1、第四章 微生物的遺傳重組（基因重組育種）第一節 轉化第二節 細菌的接合第三節 轉導第四節 真菌的有性生殖 第五節 真菌的準性生殖第六節 原生質體融合育種2定義：由于不同DNA鏈的斷裂和連接而產生DNA片段的交換和重新組合，形成新的DNA分子，進而形成新遺傳個體的方式稱為基因重組( gene bination)。作用：基因重組可使生物體在未發生突變的情況下，也能產生新遺傳型的個體。3重組與雜交的關系重組是分子水平上的一個概念，可以理解成是遺傳物質分子水平上的雜交而一般所說的雜交（hybridization）則是細胞水平上的一個概念。雜交中必然包含著重組，而重組則不限于雜交這一形式。4體內基因重組

2、的方式原核微生物 轉化 Transformation 轉導 Transduction 接合 Conjugation真核微生物 有性生殖 Sexual reproduction 準性生殖 Parasexual reproduction體外基因重組基因工程5基因重組是基因重組育種的理論基礎基因重組育種的優點：由于選用了已知性狀的供體菌和受體菌作為親本，因此，不論在方向性還是自覺性方面，均比誘變育種前進了一大步。往往還可以消除某一菌株在經過長期誘變處理后所出現的產量上升緩慢的現象，因此，它是一種重要的育種手段。6菌株甲生長快、產量低基因重組新菌株生長快、產量高菌株乙生長慢、產量高基因重組育種的缺點：

3、 由于方法較復雜，工作進展較慢，還很難像誘變育種技術那樣得到普遍的推廣和使用，尤其在原核生物的領域中，應用轉化、轉導或接合等重組技術來培育可應用于生產實踐上的高產菌株的例子還不多見。到了70年代后期，由于原生質體融合技術獲得巨大的成功后，才使重組育種技術獲得了飛速的發展。重 組廣義：指由于獨立分配或交換在后代中出現新的基因組合的過程。狹義：僅指基因交換或重排而產生的重組。 重組的主要類型 同源重組 位點特異性重組 轉座重組*細菌遺傳物質的傳遞方式轉化：受體菌直接攝取來自供體菌的游離DNA片段，并將其整合到自己的基因組中，從而獲得部分新的遺傳性狀的基因轉移過程，稱為轉化。接合：供體與受體細胞直接

4、接觸，借性纖毛傳遞DNA，在受體細胞中發生交換、整合，使之獲得供體菌的遺傳性狀的現象，稱為接合。轉導：以噬菌體作媒介，將供體細胞的DNA片段攜帶到受體細胞中，通過交換與整合，使后者獲得前者部分遺傳性狀的現象稱為轉導。第四節 真菌的有性生殖Sexual reproduction一、順序排列的四分體的遺傳學分析1、粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)的生活史菌絲體無性繁殖 有性繁殖 順序四分體: 在減數分裂過程中形成的孢子不僅共處于一個子囊中，而且它們是依次直線排列在子囊中，因此稱為順序四分體。2、有性繁殖過程中著絲粒的分離情況 3、還原分裂和均等分裂還原分裂：來自同一親本的兩上基因趨

5、向同一極的分裂。均等分裂：來自同一親本的兩個基因分別趨向兩極的分裂。 4、基因的第一次分裂分離和第二次分裂分離第一次分裂分離：還原分裂，均等分裂 原因：基因與著絲粒之間未發生交換 第二次分裂分離：均等分裂，還原分裂 原因：基因與著絲粒之間發生了交換 第一次分裂分離第二次分裂分離5、著絲粒距離： 某一基因與著絲粒之間的距離著絲粒距離=重組染色單體數100染色單體總數=2 第二次分裂分離子囊數1004 子囊總數=第二次分裂分離子囊數1100子囊總數2二、非順序排列的四分體的遺傳學分析1、子囊類型 PD、NPD、T從可能性上： 不交換 單交換 雙交換 PD T PD/ T/ NPD結論： 若：PDN

6、PD，而且NPD/T 較小 則：兩基因連鎖！（2）重組頻率AB重組頻率 =(重組染色單體數/染色單體總數)100% =(1/2T+NPD)/(PD+NPD+T)100%20第五節真菌的準性生殖 Parasexual reproduction準性生殖是指異核體細胞中兩個遺傳物質不同的細胞核可以結合成雜合二倍體的細胞核。這種雜合二倍體的細胞核在有絲分裂過程中可以發生染色體交換和單倍體化，最后形成遺傳物質重組的單倍體的過程。準性生殖是使同種生物不同菌株的體細胞發生融合，不經過減數分裂而導致基因重組的生殖過程。21準性生殖是絲狀真菌，特別是不產生有性孢子的絲狀真菌如半知菌類特有的遺傳現象。是介于有性與

