導性因素 細胞凋亡是一個程序化的過程，正常情況下它并不“隨意”啟動，只有當細胞受到來自細胞內外的凋亡誘導因素作用時才會啟動 凋亡誘導因素是凋亡程序的啟動者。在少數情況下細胞凋亡可自發產生，但多數是在誘導因素的作用下發生凋亡相關因素1.激素和生長因子失衡 生理水平的激素和生長因子是細胞正常生長不可缺少的因素，一旦缺乏，細胞會發生凋亡；相反，某些激素或生長因子過多也可導致細胞凋亡，例如：強烈應

17、激引起大量糖皮質激素分泌，后者誘導淋巴細胞凋亡，致使淋巴細胞數量減少凋亡相關因素2.理化因素 射線、高溫、強酸、強堿、乙醇、抗癌藥物等，均可導致細胞凋亡。例如：電離輻射可產生大量氧自由基，使細胞處于氧化應激狀態，DNA受損，引起細胞凋亡凋亡相關因素3. 免疫性因素 免疫細胞在生長、分化及執行防御、自穩、監視功能中，可釋放某些分子導致免疫細胞本身或靶細胞的凋亡。例如：細胞毒T淋巴細胞（CTL）可分泌顆粒酶（granzyme），引起靶細胞發生凋亡凋亡相關因素4.微生物學因素 細菌、病毒等致病微生物及其毒素可誘導細胞凋亡。例如：HIV感染時，可致大量CD4+ T淋巴細胞凋亡凋亡相關因素5. 其 他

18、如缺血與缺氧，神經遞質（如谷氨酸、多巴胺），失去基質附著等因素都可引起細胞凋亡。在腫瘤治療中，單克隆抗體、反義寡核苷酸、抗癌藥物等均可誘導腫瘤細胞凋亡凋亡相關因素（二）抑制性因素1.細胞因子 IL2、神經生長因子等 具有抑制凋亡的作用，當從細胞培養基中去除后，依賴細胞會發生凋亡；反之，如在培養體系中加入所需要的細胞因子，則可促進細胞內存活基因的表達，抑制細胞凋亡的發生凋亡相關因素 2. 某些激素 ACTH、睪丸酮、雌激素等 對防止靶細胞凋亡，維持正常存活必需例如： 當腺垂體被摘除或功能低下時，腎上腺皮質細胞失去ACTH刺激，可發生細胞凋亡，引起腎上腺皮質萎縮 睪丸酮對前列腺細胞 雌激素對子宮平

19、滑肌細胞凋亡相關因素 3. 其 他 某些二價金屬陽離子如Zn2+，藥物如苯巴比妥，病毒如EB病毒，以及中性氨基酸等也具有抑制細胞凋亡的作用凋亡相關因素凋亡發生調控機制 凋亡發生過程 凋亡相關因素 凋亡調控機制 凋亡信號通路 凋亡調控基因細胞死亡基因cell death gene線蟲的ced-3、ced-4哺乳動物的白細胞介素-1轉化酶（ICE）野生型p53/ner77Fas/Apo-1凋亡調控機制細胞死亡抑制基因 線蟲的ced-9哺乳動物的bcl-2對細胞凋亡的研究始于對 ced系列的研究線蟲（celegans） 研究細胞凋亡的理想模型 目前有關細胞凋亡機制研究的許多資料源于對這類無脊椎動物細

20、胞的觀察和研究，在其雌雄同體發育產生的1090個體細胞中，131個細胞是在特定的時空內以凋亡而終結凋亡調控機制線蟲Ced基因 和細胞凋亡 線蟲最重要的凋亡活化基因ced3、ced4和凋亡抑制基因ced-9 細胞凋亡時，ced-3被活化，活化的ced-3能特異地降解底物，誘導凋亡細胞產生特征性的形態和生物化學變化凋亡調控機制線蟲Ced基因 和細胞凋亡 Ced-4既能結合ced-3，也能與ced-9結合 在非凋亡細胞，ced-9以ced-4為中介與 ced-3結合成二聚體復合物，扣押ced-3 使其處于無活性酶原狀態存在于細胞內 在凋亡誘導信號作用下，ced-9則自復合體 中解離，ced-3被活化

