1、 （一） 眼球晶狀體結構、性質和功能的關系 晶狀體相當于一個透鏡。但是，這個“透鏡”要有特殊的結構和性質以滿足特殊功能的要求。首先，它必須沒有吸收可見光的能力（無色的），還要沒有散射光的能力，要有一定的折射率，要能變焦。這些是這個透鏡的物理要求。從化學上說，應該穩定，不發生相變。從生物學上說，從胎兒到嬰兒到成年，晶狀體必需隨年齡發育成長，那就需要細胞參與。但是這里有矛盾：既要細胞參與又要沒有散射和吸收可見光。如何解決？ 眼球晶狀體（lens）從結構和性質上基本上滿足了這些要求。粗略地說，它是由一層上皮細胞構成的膜包著一個高濃度（35%-40%）的晶狀體蛋白的溶液。細胞從前方分裂，被推向兩側，轉

2、向中央，變成失去細胞核的纖維細胞。這些纖維集中在晶狀體中央成為晶狀體核。這樣形成的晶狀體在結構上和組成上的特征是： （1）沒有血管，否則血管和血液成分會造成光吸收和光散射。 （2）只有一層由上皮細胞構成的膜，由它們負責合成CR,并且包容晶狀體。這種細胞只在生長區（前方）分裂，推動細胞，向赤道方向移動。到達赤道后，便失去分裂功能，代謝停止。而此時分化開始，細胞失去核并延長成纖維，纖維向內集中成為晶狀體核的一部分。到達這里，細胞分化停止。這一巧妙的機制使眼球得以發育，CR不斷供應。但是這些功能的細胞不能像其他組織那樣增長，始終只有一層膜上的上皮細胞在工作。 (3)CR的結構決定了它在溶液中不能有、

3、也不能產生造成光散射的蛋白質聚合物、締合物以及其他難溶物。一般來說, 蛋白質的巰基容易形成二硫鍵, 從而形成難溶蛋白質聚合物。蛋白質構象也容易改變,特別是線性分子。球蛋白構象不易變, 但它們又是在很大程度上依賴二硫鍵結合維持構象。因此,這是一矛盾。CR是一組蛋白,包括A1,A2,B1,B2,H,L,等等。在白內障病理過程中主要靶分子是CR。CR單體相對分子量28000,是可溶性球蛋白。它的結構特征是, 富含芳香氨基酸殘基(色氨酸,酪氨酸,苯丙氨酸)及含硫氨基酸(甲硫氨酸,半胱氨酸),但少二硫鍵, 少螺旋,多折疊。以上種種都為維持和保護結構,穩定構象起重大作用。(4) 在組成上,晶狀體中氧分壓低

4、, 維生素C 含量高。皮質內GSH 高,其次為核,再次為上皮細胞。它們(還有SOD等酶)構成抗氧化機制, 能在一定范圍內防御ROS造成氧化性損傷和交聯。 (二)白內障病理過程中的靶分子 1.晶狀體蛋白 CR 是主要靶分子。它富含芳香族氨基酸和含硫氨基酸,特別是半胱氨酸殘基。這些殘基既是作用靶點,也起保護作用。前面講過,要維持球蛋白構象不易變(剛性比較大),需要半胱氨酸形成的二硫鍵。半胱氨酸與交聯二硫鍵之間的轉變是一個可逆過程,為光輻射催化,也為ROS推動。 ROS,h CR-SH CR-S-S-CR單從這一反應看,二硫鍵的增加會導致交聯度增加、構象改變以及分子聚集態改變。但事實上, 生活在光照

5、之中并且不斷接觸ROS并沒有造成晶狀體內發生影響視力的變化。這是因為CR 分子有一套自我保護的結構特點,在晶狀體內也有一套保護系統(如GSH、NADPH等)。因此ROS能夠被及時清除, 交聯物能夠被及時逆轉。但是白內障患者晶狀體蛋白的-S-S-含量增加,而且,隨著病情發展,越來越不能逆轉。甲硫氨酸殘基的硫醚鍵可以被氧化成亞楓 : -SCH3 -S-CH3色氨酸殘基在CR氧化上起兩種作用。第一,它和酪氨酸、苯丙氨酸等芳香族氨基酸殘基一起起著電子受體的作用。當巰基在光照下變成二硫鍵時,釋放的電子在蛋白質結構深處, 這些電子被缺電子的芳香環接受。為-S-S-逆轉為 -SH保留所需的電子,因而起著保護