7、無性之間的一種生殖方式。能進行準性生殖的微生物： Aspergillus nidulans; Asp. niger; Asp. sojae Penicillium chrysogenum; Fusarium oxysporum22準性生殖的過程 異核體形成； （雜合）二倍體形成； 體細胞交換和單元化一、異核體的形成1、異核體異核體細胞：并存有兩個不同遺傳性狀的核的細胞異核體菌絲體：由異核體細胞構成的菌絲體異核體的無性繁殖：產生親代類型的單倍體分生孢子 異核體的生物學意義：具有生長優勢；可以儲備隱性突變 2、異核體的形成(1) 選擇親本 A. 親緣關系近 B. 生活力、產生分生孢子的能力及數量相

8、似 C. 帶不同的遺傳標記(2) 創造形成異核體的條件 A. 限制性培養基 B. 孢子混合數量：10610826（3）異核體的證實異核體的營養互補作用：兩個基因型不同的細胞核處在同一個細胞中，在代謝過程中互為對方提供對方所缺陷的生長因子的現象。互養作用：雙方產生的代謝產物通過培養基滲透擴散，互為對方提供對方不能合成的營養因子，使二者同時在基本培養基中生長。27二、（雜合）二倍體的形成1、形成：將106 107個異核體的分生孢子涂至MM上，長出的少數菌落即為二倍體 2、檢出： 避免異核體分生孢子重新形成異核體的措施MM要十分純正采用具有分生孢子顏色突變型和營養缺陷型作遺傳標記例：Asp. nid

9、ulans 分生孢子顏色突變 w+y- :黃色 w-y+ : 白色 w+y+: 綠色異核體： A-B+w+y- A+B-w-y+產生A-B+w+y-(黃色)和A+B-w-y+(白色)分生孢子 A-B+w+y- A+B-w-y+二倍體：產生A+B+w+y+(綠色)分生孢子3、二倍體孢子與單倍體孢子的區別單倍體孢子二倍體孢子直徑(m)體積(m3)核數/孢子直徑(m)體積(m3)核數/孢子Asp. nidulans3.1516.31.04.033.51.0Asp. niger4.547.71.05.482.41.0Asp. sojae-1354.22-1282.21Asp. oryzae-3.5-1

10、.9P. chrysogenus3.726.91.04.961.91.0三、體細胞交換和單元化 二倍體在有絲分裂過程中發生基因重組，使隱性基因得以表達，由此產生各種類型的分離子。1、體細胞交換與體細胞重組體（1）體細胞交換(somatic crossing-over)：在有絲分裂過程中同源染色體發生的交換。由此導致部分基因的純合化。（2）體細胞重組體：通過體細胞交換而形成的分離子。離著絲粒愈近的基因純合化的機會愈小，愈遠則愈大；著絲粒一端基因的純合化不影響著絲粒另一端基因的純合化。2、單元化過程與非整倍體及單倍體分離子（1）單元化過程：雜合二倍體在有絲分裂過程中通過一系列染色體不離開行為而產生

11、非整倍體分離子及最終單倍體分離子的過程。二倍體(2n) 三體(2n+1)+單體(2n-1) (非整倍體分離子） 2n+ 1 2n (二倍重組體分離子) 2n - 1 2n-1-1 n (單倍重組體分離子)(2) 單元化與連鎖群 A. 體細胞交換和單元化是兩個獨立的事件，發生在同一細胞中的概率很小； B. 同一染色體上發生兩次交換的概率很小；因此：若一條染色體兩臂上的基因同時出現純合化現象，可能是單元化的結果； 若某一基因隨著一條染色體兩臂上的基因的純合化而呈現純合，則為同一個連鎖群。3、體細胞交換與單元化的區別(1) 分離子及其來源二倍體分離子：來源于體細胞交換及單元化非整倍體分離子：來源于單

12、元化單倍體分離子：來源于單元化(2) 二倍體分離子與單倍體分離子判別Asp. nidulans二倍體分離子體積大(3) 二倍體分離子與非整倍體分離子判別非整倍體分離子在無性繁殖子代中繼續出現另一基因的分離(4) 發生概率有性生殖與準性生殖的區別有性生殖 準性生殖 導致有性孢子的產生，其形態、生理均與營養體細胞不同，往往產生在特殊的囊器中 導致重組體細胞產生，其和一般營養體細胞相同，不產生在特殊的囊器中 減數分裂導致基因重組，減數分裂中染色體交換和減半是有規律的協調過程，是必然的 有絲分裂導致基因重組，有絲分裂中，染色體交換和減少是不規則且不協調的過程，是偶然的 微生物中導致基因重組的各種形式