21、，引導細胞凋亡 ced-3和ced-4受ced-9基因的負調控 凋亡調控機制Caspases 和細胞凋亡 1993年，袁鈞英等研究發現線蟲細胞凋亡基因ced-3與哺乳動物細胞中的白細胞介素-1轉化酶（interleukin-1 converting enzyme, ICE）存在功能和序列上的相似性，并與ced-3一樣，ICE的高表達可導致嚙齒動物成纖維細胞的凋亡 凋亡調控基因Caspases 和細胞凋亡 隨后，許多實驗室又相繼報道其他哺乳動物或人細胞中發現的14種具有參與細胞凋亡的不同的ICE/ced-3家族成員 1996年6月以后，國際學術界統一定名為caspases（cysteiny as

22、partate-specific proteinases即半胱氨酸天門冬氨酸特異性蛋白酶的縮拼名稱），并按發現的時間先后順序，在caspase命名之后再以阿拉伯數字表示其家族成員凋亡調控機制Caspase家族主要成員 序號 原名 功能底物特異性Caspase-1ICE輔助促炎癥WEHDCaspase-2ICE-1凋亡反應DEXDCaspase-3CPP32,Yama,apopain凋亡反應DEXDCaspase-4ICErel-II,TX,ICE-2輔助促炎癥WEHDCaspase-5ICErel-III,TY輔助促炎癥WEHDCaspase-6Mch-3凋亡反應(I/L/V)EXDCaspa

23、se-7Mch3,ICE-LAP3,CMH-1凋亡反應DEXDCaspase-8MACH,FLICE,Mch5凋亡反應(I/L/V)EXDCaspase-9ICE-LAP6,Mch6凋亡反應(I/L/V)EXDCaspase-10Mch4凋亡反應Caspase-11ICH3Caspase-12Caspase-13ERICECaspase-14MICE(Mini-ICE)Caspases的結構Caspase屬于半胱氨酸蛋白酶，其家族成員擁 有相似的氨基酸序列、結構和底物特異性Caspase都以酶原（30-50kd）形式表達，存在 于胞質中 Caspase酶原單鏈分子一般由四個結構域， 即末端多肽

24、或前（原）結構域、大亞單 位、小亞單位和連接區凋亡調控機制Caspases的活性特點Caspase具有嚴格的底物特異性，即異常 特異地剪切天冬氨酸殘基后的肽腱鄰近剪切位點N端的四肽序列及其結構對 Caspase的有效酶解非常重要各種Caspase識別的四肽序列明顯不同， 可能是造成功能差別的重要基礎 凋亡調控機制Caspases的活性特點 Caspase分為、類，分別以四肽序 列WEHD、DEXD和（I/L/V）EXD為特異性底物，Caspase活性顯示高度有效性 Caspase嚴格底物特異性和高度有效性有力地確保了細胞凋亡過程發生專一性的蛋白消化，即以一種和諧的方式選擇性地剪切一組蛋白質，導

25、致其功能的喪失或結構變化凋亡調控機制Caspase的活化機制 根據作用不同Caspase分為兩大類： 始動或上游（如Caspase2，810等） 效應或下游（如Caspase-3，6和7） 凋亡調控機制Caspase的活化機制 在凋亡誘導信號的作用下，始動Caspase 通過結合特異輔助因子而活化，活化的始動Caspase進一步活化效應Caspase，進一步參與凋亡 降解期中，活化Caspase的“級聯（或瀑布式）”模型體現在死亡受體介導的細胞凋亡信號途徑中凋亡調控機制Caspase的作用底物依據Caspase的作用底物將其分為兩大類 分別以Ced-3和ICE為代表ICE亞家族（Caspase

26、-1,4,5）： 主要輔助促炎癥反應Ced-3亞家族（Caspase-2,3,610）： 主要參與細胞凋亡過程 近幾年來，已發現有40多種Caspase底物凋亡調控機制ced-3/ICE基因凋亡調控的中央處理器，起核心作用Caspase通過下列機制參與凋亡過程（1）滅活細胞凋亡抑制蛋白（2）剪切細胞結構蛋白（3）剪切細胞效應蛋白Caspase通過切斷與周圍細胞的聯絡，重組細胞骨架，關閉DNA復制和修復，破壞DNA和核結構，誘導凋亡小體的形成等Caspase在細胞凋亡中的作用凋亡調控機制凋亡發生調控機制 凋亡發生過程 凋亡相關因素 凋亡調控機制 凋亡信號通路 凋亡調控基因死亡受體通路線粒體通路M

