1、Val、Ile及Leu對必特螺旋霉素生物合成的影響李楨林江維王永紅*郝玉有儲炬莊英萍張嗣良【摘要】在合成造就基中別離添加纈氨酸(Val)、異亮氨酸(Ile)與亮氨酸(Leu)觀察其對必特螺旋霉素生物合成的影響，證實Val、Ile及Leu對必特螺旋霉素多組分的合成有著差異的調治作用。實行效果表白在36h別離添加0.5g/L的上述三種氨基酸，發酵液pH和銨離子濃度存在著明顯差異，而Val脫氫酶活性都增長了23倍。添加Val使菌體在60h之前糖耗速率加速，到達1.0g/(Lh)，胞內丙酮酸積聚，丙酮酸羧化酶活性增長20%95%，檸檬酸合成酶活性低落41%，發酵液中丙酸和丁酸出現先增長后低落的征象，終

2、極效價比比擬超過45.3%，而總異戊酰組分那么低落了23%，其他酰化組分低落了39.6%；添加Ile以后菌體糖耗速率落至比擬的30%40%，檸檬酸合成酶活性低落了47%，發酵液中的乙酸、丙酸、丁酸都出現大量積聚的征象。終極效價為比擬的85%，而丙酰螺旋霉素III、乙酰螺旋霉素以及異丁酰螺旋霉素組分含量別離增長126%、50%、296%。添加Leu對低級代謝影響不大，異戊酸在胞外積聚，隨后被重新汲取使用，終極異戊酰基螺旋霉素II和異戊酰基螺旋霉素III組分別離進步了41%和50%。同時總異戊酰基螺旋霉素相對含量也比比擬進步了41.9%，效價和比擬根本同等。【關鍵詞】必特螺旋霉素；纈氨酸；亮氨酸；

3、異亮氨酸；有機酸；銨離子KEYRDSBitehspirayin;Valine;Leuine;Isleuine;rganniaid;Aniuins必特螺旋霉素是一種新型大環內酯類抗生素1，它是在螺旋霉素的底子上，通過4“-異戊酰基轉移酶的催化在4-位置上接入一系列酰基形成的一族多組分酰化螺旋霉素(Fig.1)，于2000年10月得到中國創造專利(專利號：LZ97104440.6)，并于2001年7月得到國度藥品監視辦理局公布的“新藥臨床研究批件，如今已經通過II期臨床研究。必特螺旋霉素組分中異戊酰組分含量對其生物活性影響較大，且在專利中對異戊酰基螺旋霉素III的含量要求為30%，發酵后消費工藝對

4、異戊酰基螺旋霉素III的含量要求為20%。藥效研究表白，必特螺旋霉素體外抗菌譜較廣，在體內的不變性比力好，毒性低，藥效與乙酰螺旋霉素相似2。氨基酸既可以作為碳源，也可以作為氮源來使用，并且很多氨基酸照舊一些次級代謝產物的前體，如纈氨酸(Val)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)，它們的代謝產物包羅乙酰A、丙酰A、異戊酰基A與丁酰A等，這些物質是大環內酯類抗生素生物合成的前體。前人已經對支鏈氨基酸代謝影響抗生素生物合成以及相干酶學做了較多研究。Hafner等3在研究averetin生物合成歷程中創造不含有支鏈-2-氧基脫氫酶活性的突變菌株無法在不含Val、Leu和Ile的合成造就基中生長。進

5、一步研究創造支鏈-2-氧基脫氫酶賣力支鏈氨基酸剖析代謝，滿意生長的必要還為averetin生物合成提供起始單位-支鏈有機酸。Lunes等4在螺旋霉素發酵歷程中研究了Val和銨離子之間的作用干系，效果表白在合成造就基中添加Val可以或許排除銨離子按捺，很大程度進步螺旋霉素的產量，同時還創造過量的銨離子按捺了酮異戊酸脫氫酶活性，導致Val無法剖析代謝為螺旋霉素生物合成所需的前體物質。張秀華5在研究含有麥迪霉素4“-羥基酰化酶基因的螺旋霉素產生菌時創造，在發酵24h時添加0.2%的L-Ile，酰化螺旋霉素的百分含量從比擬的45%進步到了67%。Yshida等6報道Ile能增長醌霉素B(quinyin

