1、共培養(yǎng)系統(tǒng)在軟骨組織工程中的應(yīng)用和發(fā)展張 雨1，劉舒云1，郭維民1，郝春香2，王明杰1，鹿 亮3，盧世璧1，郭全義1(1解放軍總醫(yī)院骨科研究所，骨科再生醫(yī)學(xué)北京市重點實驗室，全軍骨科戰(zhàn)創(chuàng)傷重點實驗室，北京市 100853；2解放軍總醫(yī)院麻醉科，北京市 100853；3安徽省立醫(yī)院骨二科，安徽省合肥市 230041)引用本文：張雨，劉舒云，郭維民，郝春香，王明杰，鹿亮，盧世璧，郭全義.共培養(yǎng)系統(tǒng)在軟骨組織工程中的應(yīng)用和發(fā)展J.中國組織工程研究，2017，21(12):1926-1932.DOI:7.12.021 ORCID: 0000-0002-1390-0919(張雨)文章快速閱讀：軟骨組織工

2、程中的共培養(yǎng)系統(tǒng)多層次、多維度的成分與結(jié)構(gòu)剖析細(xì)胞混合比率生物材料的作用共培養(yǎng)細(xì)胞作用模式直接或間接共培養(yǎng)共培養(yǎng)系統(tǒng)共培養(yǎng)系統(tǒng)在軟骨組織工程中的研究選擇合適生物材料軟骨組織工程研究立體培養(yǎng)對細(xì)胞的優(yōu)勢平面或三維細(xì)胞培養(yǎng)為構(gòu)建理想的軟骨組織工程共培養(yǎng)系統(tǒng)提供導(dǎo)向和理論依據(jù)，促進(jìn)軟骨的再生與修復(fù)構(gòu)思、設(shè)計全面系統(tǒng)地歸納、總結(jié)共培養(yǎng)系統(tǒng)中的各構(gòu)成組分及培養(yǎng)模式的作用機(jī)制及意義最優(yōu)細(xì)胞混合比率文題釋義：共培養(yǎng)：模擬機(jī)體內(nèi)生理條件，將兩種(可來自同一組織或不同的組織)及以上的細(xì)胞混合共同培養(yǎng)，從而體外再次仿生構(gòu)建體內(nèi)微環(huán)境，促進(jìn)其中一種或多種細(xì)胞的形態(tài)和功能維持在機(jī)體內(nèi)的穩(wěn)定表達(dá)狀態(tài)，并持續(xù)較長久的時間

3、。組織工程：應(yīng)用生命科學(xué)與工程科學(xué)的原理和技術(shù)，在正確認(rèn)識生物體有機(jī)體的正常及病理狀態(tài)下的組織結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的基礎(chǔ)上，應(yīng)用生物支架、活細(xì)胞及細(xì)胞因子等構(gòu)建組織工程組織，用于修復(fù)和促進(jìn)機(jī)體各種組織或器官損傷后的功能與形態(tài)的再生。摘要背景：近年來大量的研究證明，共培養(yǎng)應(yīng)用到軟骨組織工程中能夠成功構(gòu)建具有更好生物學(xué)特性的組織工程軟骨。目的：通過對共培養(yǎng)概念的提出及共培養(yǎng)系統(tǒng)中種子細(xì)胞來源、細(xì)胞混合比率、共培養(yǎng)空間模式及生物材料各方面分別進(jìn)行整理和深入闡述，歸納分析各因素對組織工程軟骨生物學(xué)特性的效應(yīng)，展望未來共培養(yǎng)系統(tǒng)在組織工程軟骨研究中的發(fā)展方向。方法：第一作者檢索1976年1月至2016年5月P

4、ubMed數(shù)據(jù)庫、Web of Science數(shù)據(jù)庫和中國知網(wǎng)中的相關(guān)文獻(xiàn)，檢索關(guān)鍵詞為“Co-culture，Co-culture systems；articular cartilage，chondrocytes，mesenchymal stem cells； tissue engineering，articular cartilage tissue engineering；共培養(yǎng)，共培養(yǎng)系統(tǒng)；關(guān)節(jié)軟骨，軟骨細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞；組織工程，軟骨組織工程”。最后納入文獻(xiàn)共計60篇，中文1篇，英文59篇。結(jié)果與結(jié)論：共培養(yǎng)強(qiáng)調(diào)了細(xì)胞處理過程中生物微環(huán)境的重要性，即在體外為細(xì)胞生長提供物理-化學(xué)-生