6、作用。但是,色氨酸(酪氨酸和苯丙氨酸不是)可以起光敏化劑的作用,把基態氧變成單線態氧,成為光致白內障的觸發環節(見后)。 雖然蛋白質的氨基不是ROS主要靶部位,但是由磷脂過氧化產生的羰基化合物,如丙二醛,可以與氨基形成 Schiff堿,使蛋白鏈交聯,水溶性下降。不過與CR的氧化性交聯比,后者貢獻小。 ROSO2.磷脂 前面已經講過,細胞膜是一個以磷脂雙層為基質的雙層膜。磷脂容易在ROS作用下發生過氧化,造成膜損傷。而且通過花生四烯酸代謝級聯反應產生一系列降解物,其中有些可以造成蛋白質之間、磷脂與蛋白質之間的非氧化性交聯。膜損傷造成細胞內外離子平衡(ionic balance)改變,致使K+ 漏

7、出和Na+流入,Ca2+流進使細胞內游離Ca2十濃度增加,CR和其他蛋白質聚集沉淀。為抵消 Ca2+濃度增加和K+、Na+離子濃度異常,Na+/K+ATP酶和Ca2+/Mg2+ATP酶必須加緊工作。因此迅速消耗ATP,造成ATP耗竭。 (三)白內障自由基機理的提出1.證據 白內障病理過程中, 晶狀體的以下變化都提示ROS的參與: (1)引發白內障形成的因素都可以促進ROS的產生,如紫外線、博萊霉素等。 (2)在白內障患者晶狀體內可測出自由基信號,并可測出H202濃度的增高。 (3)在白內障晶狀體IR-拉曼光譜中可看到 SH含量減少, -S-S-含量增多。 (4)用抗氧化劑SOD可減輕白內障發展

8、。 (5)白內障晶狀體內GSH含量下降。 另外,用過氧化氫處理晶狀體,使其產生白內障時,可見膜損傷引起的 Na+/K+ATP酶損傷(Na+結合部位受損),K+ 流入被抑制,細胞外K+增多,Na+對ATP 水解控制能力減少,ATP耗竭,糖酵解增加。2.GSH與白內障的關系 前面講過,白內障晶狀體內GSH含量下降。在ROS推動白內障的機理中,GSH所起的作用有幾個可能 : (1)本來蛋白質與蛋白質之間容易通過巰基變成二硫鍵而聚集。不過,在一般情況下,GSH可以使反應逆轉,維持巰基狀態 : PSH P-S-S-P GSSG GSH 那么GSH水平的降低,就會引起蛋白質交聯度的提高。GSH水平下降可以

9、是因消耗在處理ROS中,也可以是由于其他原因。 (2)膜兩側離子平衡紊亂提示離子通道、離子泵受損傷,因為這些膜蛋白參與離子轉運,也決定膜的通透性。這些蛋白質的構象與裝配都與它們的巰基狀態有關。如前所述,維持巰基狀態需GSH。(3)GSH作為GSHpx 的輔助因子, 清除過氧化氫及過氧化物。 以上3個問題雖不能作為ROS機理的直接證據,但支持ROS機理。 在晶狀體內有較高濃度的GSH,就是為了保護蛋白質(保護它的構象)。維持GSH 濃度的第一條件是合成。合成GSH的第一步是在-谷氨酰半胱氨酸合成酶(-glutamyIcysteine synthetase)作用下,使Glu與Cys結合成-谷氨酰半

10、胱氨酸,然后再一步與Gly結合生成GSH。這都需要ATP。大部分ATP來自糖酵解。在能量被大量消耗,缺氧情況下,ATP水平就低,GSH合成就受影響。營養不良成為白內障的危險因子可能就是因為這個原因。除GSH合成減少外,影響GSH 水平或GSH/GSSG比的另一重要原因是GSH被氧化。ROS和其他氧化劑都能使GSH減少,GSSG增多。但是,前面講過,只要反應停留在GSH GSSG之間,就可以被一系列細胞內還原電勢維持系統所恢復。這一系列的末一步是己糖磷酸旁路,因此與糖代謝有關。所以糖代謝有兩重意義,一是與ATP有關,一是與GSH 有關。不過這并不是糖致白內障產生的主要原因。3.Spector 設

11、想 Spector把以上所講的幾個因素聯系在一起,提出了一個由ROS觸發的白內障發生機理。如圖1所示。他設想: 一方面,ROS損傷膜結構、改變膜通透性,影響離子平衡,消耗ATP; 另一方面,直接作用于晶狀體蛋白, 使蛋白氧化交聯聚集。雖然有很多證據支持ROS 的參與,但是白內障發生發展過程并不像 Spector 所想的那么簡單。不同白內障雖然在結果上都是CR變性,但在誘因和反應過程中均代謝損傷 ATP水平下降有所不同,因此在病情發展過程中,出現的癥狀變化不同。下面我們就最常見的光致白內障和糖致白內障從分子水平討論。ROS 膜損傷 膜通透性改變 離子平衡受干擾 直接對蛋白氧化 CR中高分子量 聚