6、B)組分的相對含量，并證實白Ile可以作為醌霉素生物合成的前體物質，調控醌霉素的合成。Pspisil等7創造莫能星(為五環單羧酸多醚布局的脂溶性抗生素，由4個相似的A、B、D身分組成)發酵歷程中添加Ile可以或許進步莫能星B，低落莫能星A的相比擬例，通過13原子示蹤實行創造，Ile按捺Val的生物合成，而Val為莫能星A提供前體，終極導致莫能星A相比擬例落落。本文重要在合成造就基的底子上研究支鏈族氨基酸對必特螺旋霉素組分和效價的影響。研究創造，在36h時別離添加0.05g/100l的Val、Leu和Ile對必特螺旋霉素組分和效價影響最顯著，并通過有機酸和酶活數據開端闡發了這三種氨基酸的作用機制

7、。1質料和要領1.1菌種、造就基和造就條件(1)菌株必特螺旋霉素基因工程菌SJ-1-195為含異戊酰基轉移酶基因的整合型的螺旋霉素鏈霉菌(StreptyesspirayetiusF21)，由同聯團體上海生物技能研究所提供。(2)造就基歪面造就基、種子造就基和生物檢定造就基均按文獻8配制。合成造就基身分(g/100l)：糊精5，NH4N30.2，KH2P40.065，l20.00005，gS40.55，Nal1.0，a30.5。(3)造就條件將1l甘油管接種于一級搖瓶，28造就4856h，按10%接種量接種于二級種子搖瓶中，28造就2426h，按8%接種量接種于發酵搖瓶(裝液量50l/500l)

8、中，220r/in，28旋轉式搖床造就96h。天天按時取樣測定種種發酵代謝參數，測定效果為3個樣的均勻值。(4)氨基酸添加方法稱取必然重量的Val、Leu和Ile在紫外燈下照耀12h，并于發酵舉行到36h時別離在差異的搖瓶中添加0.05g/100l的Val、Ile、Leu。1.2試劑和儀器乙酸、丙酸、丙酮酸、丁酸和異戊酸均為闡發純；Val、Leu、Ile、牛血明凈卵白為生化試劑；色譜儀為AgilentHP1100(檢測器：G1314A紫外可見波長檢測器；進樣器：G1328A)；酶標儀為TherK3(Eletrnrpratin)。1.3測定要領(1)生物量丈量接納丈量菌絲干重法(Dryellei

9、ght,D)。取5l發酵液，過濾后用蒸餾水洗菌體，連同濾紙于80烘至恒重后稱量。(2)總糖、復原糖測定接納斐林試劑法9。(3)銨離子濃度丈量接納Berthelt比色法10。(4)以杯碟法8測生物效價，乙酰螺旋霉素為尺度品，枯草芽孢桿菌作為斷定菌。(5)產物組分以及胞外有機酸測定。HPL法測定有機酸乙酸、丙酸、丙酮酸和-酮戊二酸色譜柱：AquaSep(2504.6，5)，活動相為0.01l/L磷酸水溶液(用NaH2P4調治pH至2.30.1)甲醇(98.51.5)，流速1l/in，進樣量20l，檢測器波長210n，柱溫30。丁酸和異戊酸色譜柱：Shi-pakVP-DS(1504.6，5)，活動相

10、為0.01l/L磷酸水溶液(用NaH2P4調治pH至2.30.1)甲醇(6040)，流速1l/in，進樣量20l，檢測器波長210n，柱溫30。HPL闡發發酵樣品取必特螺旋霉素發酵液于3000r/in離心10in，取上清液于-20冷凍保存備用。闡發時取1l上清液l0000r/in離心10in，上清液用0.45合成纖維素酯膜舉行真空過濾后，取20l進樣。根據文獻11對發酵液中的有機酸定性，并比擬有機酸尺度曲線對有機酸舉行定量。(6)丙酮酸羧化酶和檸檬酸合成酶活力測定無細胞粗提液的制備4冷凍離心(4000r/in，5in)網絡菌體，用10%(/V)的蔗糖溶液洗濯兩次后，懸浮于5l的含20%甘油的0

11、.05l/LTris-Hl緩沖液(pH7.4)中，用高壓破裂儀(JG-1A)破裂，操縱壓力200pa。破裂液在4、12000r/in下離心30in，取上清液舉行酶活測定。酶活測定丙酮酸羧化酶和檸檬酸合成酶別離根據文獻測定按文獻12，13的要領舉行，一個酶活單位界說為1in內酶催化產物天生的微摩爾數，比活力用每毫克卵白中所含酶活單位表現。接納酶標儀及時跟蹤檢測。卵白質測定用考馬斯亮藍G-250法10，以牛血明凈卵白作尺度曲線。2效果2.1Val、Ile及Leu對必特螺旋霉素產量的影響在必特螺旋霉素發酵歷程中添加Val、Ile與Leu，對必特螺旋霉素的菌體生長以及生物合成影響明顯。Fig.2A表現