5、物三位一體的刺激因素；在軟骨組織工程中，共培養(yǎng)很好地維持了軟骨細(xì)胞的活性和天然細(xì)胞表型，能夠誘導(dǎo)具有多項分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞分化成軟骨。另外，為軟骨組織工程軟骨細(xì)胞的來源受限問題和骨軟骨復(fù)合傷的治療帶來新的途徑；但是共培養(yǎng)中細(xì)胞間相互作用的具體機(jī)制仍然有待進(jìn)一步研究，從而為優(yōu)化共培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)條件提供有力依據(jù)，以更好地應(yīng)用到軟骨組織工程中構(gòu)建優(yōu)良的組織工程軟骨組織。關(guān)鍵詞：張雨，男，1988年生，安徽省蒙城縣人，漢族，解放軍總醫(yī)院骨科在讀碩士，主要從事關(guān)節(jié)軟骨的組織工程修復(fù)與再生、干細(xì)胞生物微環(huán)境方面的研究。通訊作者：郭全義，主任醫(yī)師，副教授，碩士生導(dǎo)師，解放軍總醫(yī)院骨科研究所，北京市 100

6、853 中圖分類號:R318文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:2095-4344(2017)12-01926-07稿件接受：2016-12-01Zhang Yu, Studying for masters degree, Institute of Orthopaedics, Chinese PLA General Hospital, the Beijing Key Laboratory of Regenerative Medicine in Orthopaedics, the PLA Key Laboratory of Musculoskeletal Trauma & War Injuries, Bei

7、jing 100853, ChinaCorresponding author: Guo Quan-yi, Chief physician, Associate professor, Masters supervisor, Institute of Orthopaedics, Chinese PLA General Hospital, the Beijing Key Laboratory of Regenerative Medicine in Orthopaedics, the PLA Key Laboratory of Musculoskeletal Trauma & War Injuries

8、, Beijing 100853, China組織構(gòu)建；軟骨組織工程；共培養(yǎng)；軟骨細(xì)胞；間充質(zhì)干細(xì)胞；生物材料；軟骨組織工程；國家自然科學(xué)基金主題詞：軟骨細(xì)胞；間充質(zhì)干細(xì)胞；生物相容性材料；組織工程基金資助：國家自然科學(xué)基金資助項目(81472092)；國家高技術(shù)發(fā)展研究計劃(863計劃)資助項目(2015AA020303)Application and progress of co-culture systems in cartilage tissue engineering Zhang Yu1, Liu Shu-yun1, Guo Wei-min1, Hao Chun-xiang2, Wa

9、ng Ming-jie1, Lu Liang3, Lu Shi-bi1, Guo Quan-yi1 (1Institute of Orthopaedics, Chinese PLA General Hospital, the Beijing Key Laboratory of Regenerative Medicine in Orthopaedics, the PLA Key Laboratory of Musculoskeletal Trauma & War Injuries, Beijing 100853, China; 2Department of Anesthesiology, the

10、 General Hospital Of Chinese PLA, Beijing 100853, China; 3Second Department of Orthopaedics, Anhui Provincial Hospital, Hefei 230041, Anhui Province, China)AbstractBACKGROUND: Accumulative evidence supports that co-culture technology can be applied to construct the tissue-engineered cartilage with e

11、xcellent biological characters.OBJECTIVE: To elaborate the co-culture concept and conclude and analyze seed cell sources, cell mixed ratio, spatially-defined co-culture models and biomaterials in co-culture systems to conclude and analyze the biological characters of tissue-engineered cartilage, and

12、 to prospect progression of co-culture systems in cartilage tissue engineering. METHODS: The first author retrieved the databases of PubMed, Web of Science, and CNKI for relative papers published from January 1976 to May 2016 using the keywords of “co-culture, co-culture systems; articular cartilage

13、, chondrocytes, mesenchymal stem cells; tissue engineering, articular cartilage tissue engineering” in English and Chinese, respectively. Finally 60 literatures were included in result analysis, including 1 Chinese and 59 English articles.RESULTS AND CONCLUSION: Co-culture technology emphasizes the

14、role of microenvironment in terms of various physical, chemical and biological factors in the cell processing. In cartilage tissue engineering, co-culture systems contribute to maintain the viability and natural cell phenotype of chondrocytes and induce cartilage differentiation of mesenchymal stem

15、cells. In addition, co-culture technology provides a novel way for cartilage tissue engineering to overcome the shortage of chondrocytes and repair injury to the cartilage-subchondral bone. However, the mechanisms of cell-cell interaction in co-culture systems still need to be explored in depth, so

16、as to optimize the co-culturing conditions and construct perfect tissue-engineered cartilage.Subject headings: Chondrocytes; Mesenchymal Stem Cells; Biocompatible Materials; Tissue EngineeringFunding: the National Natural Science Foundation of China, No. 81472092; the National High-Tech Research & D

17、evelopment Program of China (863 Program), No. 2015AA020303Cite this article: Zhang Y, Liu SY, Guo WM, Hao CX, Wang MJ, Lu L, Lu SB, Guo QY. Application and progress of co-culture systems in cartilage tissue engineering. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2017;21(12):1926-1932.0 引言 Introduction 從生命體中獲