27、itochondriaCaspase-8Caspase-3 / 6/ 7Caspase-9Extrinsic PathwayIntrinsic PathwayUV / ChemotherapyFADDCyto cApoptosis DISCFas-LCaspase-10FasApoptosomeApaf-1 死亡受體（death receptor, DR）是指能夠通過與其相應的死亡配體（DL）結合，傳遞細胞凋亡信號的細胞表面的跨膜蛋白，主要包括腫瘤壞死因子（TNF）受體家族 TNF受體家族具有相似的、富含半胱氨酸的細胞外結構域，其胞漿區內包含由6080個氨基酸組成的死亡結構域（death do

28、main,DD） （一）死亡受體信號通路死亡受體超家族包括： TNFR、Fas（Apo-1或CD15）、DR3（Apo-3、TRAMP、LARD或WSL-1）、DR4（TRAIL-R1）、DRS（APD-2、TRAIL-R2、 KILLER）或DcR1（TRID）和TGF-（一）死亡受體信號通路死亡受體與細胞凋亡（一）死亡受體信號通路參與死亡受體信號轉導的接頭蛋白 （死亡結構域蛋白death domain protein）TRADD：TNF受體相關死亡結構域蛋白 TNF+TNFRI（死亡結構域）+TRADD細胞凋亡FADD：Fas相關死亡結構域蛋白 FasL+Fas（死亡結構域）+ FADD細

29、胞凋亡RIP：受體相互作用蛋白CRADD：含有死亡結構域的caspase和RIP接頭蛋白MADD：活化MAP激酶的死亡結構域蛋白（一）死亡受體信號通路FasL+Fas FADD 凋亡誘導復合物（DISC） 胞質中游離的caspase8聚集到復合物上 細胞足夠caspase8 細胞caspase8濃度不夠死亡受體活化 切割Bid，tBid從胞質到線粒體 細胞凋亡 Cyto C 釋放線粒體PT孔或Bcl-2家族成員形成的線粒體跨膜通道 Bcl-2家族結構和能形成離子通道的一些毒素（如大腸桿菌毒素）插入膜結構中形成較大的通道（二）線粒體信號通路 凋亡刺激因素使線粒體內膜的跨膜電位降低，進而使線粒體通

30、透性轉換孔(permeability transition pore，PTP)開放和線粒體膜通透性增高，導致線粒體內的細胞色素C (cytochrome c，Cyto-C)、凋亡誘導因子(apoptosis inducing factor,AIF)、凋亡蛋白酶激活因子(apoptotic protease activating factor， Apaf)等凋亡啟動因子釋放入胞漿線粒體通透性轉換孔 細胞凋亡期間盡管線粒體超微結構基本正常，但其功能已發生顯著改變細胞色素C(cytochrome c，Cyto-C) 細胞色素C正常時位于線粒體膜間，為呼吸鏈的電子傳遞體 當凋亡刺激因素作用于線粒體后，

31、可引起細胞色素C釋放至胞漿，在dATP存在的情況下，與Apaf-1結合,暴露Apaf-1的CARD（caspase activation and recruitment domain ）基序，并與procaspase-9的CARD結合形成凋亡復合體（apoptosome）,導致procaspase-9激活,后者進一步激活caspase-3，6等，誘導凋亡（二）線粒體信號通路凋亡復合體 2. AIF (apoptosis inducing factor) AIF是由X染色體上單拷貝基因編碼的黃素蛋白，分子量57kd，先在胞漿中合成其前體，然后移位至線粒體，與FAD結合形成成熟的AIF 正常時位于

32、線粒體膜間, 在各種凋亡誘導因子的作用下，AIF從線粒體釋放至胞漿，然后進入細胞核，引起染色質濃縮靠邊，DNA斷裂成50kD的大片段等凋亡的特征性改變（二）線粒體信號通路 釋放入胞漿的AIF通過促進線粒體釋放細胞色素C而增強凋亡信號，并快速激活核酸內切酶 AIF對凋亡的誘導作用是非Caspase依賴性的 AIF本身無DNA酶的活性，作用于其它蛋白而引起大片段DNA，其作用的靶蛋白目前仍不清楚 （二）線粒體信號通路3.凋亡蛋白酶的活化 凋亡蛋白酶是細胞凋亡的“執行者”，在細胞凋亡的發生發展中起著非常重要的作用（二）線粒體信號通路4. 內源性核酸內切酶與DNA片段化 細胞凋亡過程中執行染色質DNA