12、，對數生恒久竣事后菌濃有所顛簸，在4872h內出現略微的上升趨勢；在發酵后期，由于造就基中養分的耗盡，菌體產生自溶，菌濃落落。添加氨基酸之后，菌體在產素期的生長和維持受到了按捺，菌濃較比擬低1%5%。Fig.2B表白，添加氨基酸之后的24h內效價增長遲鈍，隨著發酵的舉行，各組分間差異性越來越顯著。添加Val的搖瓶生物效價在60h以后出現直線上升，發酵竣事時比比擬超過45.3%。添加Ile以后生物效價增長比力遲鈍，發酵竣事時只有比擬的85%。添加Leu其生物效價和比擬根本雷同。2.2Val、Ile及Leu對必特螺旋霉素組分的影響Tab.1效果表現，添加Leu以后，異戊酰基螺旋霉素II和異戊酰基螺

13、旋霉素III別離為比擬的141%和150%，總異戊酰基螺旋霉素相對含量也比比擬進步了41.9%，螺旋霉素比例很顯著地落落。其他小酰化組分的相對含量和比擬根本雷同。添加Ile促使丙酰螺旋霉素III、乙酰螺旋霉素III以及異丁酰螺旋霉素組分含量別離增長126%、50%、296%；螺旋霉素和總異戊酰螺旋霉素的相對含量都相應地落落，別離是比擬的64%和70%。添加Val促進了螺旋霉素和丁酰螺旋霉素組分的合成，此中螺旋霉素I和III增長最為顯著，酰化螺旋霉素組分那么差異程度地低落，此中總異戊酰組分低落23%，其他酰化組分低落39.6%。由此可見，固然三種支鏈氨基酸落解以后產生的都是必特螺旋霉素合成前體，

14、但對付必特螺旋霉素組分和效價的影響很不雷同。Val重要是通過促進內酯環的合成從而進步效價；Ile重要是促進了除異戊酰組分以外的其他酰化組分的合成；Leu重要是促進了異戊酰螺旋霉素的合成。2.3Val、Ile及Leu對糖代謝的影響上述實行效果表白，螺旋霉素鏈霉菌對這三種氨基酸的使用和代謝有所差異。如Fig.4(A)表現，在添加Val的環境下，菌體的糖耗增長，發酵液中殘留的總糖在4860h之內敏捷地從2.34g/100l落落至1.14g/100l；糖耗速率在4860h也到達最高1.0g/(Lh)；添加Ile，糖耗速率維持在0.10.2g/(Lh)；添加Leu以后糖耗速率在0.30.5g/(Lh)范

15、疇內。Fig.4(B)所示為添加Val、Ile及Leu對必特螺旋霉素生物合成歷程中胞內丙酮酸變革環境。添加Val，胞內丙酮酸在2.74.3l/L范疇內顛簸；添加Ile，胞內的丙酮酸濃度在0.51.0l/L范疇內顛簸；添加Leu，胞內的丙酮酸濃度在0.92.4l/L范疇內顛簸。與比擬1.02.3l/L比力，創造添加Val時，胞內丙酮酸的天生濃度顯著高于比擬，添加Ile按捺胞內丙酮酸的天生，添加Leu時胞內丙酮酸的濃度與比擬根本雷同。葡萄糖進入細胞以后，起首顛末EP代謝途徑轉化為丙酮酸以后才氣進一步進入TA循環，丙酮酸濃度的變革必然程度上可以反響菌體對糖的使用環境。添加Val以后胞內的丙酮酸濃度高

16、于比擬，對EP途徑有必然的促進作用，相對應的糖的使用也得到了增強。同樣，添加Ile引起了丙酮酸的低落，添加Leu沒有引起丙酮酸的變革，但導致了對糖使用速率的差異。Fig.5形貌了添加三種氨基酸時丙酮酸羧化酶與檸檬酸合成酶活性變革環境。丙酮酸羧化酶作用是丙酮酸轉化天生草酰乙酸，其活性可以在必然程度上反響大環內酯類抗生素內酯環合成的強弱，即次級代謝的強弱，而檸檬酸合成酶是TA循環的關鍵酶，其活性凹凸可以反響TA循環的的強弱，與菌體低級代謝的強弱有直接的干系。Fig.5(A)表現示，添加Val后，丙酮酸羧化酶活性在48和60h的酶活別離是比擬的120%和195%；添加Ile后，P落為比擬的為60%和