18、取目的組織或細(xì)胞，在體外環(huán)境對其進(jìn)行不同方面的研究和處理后，最終是要把研究的成果回歸到生命體內(nèi)，為進(jìn)行正常生命活動所服務(wù)，這是生命科學(xué)對生命體的探索常常需要經(jīng)歷的過程之一。因此，怎么能夠保證從機(jī)體內(nèi)取出目的組織或細(xì)胞在接受條件性刺激后，都作出在機(jī)體內(nèi)外一致的反應(yīng)或是最大可能接近是非常重要的，是科研結(jié)果的真實性、可靠性的具體體現(xiàn)。然而，對于主流的研究對象細(xì)胞，目前一般的體外細(xì)胞處理技術(shù)單種細(xì)胞平面培養(yǎng)，只是簡單的為細(xì)胞的生長提供必需的物理、化學(xué)條件，包括溫度、pH、生長營養(yǎng)因子等。大量的研究證實，僅僅提供這些條件尚未能滿足細(xì)胞維持正常生長的需求1-2。特別是在軟骨組織工程中，從正常軟骨組織中分離

19、得到的軟骨細(xì)胞在這些簡單的理化條件下擴(kuò)增培養(yǎng)后極易發(fā)生去分化，表現(xiàn)在細(xì)胞形態(tài)、蛋白合成和基因表達(dá)方面的變化3-4，最終，導(dǎo)致構(gòu)建的組織工程軟骨的生物學(xué)特性難以達(dá)到與天然軟骨組織相匹配的結(jié)果。表現(xiàn)為以纖維軟骨替代透明軟骨來修復(fù)軟骨損傷，修復(fù)區(qū)力學(xué)強(qiáng)度難以達(dá)到正常需求。間充質(zhì)干細(xì)胞由于其具有多向分化的潛能，而被廣泛的應(yīng)用于組織工程。但是，在經(jīng)歷體外的誘導(dǎo)分化成軟骨過程中，常常因誘導(dǎo)分化不足或過度而導(dǎo)致細(xì)胞肥大或鈣化軟骨的出現(xiàn)5。這些均困擾著組織工程軟骨的發(fā)展和應(yīng)用。文章歸納分析各因素對組織工程軟骨生物學(xué)特性的效應(yīng)，展望未來共培養(yǎng)系統(tǒng)在組織工程軟骨研究中的發(fā)展方向。1 資料和方法 Data and

20、methods1.1 檢索方法 由第一作者于2016年5月進(jìn)行檢索，檢索文獻(xiàn)時限為1976年1月至2016年5月，以檢索詞“Co-culture, Co-culture systems; articular cartilage, chondrocytes, mesenchymal stem cells; tissue engineering, articular cartilage tissue engineering; 共培養(yǎng)，共培養(yǎng)系統(tǒng)，關(guān)節(jié)軟骨，軟骨細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞；組織工程，軟骨組織工程”，在PubMed數(shù)據(jù)庫()、Web of Science數(shù)據(jù)庫和中國知網(wǎng)()中檢索所有研究原著文

21、獻(xiàn)。1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) 文章所述內(nèi)容需為軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)的實驗研究；共培養(yǎng)研究屬于軟骨組織工程方面，包括修復(fù)軟骨損傷的體內(nèi)動物實驗研究。1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) 符合納入標(biāo)準(zhǔn)的綜述文獻(xiàn)；重復(fù)性研究。1.4 數(shù)據(jù)的提取 計算機(jī)初檢得到中英文文獻(xiàn)共計300余篇，閱讀標(biāo)題和摘要進(jìn)行初篩，排除綜述，中英文文獻(xiàn)重復(fù)報道，以及與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)不相關(guān)的文獻(xiàn)。1.5 質(zhì)量評估 符合納入標(biāo)準(zhǔn)的中英文文獻(xiàn)共計60篇(英文文獻(xiàn)59篇，中文文獻(xiàn)1篇)，涵蓋了共培養(yǎng)系統(tǒng)在軟骨組織工程中的應(yīng)用，研究內(nèi)容包括種子細(xì)胞的來源、細(xì)胞的混合比率、直接共培養(yǎng)或間接共培養(yǎng)、共培養(yǎng)體系中的生物材料應(yīng)用及共培養(yǎng)的平面或三維細(xì)胞培養(yǎng)模式。文獻(xiàn)檢索流程

22、圖見圖1。2 結(jié)果 Results2.1 共培養(yǎng)概念的提出及在軟骨組織工程中的研究 近些年來，已經(jīng)有報道細(xì)胞間的信號在細(xì)胞的生物學(xué)行為中發(fā)揮著重要的作用6。在體內(nèi)，細(xì)胞的新陳代謝和功能的第一作者以“Co-culture，Co-culture systems；articular cartilage，chondrocytes，mesenchymal stem cells；tissue engineering，articular cartilage tissue engineering；共培養(yǎng)，共培養(yǎng)系統(tǒng)；關(guān)節(jié)軟骨，軟骨細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞；組織工程，軟骨組織工程”檢索PubMed，Web of Sc