12、集物形成 圖1 白內障病理過程的Spector設想(四)光致白內障的ROS機理 光致白內障是由紫外照射所引起。強紫外線照射引起的不可逆轉的CR變化是這種白內障的特征; 而短時的、弱的紫外照射(實際上人總要接受一些紫外線) 引起的變化是可逆的,不能構成白內障。但小劑量長時間照射(包括老年人一生幾十年中在日光下生活和工作)也易形成白內障。老人中絕大多數有不同程度的白內障,原因之一是一生中所受的低劑量照射。 光致白內障有一個獨特的表現,就是晶狀體核呈棕色。因此,它不只是CR交聯問題。 光致白內障病理過程包括在膜、晶狀體和核三個部位發生的事件。 1膜上的事件 膜上發生的事件是ROS誘導的膜損傷過程。在

13、這里ROS基本上不是由細胞的吞噬作用產生,差不多完全是UV 照射引起的。UV照射啟動自由基反應后,發生脂質過氧化并且ROS轉化、增殖,引起一連串反應。反應一經發生便難以Na,K-ATP酶 Ca泵 蛋白質交聯與聚集ATP酶負擔蛋白質構象改變蛋白質結合相分離圖2 光致白內障發生發展中的生物學事件 終止。 ROS以及脂質過氧化產物中的二羰基化合物向膜蛋白及晶狀體內蛋白質進攻,使它們發生交聯或降解。這些事件與前面講過的原則上相同。 UV ROS 膜磷脂 脂蛋白 膜 丙二醛 膜蛋白交聯降解 光敏化劑 產生1O2 胞內K+ Na+ 胞內Ca2+ 產生熒光物質 胞內水 與晶狀體核 空泡 ATP消耗 光照 G

14、SH合成減少 ROS 光散射 S-S鍵形成增多 2.膜內外離子平衡的擾亂 這一過程和炎癥時發生的相近。主要是 Na+/K+ATP酶和Ca2+/Mg2+ATP 酶受損后工作能力下降,細胞內游離Ca2+濃度升高,K十濃度降低,Na+濃度升高。Ca2+濃度居高不下又引起一系列變化。這些都是普遍的事件。但是對眼球晶狀體來說, 可能有三個后續變化與白內障有關: (1)因為Na+/K+ 泵工作能力下降后,每次少進2個K十,就少出3個Na+,所以細胞內滲透壓增高,水進入細胞,細胞被破壞,形成空泡,導致相分離,光散射增加。 (2)Na+/K十泵與Ca2+ 泵為維持離子平衡,全力工作,導致ATP濃度下降,GSH

15、合成減少。雖然在別的細胞中也有這一事件, 但在這里,則因GSH 減少增加了ROS 對CR 氧化交聯的程度。 (3)細胞內Ca2+濃度增加也會引起蛋白質構象改變或凝聚。這三者都對白內障形成有貢獻,不過,都是間接的。3.晶狀體內CR的交聯 這是指 ROS 直接與CR 作用的結果,是所有白內障都具有的核心事件,包括疏基氧化成二硫鍵及與二羰基化合物縮合形成 Schiff 堿而交聯等。紅外和Raman光譜指示這一變化的進度。 4.晶狀體核內發生的事件 這是光致白內障的特點,也是核心問題。從本質講,光致白內障的發展要有某種光敏化劑在里面起作用。這種敏化劑能吸收一定波長的紫外光,把所得能量傳給基態氧,把氧變

16、成單線態,單線態氧再去氧化CR。這一反應本身并無特點。值得注意的是通過光敏化劑傳遞能量不是簡單的物理過程, 它是一系列化學變化的組合。我們在光致白內障晶狀體核中看到的棕色物質就是光敏化劑生成的熒光物質與核中的蛋白質(可能是已經交聯的蛋白質)結合的產物。這種棕色蛋白質帶著光敏化劑,就會在光照時繼續不斷地產生ROS, 把對CR 的氧化如此進行下去。 問題是光敏化劑從何而來?雖然它可以是外源的,但主要是眼球內部就有的。視網膜中的視紫紅質(rhodopsin)就可以吸收紫外線,把基態氧變成單線態氧。不過它的損傷部位主要在視網膜。在光致白內障發展中的前光敏化劑 (pro-photosensitizer)

17、 可能是蛋白質中的色氨酸殘基。在白內障晶狀體中色氨酸殘基的熒光強度下降,非色氨酸殘基熒光強度相對增加提示這一可能。實驗證明下面一系列變化的可能性(圖3) 。 P P P 1K 3K 3O2 圖3 色氨酸的光敏化作用和活性氧的生成CH2CH-COOH NH2NHROSO2-O2C-CH2CH-COOHO NH2COCH2CH-COOH NH2 NHHCONH2H2OUVUVUV犬尿氨酸熒光磷光1O2蛋白質 聚合N-甲酰基犬尿氨酸 色氨酸殘基本身不是光敏化劑,而是產生光敏化劑犬尿氨酸(kynurenine) 的前體。第一步,色氨酸殘基在光照下氧化開環,這是氧分子在光照下產生的超氧離子作用的結果。開