17、65%；添加Ile沒有產生顯著的變革。Fig.5(B)表現，添加Val后，檸檬酸合成酶活性在48和60h的別離是比擬的42%和23%；添加Ile時，S別離為比擬的47%和52%；而添加Leu沒有產生顯著的變革。由上可知，添加Val后，丙酮酸羧化酶的活性和胞內丙酮酸濃度都有顯著進步。胞內天生的丙酮酸重要是轉化為乙酰A和草酰乙酸，而草酰乙酸為天生丙二酰A和甲基丙二酰A的重要底物，丙酮酸羧化酶的活性和胞內丙酮酸濃度的增長為菌體產素提供了富足的前體，進步了效價。添加Ile時，丙酮酸羧化酶與檸檬酸合成酶的活性都極大低落，胞內丙酮酸的濃度也有所低落，也就是說Ile的參加同時減弱了菌體低級與次級代謝，導致了

18、生物量與效價的低落。當添加Leu時，丙酮酸羧化酶與檸檬酸合成酶的活性相對付比擬都根本沒有變革，低級與次級代謝都沒有受到很大的影響，因此效價與比擬比擬也沒有產生很大的變革，但是總異戊酰螺旋霉素組份的含量卻大大進步了(尤其是異戊酰螺旋霉素III的含量)。2.4Val、Ile及Leu對胞外短鏈脂肪酸前體的影響必特螺旋霉素是由短鏈脂肪酸單體經聚酮合成酶頭尾縮合而成。必特螺旋霉素內酯環的生物合成必要8個前體5個乙酸，1個丙酸，1個丁酸和1個未知前體(二碳單位)，這些短鏈脂肪酸的濃度對必特螺旋霉素生物合成有較大影響。Fig.6(A)表現，添加了Val和Ile使胞外乙酸濃度敏捷增長，且出現不竭上升的趨勢。添

19、加了Leu對乙酸濃度變革影響不大，乙酸在72h以后才出現積聚。丙酸變革如Fig.6(B)，添加Leu以后，胞外的丙酸水安然平靜比擬根本上相似；添加Ile以后，丙酸出現了一段時間的積聚，到達4.5l/L，之后小幅落落，終極發酵竣事時丙酸水安然平靜Leu差不多，都要高于比擬。添加了Val之后丙酸遲鈍增長，并在72h達峰值27l/L，隨后又漸漸落落，發酵竣事時要低于比擬。異戊酸的變革趨勢如Fig.6()所示，添加Leu以后胞外異戊酸濃度急劇增長，在84h到達最大值1.66l/L，隨后落落為0.9l/L。添加Val和Ile以后異戊酸濃度略底于比擬。丁酸變革趨勢如Fig.6(D)所示，添加Val以后丁酸

20、增長到14l/L，48h后敏捷低落，維持在6.28.6l/L范疇內變革。添加Ile以后丁酸濃度始終高于比擬，約莫維持在1319l/L。Leu的變革趨勢和比擬根本相似。添加Val促進了糖耗速率，丙酮酸羧化酶活性變革以及乙酸數據都表白，添加Val可以促使胞內天生的丙酮酸轉化為草酰乙酸。草酰乙酸到場丙二酰A和甲基丙二酰A的合成，不但提供了內酯環合成所必要的三碳前體，同時還大概緩解底物按捺效應，使多余的二碳前體(如乙酰A和丙酰A)可以或許在酰基羧化酶的作用下進一步轉化成為丙二酰A和甲基丙二酰A，促進大環合成，進步生物效價。添加Ile后，其剖析代謝物以乙酸、丙酸的情勢排泄到胞外，且丙酰螺旋霉素III、乙