23、ience和CNKI數(shù)據(jù)庫排除重復(fù)研究共檢索到中英文文獻(xiàn)300余篇納入有關(guān)與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)、軟骨組織工程中共培養(yǎng)相關(guān)的實驗研究平面或三維培養(yǎng)模式生物材料的添加不同直接或間接共培養(yǎng)細(xì)胞的混合比率不同種子細(xì)胞的來源不同通過閱讀摘要初步篩選，共選取51篇文獻(xiàn)進(jìn)行綜述，其中中文17篇，英文34篇，涵蓋以下具體內(nèi)容：圖1 共培養(yǎng)系統(tǒng)在軟骨組織工程中的相關(guān)研究綜述文獻(xiàn)檢索流程圖發(fā)揮時刻受到來自微環(huán)境的信息調(diào)控，包括來自周圍細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)或因子中的生化信息、生物力學(xué)和生物電刺激信號等7-8。當(dāng)細(xì)胞脫離機(jī)體內(nèi)環(huán)境，通過分離、消化及純化在體外環(huán)境單種培養(yǎng)時，導(dǎo)致細(xì)胞失去了天然細(xì)胞微環(huán)境的作用，其相應(yīng)的天然生物

24、學(xué)特性也因此而丟失。在共培養(yǎng)系統(tǒng)中，能夠為種子細(xì)胞提供所需的物理條件、化學(xué)營養(yǎng)物質(zhì)的同時，通過加入一種或以上的種子細(xì)胞來提供相應(yīng)的生物刺激信息，模擬體內(nèi)生物微環(huán)境，以維持細(xì)胞的正常代謝和功能9。在許多領(lǐng)域研究證實細(xì)胞間相互作用影響著細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞極性、細(xì)胞增殖和生化功能10-11。軟骨組織工程中，相對于單種細(xì)胞培養(yǎng)，共培養(yǎng)系統(tǒng)通過構(gòu)建的仿生體內(nèi)微環(huán)境表現(xiàn)出其獨特的優(yōu)勢。一方面，陪伴細(xì)胞(如間充質(zhì)干細(xì)胞)通過分泌營養(yǎng)因子或細(xì)胞間的信息交流促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和延遲去分化12。同時，軟骨細(xì)胞能夠誘導(dǎo)具有多項分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞分化成軟骨13。另一方面，共培養(yǎng)降低了軟骨組織工程中軟骨細(xì)胞的需求量，減少

25、了體外擴(kuò)增培養(yǎng)時間，盡可能的降低了軟骨細(xì)胞原始表型的丟失。然而，共培養(yǎng)系統(tǒng)是復(fù)雜的，其作用機(jī)制尚不是非常清楚，存在爭議。因此，更好的理解共培養(yǎng)作用機(jī)制對于優(yōu)化軟骨組織工程共培養(yǎng)系統(tǒng)，增強(qiáng)組織工程軟骨生物學(xué)特性是十分必要的。共培養(yǎng)技術(shù)的基本方法是應(yīng)用兩種及以上的種子細(xì)胞或材料的共同培養(yǎng)，通過不同種細(xì)胞分泌不同細(xì)胞因子、細(xì)胞間信息交流及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，最終目的是達(dá)到一個天然的協(xié)同作用使他們之間形成優(yōu)勢互補(bǔ)，劣勢消除的理想效果。經(jīng)過近40年的發(fā)展，在軟骨組織工程領(lǐng)域的共培養(yǎng)已經(jīng)取得了令人滿意的成就。但是，不同的共培養(yǎng)系統(tǒng)常常會得到不同甚至相反的結(jié)論。有學(xué)者報道認(rèn)為在軟骨細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞

26、共培養(yǎng)，可以通過營養(yǎng)作用刺激軟骨細(xì)胞增殖促進(jìn)新生軟骨形成，而間充質(zhì)干細(xì)胞本身并沒有誘導(dǎo)分化成軟骨14。另外，間充質(zhì)干細(xì)胞能夠通過分泌細(xì)胞因子和生長因子發(fā)揮抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，提供合適的微環(huán)境提高軟骨細(xì)胞的細(xì)胞活性。然而，Acharya等15的研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖的同時，發(fā)現(xiàn)其也發(fā)生了成軟骨分化，表現(xiàn)為軟骨相關(guān)基因表達(dá)水平上調(diào)和蛋白的高合成。導(dǎo)致研究結(jié)果層次不齊，甚至相矛盾的原因可能是多方面的，包括共培養(yǎng)系統(tǒng)中種子細(xì)胞的來源不同，如表型最原始的原代軟骨細(xì)胞、已經(jīng)發(fā)生去分化的軟骨細(xì)胞或不同組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞等。另外，也可能由于共培養(yǎng)條件的差異所致，如三維立體共培養(yǎng)或平面