13、基因重組 涉及范圍供體和受體間的關系整個基因組部分染色體個別或少數基因細胞融合或連接性細胞真菌的有性生殖體細胞真菌的準性生殖細胞暫時溝通細菌接合F因子轉導細胞不接觸轉導轉化42第六節 原生質體融合技術原生質體Weibull等于1953年首次用溶菌酶處理巨大芽孢桿菌細胞獲得原生質體，并首先提出原生質體的概念 。細胞壁被酶水解剝離，剩下由原生質膜包圍著原生質的部分稱為原生質體（protoplast）。 protoplast 與spheroplast原生質體基本保持原細胞結構、活性和功能，具有細胞的全能性，但由于不具有細胞壁，所以原生質體不能分裂，對滲透壓特別敏感 。Macquillen于1955年

14、首次發現巨大芽孢桿菌原生質體的再生方法，使之恢復成正常的細胞并繼續生長繁殖。 一、原生質體融合育種原生質體融合育種是將雙親株先經酶法破壁制備原生質體，然后用物理、化學或生物學方法，促進兩親株原生質體融合，經染色體交換、重組而達到雜交目的，通過篩選獲得集兩親株優良性狀于一體的穩定融合子。經過30余年的發展，原生質體融合已經從菌株內、菌株間的融合發展到種內、種間的融合，打破了種屬間的親緣障礙，實現了屬間、門間，甚至跨界的基因重組。 1、原生質體融合育種的優勢重組頻率高：放線菌、霉菌：10-110-3，酵母：10-410-5 ，細菌：10-510-6 重組的親本范圍擴大：受接合型或致育型限制小，可以

15、實現種、屬、門間基因重組融合子集中兩親本優良性狀的機會增大：遺傳物質的傳遞更為完善，三親本、甚至多親本的原生質體融合可以實現二、原生質體融合育種的方法親本及其遺傳標記選擇；原生質體制備；原生質體誘導融合；原生質體的再生；融合重組體（融合子）的篩選1、親本及遺傳標記的選擇兩親株要有遺傳差異較大的良好的生產性狀，以便通過融合使優良性狀迭加 兩親株的親緣關系要近，基因重組的概率高 兩親株要帶有不同的遺傳標記，有利于融合子的檢出，或采用對一個親株加熱滅活 親本標記：營養缺陷型或抗藥性等；自然標記；細胞質遺傳標記：小菌落、Killer等；生產性狀本身。2、原生質體的制備制備大量具有活性的原生質體是微生物

16、原生質體育種的前提。活性原生質體制備的過程包括原生質體的分離、收集、純化、活性鑒定和保存等操作步驟。 （1）原生質體分離 原生質體分離是指去除細胞壁使原生質體從細胞中釋放出來的過程。酶法破壁是最有效、最常用的原生質體分離方法。 基本操作： 菌體培養洗滌懸浮于高滲溶液酶解原生質體釋放原生質體收集菌體培養：對數期細胞菌體前處理： 在培養基中或菌懸液中加入某些物質對菌體進行處理，以抑制或阻止某種細胞壁成分的合成，使細胞壁結構疏松，有利于酶滲透到細胞壁中進行酶解絲狀真菌：可使用b-巰基乙醇酵母菌： 1%巰基乙醇和1% EDTA放線菌：1-4%甘氨酸；細菌：通常加入亞致死量的青霉素，酶處理破壁破壁用酶：

17、 原核微生物：溶菌酶（lysozyme） 霉菌：蝸牛酶、纖維素酶 酵母菌： Zymolyase-20T、蝸牛酶、b-葡聚糖酶酶濃度： 菌種：細菌0.10.5mg/ml， 鏈霉菌1mg/ml溶菌酶。 生長階段： 大腸桿菌對數期0.1mg/ml，饑餓狀態0.25mg/ml溶菌酶酶解條件：溫度、pH、時間等滲透壓穩定劑（高滲保護、種類）； 考慮再生，脫壁不能太完全。滲透壓穩定劑KCl、NaCl、MgSO4、CaCl2、蔗糖、甘露醇、山梨醇等細菌多使用蔗糖或NaCl，鏈霉菌經常使用蔗糖，而酵母菌則可使用山梨醇或KCl使用的有效濃度為0.31.0mol/L微生物原生質體形成模式 原生質體形成率=（A-B

18、）/A100% 方法一：血球計數板計數 A：高滲溶液中細胞數 B：水溶液中細胞數 方法二：平板菌落計數 A：高滲溶液稀釋后在再生培養基上CFU B：水溶液稀釋后在再生培養基上CFU原生質體的鑒別方法 低滲爆破法 熒光染色法 原生質體活性的鑒別 熒光素雙醋酸鹽（FDA)染色法原生質體收獲絲狀菌：紗布或擦鏡紙過濾，洗滌，懸浮于高滲液中；單細胞微生物：離心 ，洗滌，懸浮于高滲液中原生質體的保藏制備好的原生質體最好立即使用 加入5%的二甲亞砜(DMS)或甘油等保護劑，迅速降溫可保藏于液氮或-70-80冰箱 3、原生質體的誘導融合 將等量的原生質體混合于含有促融合劑PEG、Ca2+、Mg2+、滲透壓穩定