18、環后形成的N- 甲酰基犬尿氨酸 (N-formylkynurenine) 中的酰氨基不穩定,即水解生成犬尿氨酸。這是第二步反應。然后,便是犬尿氨酸的光敏化作用。它獲得紫外線提供的能量后,分兩步躍遷(lK及3K)。單線態的IK可以發出熒光回到基態,3K則發出磷光返回基態。放出的能量適于基態氧轉化為單線態,因此反復作用產生單線態氧,不斷氧化CR 及其他蛋白質。由犬尿氨酸產生的熒光物質即與核內蛋白質結合。而且由于ROS 的作用, 蛋白質可能已經交聯。所以熒光物質與已經變化的蛋白質結合而形成棕色蛋白質。 上面講的過程只說明光敏化機理,并不是說光致白內障就是由單線態氧造成的。在光致白內障中,ROS可能起

19、多重作用,不能認為只有一種特定的過程在起作用。 。(五)糖致白內障的 ROS 機理 糖致白內障是血中葡萄糖、半乳糖等濃度長期居高不下引起的白內障。除糖尿病外,有一種遺傳性疾病,半乳糖血癥。這種病的患者缺少一種能把磷酸化的半乳糖轉化為葡萄糖的酶 半乳糖1-磷酸尿苷轉移酶(galactose-l-phosphate uridyl transferase)。血中半乳糖持續濃度過高,也容易促使白內障發展。 兩種情況的最終結果是相同的白內障,說明某些糖類有誘導CR交聯變性的共性。 1.生物學事件的聯系 糖致白內障有兩個生物學事件特征。 (1)臟器轉移。糖尿病原發部位是胰臟的胰島部位,但由之引起血糖濃度過

20、高,經血循環使晶狀體葡萄糖濃度升高,從而把致病因子轉移到眼球,發展成白內障。這種從一個臟器發生的事件,通過物質傳遞在另一臟器產生新的病理過程很多。只要找到這個傳遞物質就可跟蹤其來龍與去脈。兩個部位的病理過程可能有先有后。比如并不是在糖尿病初期血糖一高就表現出白內障來, 這是因為造成不可逆損傷需要較長的時間過程。我們知道,損傷需要積累,而且是一慢過程。 (2) 病理過程的階段性。粗略地說,糖尿病引起白內障的早期(那時還不能算做白內障), 可以看到血糖濃度與晶狀體折光指數同步升降。這個過程是可逆的。在這個時期,為了把血糖降下來,大多數患者都服用降糖藥。但是在持續用降糖藥維持血糖不太高(事實上并非正

21、常)過程中,白內障卻在漸漸發展進入第二階段。這時可見晶狀體纖維細胞充水,破裂,產生空胞,視力明顯減退。經過在更長時期發展以后,也可以說到第三階段,開始見到蛋白質聚集而后成熟,形成白內障。在病理過程的可逆轉性上也有階段性。在抗氧化系統的工作能力范圍內,病理過程還是可逆的、可修復的。但當這個系統調控能力漸漸降低,ROS水平長期超過它的調控能力時,病理過程變成不可逆的。病情就是這樣發展的。 2.滲透壓增加說 有人曾從生物化學研究提出解釋糖致白內障形成的機制。其中心環節是晶狀體內糖濃度升高, 滲透壓增高,從而使細胞充水、破裂。但是其中有一個難以解釋的地方: 那就是既然葡萄糖是可以代謝的, 也是可以透過

22、膜而擴散出細胞的,為什么細胞內糖濃度高時糖不能被代謝掉,也不向細胞外擴散呢?己糖激酶產生糖致白內障的滲透壓學說的依據是葡萄糖正常代謝是在己糖激酶（hexose kinase）催化下磷酸化成葡萄糖-6-磷酸，后者再被氧化成二氧化碳。但是這條加工線處理葡萄糖的容量有限。在葡萄糖濃度超過這條限度時，多余部分就要走糖醇途徑代謝，即經醛糖還原酶（aldose reductase）把葡萄糖還原成山梨醇，再在山梨醇脫氫酶(sorbitol dehydrogenase)催化下，氧化成果糖。 NADP+ NADPH 葡萄糖 葡萄糖-6-磷酸 CO2（正常代謝）NADPH NADP+ NADP+ NADPH 醛糖還原酶 山梨醇 山梨醇脫氫酶 果糖（糖醇途徑） 滲透壓說認為，經糖醇途徑生成的山梨醇和果糖不能透過細胞膜，而儲留在胞內，使滲透壓增高。 血糖增高晶狀體葡