27、共培養(yǎng)、直接混合共培養(yǎng)或間接共培養(yǎng)、種子細(xì)胞比率及生物材料的不同等均是影響實驗結(jié)果的影響因素之一。2.2 軟骨組織工程共培養(yǎng)系統(tǒng)中各成分的分析 種子細(xì)胞的來源 種子細(xì)胞是組織工程中最為重要的組成成分，其生物學(xué)狀態(tài)的好與壞對組織工程的結(jié)果起到?jīng)Q定性作用。在軟骨組織工程中，種子細(xì)胞的來源主要包括實質(zhì)細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞。實質(zhì)細(xì)胞主要包括原代軟骨細(xì)胞、傳代后的軟骨細(xì)胞、骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞和軟骨下骨細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞主要來源于骨髓血、滑膜組織、脂肪組織、臍帶及臍帶血等組織。間充質(zhì)干細(xì)胞：間充質(zhì)干細(xì)胞被廣泛應(yīng)用到軟骨組織工程共培養(yǎng)系統(tǒng)中與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)，主要體現(xiàn)以下優(yōu) 勢1，16：來源廣泛且為永生細(xì)胞；具有

28、自我更新和多系分化潛能；免疫調(diào)節(jié)功能和低的免疫原性等。這些特性在體內(nèi)組織的再生與修復(fù)中扮演著重要的角色。不同組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞在共培養(yǎng)系統(tǒng)的應(yīng)用即有其獨特的優(yōu)勢，也面臨著一些挑戰(zhàn)。在共培養(yǎng)系統(tǒng)中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過營養(yǎng)作用促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖，延遲軟骨細(xì)胞的去分化17-18。Ouyang等19發(fā)現(xiàn)和軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)的骨髓單個核細(xì)胞也能夠延遲軟骨細(xì)胞的去分化。相對于骨髓干細(xì)胞，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞有類似的分化成軟骨潛能和克隆增殖能力15。另外，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞可以一次獲得大量的細(xì)胞數(shù)，而不需經(jīng)過體外擴(kuò)增的優(yōu)勢，有利于臨床轉(zhuǎn)化和應(yīng)用。相比較其他組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞

29、，據(jù)報道滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞具有更優(yōu)越的增殖活性及分化成軟骨潛能。Zhang等20應(yīng)用滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞與經(jīng)過轉(zhuǎn)化生長因子3轉(zhuǎn)染的軟骨細(xì)胞在藻酸鹽水凝膠中共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)不僅誘導(dǎo)滑膜干細(xì)胞分化成軟骨，而且很好的維持了軟骨細(xì)胞的天然表型。但是，誘導(dǎo)成軟骨的滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞仍然保持著自身的成纖維細(xì)胞特性，這需要未來的研究進(jìn)一步評估其在共培養(yǎng)系統(tǒng)中的應(yīng)用價值。胚胎間充質(zhì)干細(xì)胞是最原始的干細(xì)胞，可被誘導(dǎo)分化為機(jī)體幾乎所有的細(xì)胞類型。人胚胎干細(xì)胞擁有較高的端粒酶活性，具有很強(qiáng)的長期增殖潛能和定向分化能力。Vats等21首次報道人胚胎干細(xì)胞與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)后被誘導(dǎo)分化成軟骨細(xì)胞。與單純?nèi)伺咛ジ杉?xì)胞的培養(yǎng)組相比，共培

30、養(yǎng)系統(tǒng)中的人胚胎干細(xì)胞能夠分泌更多的細(xì)胞外基質(zhì)，如糖胺多糖及型膠原等。由于來源于骨髓、滑膜及脂肪組織的間充質(zhì)干細(xì)胞會給患者帶來二次損傷，且細(xì)胞的活性受到患者自身體質(zhì)的影響，而來源于胚胎組織的胚胎干細(xì)胞數(shù)量受限又帶來倫理爭議等，這些也一定程度的影響了它們的推廣和應(yīng)用。來源于圍產(chǎn)期組織的間充質(zhì)干細(xì)胞，在一定程度上解決了以上問題而成為當(dāng)前研究的熱點。Pereira等22用人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞以微球方式共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞能夠誘導(dǎo)分化成軟骨，獲得較滿意的組織工程軟骨。另外，圍產(chǎn)期組織來源的廣泛，對人體不會造成傷害，又不受倫理約束，其被認(rèn)為是介于胚胎干與成體間充質(zhì)干細(xì)胞之間的年輕

31、有活力的種子細(xì)胞23-24，因此其有望成為未來該領(lǐng)域具有應(yīng)用前景的種子細(xì)胞之一。實質(zhì)細(xì)胞：共培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)被嘗試用于解決單純的軟骨損傷和骨軟骨復(fù)合傷的問題中，如骨關(guān)節(jié)炎和軟骨-軟骨下骨復(fù)合損傷等。在骨關(guān)節(jié)炎中，軟骨細(xì)胞一定程度上失去了原有的表型而發(fā)生了去分化。相對于原代軟骨細(xì)胞，發(fā)生去分化的軟骨細(xì)胞其細(xì)胞表面標(biāo)志物已經(jīng)發(fā)生了很大的改變，包括整合蛋白、合成代謝調(diào)節(jié)因子等25-28。原代軟骨細(xì)胞與去分化的軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)，可以逆轉(zhuǎn)去分化的軟骨細(xì)胞反分化29。這說明，臨床中可以保留損傷或退變的軟骨組織或細(xì)胞與原代軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)，用來修復(fù)損傷軟骨組織。這不僅充分利用了損傷的軟骨組織，而且也很大程度上減少了