33、切割任務的是內源性核酸內切酶 內源性核酸內切酶作用于DNA雙鏈，形成高分子量的DNA片段或180-200bp整倍數的片段，在瓊脂糖凝膠電泳中呈“梯”狀(ladder pattern)條帶（二）線粒體信號通路內質網與細胞凋亡相聯系表現在兩個方面：1 內質網對Ca2+的調控2 內質網應激反應 內質網信號通路Ca2+濃度鈣調節分子抑凋亡蛋白Bcl2caspase-12 凋亡發生調控機制 凋亡發生過程 凋亡相關因素 凋亡調控機制 凋亡信號通路 凋亡調控基因凋亡調控基因包括： bcl-2家族、p53、C-myc、和Fas/Fas配基（Fas-L）系統等凋亡調控基因 ced-3/ICE基因凋亡調控的中央處

34、理器，起核心作用1 Bcl-2家族 bcl-2是B細胞淋巴瘤/白血病（B cell lymphoma/leukemia-2, bcl-2）基因的縮寫，最初從小鼠B細胞淋巴瘤中分離得到 bcl-2基因定位于18號染色體，含有3個外顯子，但僅第二和第三個外顯子具有編碼功能 Bcl-2編碼產物為由239個氨基酸組成，分子量為26KD的線粒體膜蛋白凋亡調控基因 bcl-2在進化過程中高度保守，功能相對保守 bcl-2的主要功能是通過阻斷細胞凋亡而促進細胞存活，是一類抗凋亡基因 bcl-2能夠抑制許多因素（如射線、甾體激素、抗TCR/CD3單克隆抗體，各種化療藥和癌基因）介導的細胞凋亡凋亡調控基因 與b

35、cl-2具有同源性的基因構成了bcl-2基因家族 Bcl-2家族中bcl-X基因能編碼兩種不同的蛋白bcl-Xl和bcl-Xs，前者抑制神經細胞的凋亡，后者抑制bcl-2的作用而使胸腺細胞凋亡 bcl-2活性由bcl-2相關蛋白Bax來調節凋亡調控基因 Bax/bcl-2的比值，對決定細胞接受刺激信號存活與否具有關鍵作用 bcl-2過量表達，細胞存活，Bax過量表達，細胞死亡 bcl-2可以保護所有刺激啟動的凋亡性細胞死亡，bcl-2是抑制細胞凋亡的最中心調控步驟 凋亡調控基因2 p53 p53作為一種抑癌基因，其作用機制是多方面的，其中p53可以促進腫瘤細胞發生凋亡也是一個重要的調控機制 人

36、的p53基因定位于17p13.1上，由11個外顯子和10個內含子組成，編碼的p53蛋白由393個氨基酸殘基組成凋亡調控基因 p53蛋白功能喪失后，則難以保證細胞染色體正常數目的維持，又不能通過細胞凋亡過程而消除不需要或損傷的細胞，以維持組織、器官的內環境穩定 p53蛋白使細胞暫時停滯于G1期, 促使細胞凋亡，在DNA損傷修復中起重要作用凋亡調控基因3 Fas/Fas-L Fas又稱APO-1或CD95，屬于腫瘤壞死因子（TNF）/神經生長因子（NGF）受體超家族 Fas基因定位于人10號染色體長臂及小鼠第19號染色體上，由9個外顯子和8個內含子組成凋亡調控基因 Fas與TNF-R1胞漿區有68

37、個氨基酸序列高度保守。這一區域被認為是傳遞凋亡信號所必需的，稱為死亡區域（death domain） Fas作為一種膜受體可向細胞內傳遞凋亡信號導致細胞凋亡凋亡調控基因4 C-myc C-myc是早期應答基因，具有促細胞增殖和促細胞凋亡的雙功能，c-myc誘導細胞凋亡需要同時缺乏生長因子。也就是說，只要環境中有足夠的生長因子存在，即使c-myc表達，細胞仍呈增殖狀態，只有生長因子缺乏且同時存在myc蛋白時，才會出現細胞凋亡凋亡調控基因主 講 內 容細胞凋亡特點細胞凋亡檢測發生調控機制細胞凋亡與腫瘤細胞凋亡與腫瘤 凋亡與腫瘤發生 凋亡與腫瘤相關基因 凋亡與腫瘤治療細胞凋亡與腫瘤 凋亡與腫瘤發生