21、酰螺旋霉素II以及異丁酰螺旋霉素的含量顯著進步。添加Ile后效價落落和非異戊酰等其他酰化組分進步，說明只管Ile代謝提供了很多的二碳和三碳單位(乙酰A和丙酰A)，但是這些前體無法有用的進一步轉化為內酯環合成的直接前體(如丙二酰A和甲基丙二酰A)，而是結合到4位。添加Leu對乙酸、丙酸變革趨勢沒有明顯影響，只有丁酸出現了少量的積聚，效價也沒有產生很大的變革，而異戊酰基螺旋霉素組分的相比擬例得到了很大程度的進步，說明Leu顛末剖析代謝以后產生的異戊酰基A也可以作為螺旋霉素4的側鏈前體。3討論大環內酯類抗生素的內酯環的形成必要乙酸、丙酸、和丁酸作為前體物質。這些前體物質重要泉源于糖酵解途徑、三羧酸循

22、環、脂肪酸以及氨基酸代謝(螺旋霉素生物合成途徑見Fig.7)，在低級代謝與次級代謝之間飾演著極其緊張的腳色，是接洽低級代謝與次級代謝的橋梁。本文重要觀察Val、Ile和Leu的添加為必特螺旋霉素的生物合成提供了直接的前體，同時還差異程度滋擾了菌體的代謝。菌體細胞對這三種氨基酸差異的氨基使用方法造成了對糖代謝的差異。在本實行中，菌體對這三種氨基酸的使用環境是有所差異的。起首我們創造，添加Val以后并沒有引起造就基pH的升高，而添加Leu和Ile之后造就基的pH卻不停要高于比擬(Fig.3A)。通過觀察發酵液中的銨離子濃度(Fig.3B)的變革，添加了Ile和Leu以后發酵液中的銨離子濃度與添加了

23、Val后銨離子濃度也有顯著差異，而添加以后發酵液中的銨離子濃度和比擬根本同等。Velker等14以為，Val被汲取以后顛末第一步的轉氨反響，將Val的氨基部門繼承使用，剩下的碳骨架(即-酮基異戊酸)被臨時排泄出到造就基中，在細胞中的銨離子耗盡以后，-酮基異戊酸又被重新汲取使用。菌體對Leu和Ile是通過脫氨作用先將氨基部門排泄出胞外之后直接使用氨基酸的碳骨架。研究創造，添加支鏈氨基酸未能引起菌濃的增長，而是顛末代謝變化為必特螺旋霉素生物合成的前體。通過盤算，參加的三種氨基酸完全剖析形成相應的A約莫是合成必特螺旋霉素所需量的510倍，因此，其剖析代謝產物為必特螺旋霉素生物合成所提供的前體是完全富

24、足的。假設這些短鏈脂肪酸前體無法轉化為內酯環所需的直接前體(甲基丙二酰A、丙二酰A和乙基丙二酰A)，那么在胞內產生積聚，終極以短鏈脂肪酸的情勢排泄出胞外(Fig.5)，必特螺旋霉素內酯環的生物合成也無法順遂舉行，效價也無法進步。添加Val，顛末轉氨反響大概在必然程度上刺激了糖代謝體系的酶活15，加速了菌體對糖的使用，為內酯環的合成提供碳源。Val還可以通過以谷氨酰胺合成酶為中央的轉氨基反響為必特螺旋霉素內酯環糖苷側連提供N原子16。丙酮酸羧化酶活性變革以及乙酸數據(Fig.6A)表白，添加Val可以促使胞內天生的丙酮酸轉化為草酰乙酸。草酰乙酸到場丙二酰A和甲基丙二酰A的合成，不但提供了內酯環合

25、成所必要的三碳前體，同時還大概緩解底物按捺效應，使多余的二碳前體(如乙酰A和丙酰A)可以或許在酰基羧化酶的作用下進一步轉化成為丙二酰A和甲基丙二酰A16，促進大環合成。發酵歷程中也出現發酵液中丙酸、丁酸先積聚再使用的征象，重新使用的有機酸重要促使內酯環的合成，因此，添加Val促進了必特螺旋霉素生物效價的進步。添加Val促進丁酰螺旋霉素組分也有必然程度的增長，大概是由于丁酰基側鏈來自Val，Venzina等17在柱晶白霉素生物合成歷程中也證實白這一點假設。添加Ile對菌體的糖耗速率落落，必特螺旋霉素生物效價有顯著的按捺，但是丙酰螺旋霉素III、乙酰螺旋霉素II以及異丁酰螺旋霉素的含量有顯著的增長。由于TA循環中的甲基丙二酰A消旋酶和異構化酶易受到Ile的按捺18，因此，TA循環中產生的琥珀酰A更多以琥珀酸的情勢排泄到了胞外，而未能進一步變化為甲基丙二酰A，丙酮酸羧化酶(P