32、對正常軟骨組織的需求。由于共培養(yǎng)系統(tǒng)具有多種細(xì)胞共同在同一環(huán)境培養(yǎng)的獨特優(yōu)勢，而骨軟骨復(fù)合傷以多種組織多種細(xì)胞的同時受損為特點，所以近年來，共培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于骨軟骨復(fù)合傷修復(fù)的探索也成為研究的熱點之一30-33，希望能為骨軟骨復(fù)合傷帶來有效的修復(fù)效果。Jiang等34研究稱，在軟骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞的共培養(yǎng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)，相對于單純軟骨細(xì)胞培養(yǎng)組，共培養(yǎng)組的軟骨細(xì)胞外基質(zhì)糖胺聚糖明顯合成降低。另外，在單純成骨細(xì)胞培養(yǎng)組中，成骨細(xì)胞的鈣化程度更高。這一研究結(jié)果也許可以為骨軟骨過渡區(qū)的再生提供有效解決途徑。 共培養(yǎng)細(xì)胞混合比率 在共培養(yǎng)系統(tǒng)中軟骨細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞的混合比率，可能會通過影響細(xì)胞因子的分泌量而

33、影響共培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞行為，如間充質(zhì)干細(xì)胞的成軟骨分化5。隨著軟骨細(xì)胞比率的增加，型膠原mRNA 的表達(dá)水平也顯著提高23。相反，提高間充質(zhì)干細(xì)胞的比率會導(dǎo)致型和型膠原mRNA的表達(dá)水平上調(diào)18，35。因此，選擇最佳的種子細(xì)胞混合共培養(yǎng)比率，使共培養(yǎng)結(jié)果向著需要的方向發(fā)展顯得更為重要。Mo等36報道，間充質(zhì)干細(xì)胞與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)的混合比率通過細(xì)胞間相互作用影響著細(xì)胞的分化和功能。隨著間充質(zhì)干細(xì)胞與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)時間的延長，軟骨細(xì)胞樣外基質(zhì)的合成增加，同時型膠原基因的表達(dá)水平上調(diào)。Qing等35報道了用兔軟骨細(xì)胞與骨髓干細(xì)胞以21的比率混合共培養(yǎng)為最佳比率，認(rèn)為軟骨細(xì)胞分泌的轉(zhuǎn)化生長因子、骨形態(tài)發(fā)

34、生蛋白及胰島樣生長因子1在促進(jìn)骨髓干細(xì)胞成軟骨方面起到重要作用。Sabatino等28研究得出體內(nèi)與體外最佳的種子細(xì)胞混合共培養(yǎng)比例不同，在體內(nèi)最佳混合共培養(yǎng)比率中間充質(zhì)干細(xì)胞所占比率更高于體外，猜測這可能與間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)創(chuàng)造了一個成軟骨誘導(dǎo)的微環(huán)境有關(guān)。共培養(yǎng)系統(tǒng)中，細(xì)胞混合比率在細(xì)胞間相互作用中扮演著重要的角色，影響間充質(zhì)干細(xì)胞的分化和軟骨樣細(xì)胞外基質(zhì)的分泌。由于種子細(xì)胞的活性、來源不同和培養(yǎng)環(huán)境的不同，導(dǎo)致最佳混合培養(yǎng)比率的不同。具有穩(wěn)定的天然軟骨細(xì)胞表型和細(xì)胞活性，有助于降低共培養(yǎng)系統(tǒng)中軟骨細(xì)胞所占的比率和間充質(zhì)干細(xì)胞的分化成軟骨。未來的研究應(yīng)該聚焦在減少軟骨細(xì)胞的比率，提高間充質(zhì)

35、干細(xì)胞的比率，同時獲得滿意的新生軟骨組織。 直接或間接共培養(yǎng) 直接共培養(yǎng)或間接共培養(yǎng)直接影響著共培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞間相互作用模式(圖2)，包括細(xì)胞-細(xì)胞間隙連接、細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞-細(xì)胞因子或者它們之間聯(lián)合模式。細(xì)胞間相互作用的模式也許影響著軟骨細(xì)胞表型的維持和成軟骨誘導(dǎo)的作用。間接共培養(yǎng)是機(jī)械地把共培養(yǎng)細(xì)胞在物理空間上分離，如Transwell小室10，單獨研究細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子對另一種細(xì)胞生物學(xué)行為的作用。直接共培養(yǎng)是把共培養(yǎng)細(xì)胞相互均勻混合在一塊，除了細(xì)胞因子對細(xì)胞產(chǎn)生作用外，還會通過細(xì)胞表面分子受體，細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)等方式參與到細(xì)胞間的相互作用中37。間接共培養(yǎng)強(qiáng)調(diào)軟骨細(xì)胞或間充質(zhì)