38、凋亡與腫瘤相關基因 凋亡與腫瘤治療 隨著研究工作的不斷深入，越來越多的資料顯示與細胞惡性增殖和分化受阻一樣，細胞凋亡異常在大多數惡性腫瘤的發病學上占有重要地位細胞凋亡與腫瘤發生 實驗性肝癌發病的始動促進進展三個時期都涉及有細胞凋亡的異常 膀胱癌和結腸癌的多階段實驗模型中也可查見類似變化細胞凋亡與腫瘤發生 細胞凋亡與腫瘤發生的關系密切，機制可能有：1 基因水平上誘導凋亡基因如P53、bax、C-myc等 的失活以及抑制凋亡基因(如bcl-2)的過度表達2 機體免疫反應誘導腫瘤細胞凋亡的功能不全3 宿主因子，如細胞粘附分子、腫瘤生長因子等抑 制腫瘤細胞的凋亡4 前癌細胞凋亡機制不全5 細胞凋亡與腫

39、瘤的轉移可能也有關系，如基底細 胞癌極少轉移可能與腫瘤細胞凋亡明顯有關細胞凋亡與腫瘤發生 在惡性腫瘤的發病過程中，細胞凋亡異常的發生機制幾乎涉及到細胞凋亡信號途徑的所有方面，其中，研究最為深入和活躍的是凋亡抑制基因和凋亡活化基因的異常細胞凋亡與腫瘤發生 HBV編碼的HBx蛋白和病毒相關的肝癌發生和凋亡受阻密切相關HBx蛋白是Caspase的強效抑制物，合成HBx蛋白的鼠成纖維細胞和肝癌細胞能夠耐受各種凋亡誘導劑細胞凋亡與腫瘤發生 在造血系統惡性腫瘤的發病學上，染色體改變尤其是染色體的易位占有重要地位，這種易位可能導致異常融合蛋白的表達，其中一些就具有抑制細胞凋亡的作用 細胞凋亡與腫瘤發生 Bc

40、l-abl蛋白，它是多數慢性髓細胞白血病（CML）和某些急性淋巴細胞性白血病（ALL）中形成的腫瘤融合蛋白，這種融合蛋白的存在和形成增多，可明顯降低腫瘤細胞的凋亡速率和提高腫瘤細胞對某些化療藥物或蛋白合成抑制劑的耐受性，促進腫瘤細胞的迅速增生 細胞凋亡與腫瘤發生細胞凋亡與腫瘤 凋亡與腫瘤發生 凋亡與腫瘤相關基因 凋亡與腫瘤治療與凋亡和腫瘤相關的基因包括： 1 P53基因 2 Fas基因 3 bcL-2基因家族凋亡與腫瘤相關基因1 P53基因： P53基因具有腫瘤抑制作用 ： 野生型P53基因能使細胞周期停止在G1期，抑制細胞繁殖，從而抑制細胞的生長和誘導細胞的凋亡，發揮腫瘤抑制的功能 突變型P53基因無此功能，結果抑制了細胞凋亡導致多種腫瘤的發生凋亡與腫瘤相關基因2 bcl-2基因： bcL-2基因家族是細胞凋亡的重要調節者，按功能分為促凋亡蛋白家族的Bax、bcL-2、bad、bah；和抗凋亡蛋白家族的bcL-2、bcL-xL、ced-9等。bcL-2位于凋亡活動的中心，是細胞凋亡的抑制劑，可保護腫瘤細胞免受各種誘導劑誘發的凋亡過程，乃至腫瘤的形成 凋亡與腫瘤相關基因2 Fas基因： Fas主要存在于免疫細胞膜表面，FasL表達于活化的T淋巴細胞 FasFasL是一種細胞凋亡信號轉導途徑，調節機體的免疫功能，當T淋巴細胞被激活后可表達Fas及FasL，引起細胞凋亡凋亡與腫瘤