19、劑的緩沖液中，保溫一定時間，原生質體就會發生融合低劑量紫外線照射融合液可顯著增加融合頻率 適用于促進原生質體融合的PEG的相對分子質量為10006000，常用濃度為3050% 電融合： A. 原生質體在電場中極化成偶極子，沿電力線方向排列成串 B. 外加瞬間高頻直流強電壓，以50ms的時程脈沖沖擊原生質體粘連點，擾亂原生質體膜的分子排列，使之穿孔，相連的原生質體發生融合酵母菌的融合操作將兩種原生質體以1:1混合達到108細胞/ml，以2000r/min的轉速離心15分鐘收集原生質體將其懸浮于含有0.6mol/L KCl、30%PEG6000、10mmol/L CaCl2的10mmol/L pH

20、 6.8磷酸緩沖液中，30保溫60分鐘，此時原生質體凝集到一起3000r/min 離心15分鐘收集凝集塊，以0.6mol/L KCl洗滌，再在5放置60分鐘以達到完全融合 原生質體融合的影響因素親株的親和力和原生質體的活性 融合劑：不同種類微生物對PEG分子量的要求不盡相同 物理融合劑：電場和激光 溫度：絲狀真菌：30 細菌：4或20 放線菌：常溫（約20）融合處理時間：1min-1h，但大多數微生物110 min無機離子： 一定濃度的Ca2+、Mg2+能有效地促進融合 4. 原生質體的再生是指原生質體重建細胞壁，恢復細胞完整形態并能生長、分裂的過程。再生率10-310-1再生培養基：加入滲透

21、壓穩定劑，不同微生物其再生培養基不同。再生需要一定的細胞壁做引物。影響再生的因素：再生培養基及培養條件；原生質體制備方法及條件5. 融合子的檢出與鑒定融合子的選擇利用遺傳標記：營養缺陷型，抗性標記利用滅活的原生質體 (例如 5023h)利用熒光染色采用選擇性培養基進行檢出。對是否是真正融合子進行鑒定：發生核融合后穩定，而不進行核融合形成的異核體不穩定。 6. 目標重組子的篩選 原生質體融合技術的應用（1）高產優良菌株的選育例：親株：乳糖發酵短桿菌親株1：產谷氨酸，DCr(德夸菌素)，KMr ( 酮基丙二酸)，發酵速度快；親株2：產賴氨酸，AECr，發酵速度慢 (100h)融合子： DCr KM

22、r AECr，發酵速度快(30h)， 產賴氨酸提高3倍（2）合成新的產物三、其它原生質體技術（1）原生質體誘變育種：以脫去細胞壁的原生質體作為處理對象的誘變育種方法。優點 1）提高微生物對誘變劑的敏感性； 2）提高正變株的變異幅度，使誘變效果提高 3）對于絲狀微生物，原生質體可作為單個細胞 單位而便于控制，避免后代過多的分離現象缺點 1）誘變后原生質體再生較慢，因此較常規誘變 育種耗時長； 2）不適用于以青霉素淘汰野生型對營養缺陷 型突變體進行濃縮。其它原生質體技術（2）自學原生質體再生育種：通過菌體細胞脫壁后直接再生來改變菌株的遺傳特性，提高產量或改良某些性狀的育種方法。特點：正變率較高。原

23、生質體轉化：以原生質體作為受體菌轉化DNA分子的過程。優點：1）感受態容易建立，維持時間長； 2）對轉化DNA要求較低。原生質體的固定化小結原生質體育種是一種新興的技術消除了細胞壁的影響實現了遠親微生物的基因重組實現了多親本微生物的基因重組小結:遺傳角度討論微生物多樣性 “微生物基因重組方式的多樣性”基因重組：遺傳重組是指遺傳物質從一個細胞向 另一個細胞傳遞并導致DNA交換和重排的過程。重組的主要類型同源重組、位點特異性重組、轉座重組*微生物中遺傳物質的傳遞方式： 真核微生物：有性生殖和準性生殖 原核微生物：接合、轉化、轉導 遺傳重組的方向、重組的范圍、重組的頻率 細胞之間是否接觸 微生物中導致基因重組的各種形式 基因重組 涉及范圍供體和受體間的關系整個基因組部分染色體個別或少數基因細胞融合或連接性細胞真菌的有性生殖體細胞真菌的準性生殖放線菌接合細胞暫時溝通細菌接合