36、干細(xì)胞分泌因子對共培養(yǎng)細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)分泌和成軟骨分化發(fā)揮重要作用。并且已經(jīng)有報道稱，在間接共培養(yǎng)系統(tǒng)中沒有異種細(xì)胞間物理接觸的前提下，檢測到了軟骨細(xì)胞分泌相關(guān)細(xì)胞因子，并成功的誘導(dǎo)了間充質(zhì)干細(xì)胞分化成軟骨38-40。然而，有研究稱細(xì)胞間的物理接觸也許扮演著主導(dǎo)作用41-42，單獨的依靠細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子不能或極小程度的改變間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨基因的上調(diào)。通過整合蛋白、生長因子和細(xì)胞因子實現(xiàn)近距離的細(xì)胞間交流和信號傳遞發(fā)揮的作用不可忽視43-44。應(yīng)用微球形式共培養(yǎng)的研究中發(fā)現(xiàn)，下調(diào)了間充質(zhì)干細(xì)胞的X膠圖2 種子細(xì)胞共培養(yǎng)模式圖圖注：圖a為平面種子細(xì)胞直接共培養(yǎng)；b為平面種子細(xì)胞間接共培養(yǎng)；

37、c為種子細(xì)胞混合三維直接共培養(yǎng)；d為種子細(xì)胞混合三維間接共培養(yǎng)。原基因表達(dá)水平而降低其表型肥大，同時維持軟骨細(xì)胞表型15，45。 生物材料 除了種子細(xì)胞外，生物材料也構(gòu)成了共培養(yǎng)系統(tǒng)的重要組成部分之一。生物材料的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、力學(xué)特性和表面功能基團(tuán)都獨立地影響著細(xì)胞表型、增殖和分化，以及新生組織的結(jié)構(gòu)等46-48。應(yīng)用到軟骨組織工程共培養(yǎng)系統(tǒng)的材料很多，主要包括合成材料(如聚己內(nèi)酯17)、天然高分子材料(如藻酸鹽水凝膠15、瓊脂49、膠原等28)和它們的復(fù)合材料(如聚己內(nèi)酯/膠原、聚己內(nèi)酯/細(xì)胞外基質(zhì)等)50。軟骨細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞在透明質(zhì)酸水凝膠中共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)了間充質(zhì)干細(xì)胞的成軟骨分化，但是

38、減低了軟骨細(xì)胞的活性導(dǎo)致新生組織的力學(xué)和生化特性與對照組并未見明顯差異45。Mo等36報道人間充質(zhì)干細(xì)胞與兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞在藻酸鹽中以 21混合共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)人間充質(zhì)干細(xì)胞表現(xiàn)為成骨表型，認(rèn)為可能是藻酸鹽水凝膠更有助于間充質(zhì)干細(xì)胞向骨分化。Levorson等51報道，相比較單獨應(yīng)用聚己內(nèi)酯作為共培養(yǎng)種子細(xì)胞的支架材料，復(fù)合有細(xì)胞外基質(zhì)的聚己內(nèi)酯支架更能上調(diào)間充質(zhì)干細(xì)胞膠原基因的表達(dá)水平。由于在共培養(yǎng)系統(tǒng)中有多種細(xì)胞的同時存在，因此應(yīng)考慮到同一材料會給不同種子細(xì)胞帶來的不同生物學(xué)影響。選擇合適的生物材料同時適合多種細(xì)胞的生長和代謝，為細(xì)胞間相互作用提供最佳的微環(huán)境，對達(dá)到滿意的共培養(yǎng)效果顯得至關(guān)重要

39、。 平面或三維共培養(yǎng) 大量研究表明，平面培養(yǎng)會加快軟骨細(xì)胞的去分化，三維立體培養(yǎng)能夠較好的維持軟骨細(xì)胞的天然表型52-54。而在共培養(yǎng)系統(tǒng)中，軟骨細(xì)胞的表型直接影響著軟骨細(xì)胞與其他細(xì)胞的相互作用。在三維共培養(yǎng)系統(tǒng)中(圖2c，d)，微球和多孔支架是最長用的空間培養(yǎng)模式55-57。細(xì)胞自聚集微球會隨著微球的逐漸增大而導(dǎo)致氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)難以滲透至組織內(nèi)部，同時代謝產(chǎn)物也難以排出組織，因此限制了組織的再生能力58。而多孔支架在為種子細(xì)胞提供空間結(jié)構(gòu)的同時，材料本身可以促進(jìn)種子細(xì)胞的黏附、增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的分泌，隨著支架的降解讓出種子細(xì)胞生長的空間，是一個持續(xù)動態(tài)的再生過程。三維立體共培養(yǎng)是未來共培養(yǎng)具

40、有希望的培養(yǎng)模式之一。 其他可能的影響因素 培養(yǎng)基對細(xì)胞生物學(xué)行為可能產(chǎn)生的影響，由于考慮到干細(xì)胞具有高細(xì)胞活性、增殖快和多系分化潛能，而軟骨細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)易發(fā)生去分化改變等，探索共培養(yǎng)對細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，更好地構(gòu)建共培養(yǎng)組織工程組織，部分學(xué)者通過應(yīng)用不同的血清濃度或在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加相應(yīng)細(xì)胞因子如轉(zhuǎn)化生長因子1和地塞米松等59-60，或通過基因?qū)肽康募?xì)胞中使其持續(xù)表達(dá)相應(yīng)細(xì)胞因子，如轉(zhuǎn)化生長因子。結(jié)果證實，共培養(yǎng)能夠增強(qiáng)細(xì)胞對細(xì)胞因子的敏感性，提高了目的基因及蛋白的表達(dá)水平，高濃度血清可增強(qiáng)軟骨細(xì)胞對干細(xì)胞的誘導(dǎo)作用。另外，有研究表明，在生物反應(yīng)器中進(jìn)行動態(tài)的軟骨細(xì)胞培養(yǎng)，會通過流

41、體靜水壓給予軟骨細(xì)胞力學(xué)刺激的作用，從而增強(qiáng)了軟骨細(xì)胞表型的維持和細(xì)胞外基質(zhì)成分的分泌。因此，如果在共培養(yǎng)系統(tǒng)中添加仿生軟骨功能狀態(tài)下的力學(xué)刺激調(diào)劑，可能會得到較為理想的結(jié)果。但是，目前尚缺乏此類共培養(yǎng)的相關(guān)研究，應(yīng)該是未來探索的方向之一。3 結(jié)論與展望 Conclusion and prospect 共培養(yǎng)的初衷是在體外環(huán)境下模擬體內(nèi)細(xì)胞微環(huán)境，促進(jìn)細(xì)胞間信息交換和功能仿生組織的生成。共培養(yǎng)為軟骨組織工程中的基礎(chǔ)研究與臨床應(yīng)用遇到的瓶頸，包括軟骨細(xì)胞來源受限及體外擴(kuò)增去分化、間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化發(fā)生肥大和骨軟骨一體化再生問題等，提供的新的解決途徑，并取得了系列的進(jìn)展。但是，軟骨組織工程共培

42、養(yǎng)系統(tǒng)中細(xì)胞間相互作用的具體機(jī)制仍不清楚，距離臨床應(yīng)用還有很大的距離。理解細(xì)胞間相互作用的具體機(jī)制將有助于對共培養(yǎng)條件的優(yōu)化，如種子細(xì)胞的來源、混合培養(yǎng)的比率、細(xì)胞間的交流模式和生物材料的選擇。共培養(yǎng)條件的探索和細(xì)胞間相互作用的機(jī)制仍然是未來研究的重要內(nèi)容。另外，目前的共培養(yǎng)的相關(guān)研究多局限于體外，動物體內(nèi)實驗應(yīng)該加以開展來進(jìn)一步驗證共培養(yǎng)的優(yōu)勢。 致謝：感謝解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)圖書館提供相關(guān)數(shù)據(jù)庫，以方便進(jìn)行相關(guān)文獻(xiàn)的檢索。作者貢獻(xiàn)：第一作者構(gòu)思并設(shè)計綜述，第二、三作者參與分析并解析數(shù)據(jù)并起草，其余作者審校。利益沖突：所有作者共同認(rèn)可文章無相關(guān)利益沖突。倫理問題：無涉及倫理沖突的內(nèi)容。文章查重：

43、文章出版前已經(jīng)過CNKI反剽竊文獻(xiàn)檢測系統(tǒng)進(jìn)行3次查重。文章外審：文章經(jīng)國內(nèi)小同行外審專家雙盲外審，符合本刊發(fā)稿宗旨。作者聲明：通訊作者郭全義對于研究和撰寫的論文中出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)責(zé)任。論文中涉及的原始圖片、數(shù)據(jù)(包括計算機(jī)數(shù)據(jù)庫)記錄及樣本已按照有關(guān)規(guī)定保存、分享和銷毀，可接受核查。文章版權(quán)：文章出版前雜志已與全體作者授權(quán)人簽署了版權(quán)相關(guān)協(xié)議。開放獲取聲明：這是一篇開放獲取文章，文章出版前雜志已與全體作者授權(quán)人簽署了版權(quán)相關(guān)協(xié)議。根據(jù)知識共享許可協(xié)議“署名- 非商業(yè)性使用- 相同方式共享3.0”條款，在合理引用的情況下，允許他人以非商業(yè)性目的基于原文內(nèi)容編輯、調(diào)整和擴(kuò)展，同時允許任何用戶閱

44、讀、下載、拷貝、傳遞、打印、檢索、超級鏈接該文獻(xiàn)，并為之建立索引，用作軟件的輸入數(shù)據(jù)或其它任何合法用途。4 參考文獻(xiàn) References Filardo G, Perdisa F, Roffi A, et al.Stem cells in articular cartilage regeneration. J Orthop Surg Res. 2016;11:42.Harris JD, Siston RA, Brophy RH, et al.Failures, re-operations, and complications after autologous chondrocyte impl

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