1、第五章 蛋白質(zhì)的定性定量檢測1第一節(jié) 免疫組織化學(xué)的基本理論第二節(jié) 蛋白質(zhì)的定量檢測第三節(jié) 免疫印跡法分析特定蛋白質(zhì)的相對含量第四節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）2一、形態(tài)學(xué)研究的方法（S）二、組織化學(xué)三、免疫組織化學(xué)第一節(jié) 免疫組織化學(xué)的基本理論3一、形態(tài)學(xué)研究的方法（S）（一） 普通光鏡術(shù)（二）特殊光鏡術(shù)1. 熒光顯微鏡2. 相差顯微鏡3. 暗視野顯微鏡 4. 激光掃描共聚焦顯微鏡（三）電鏡術(shù)1. 透射電鏡術(shù) 2. 掃描電鏡術(shù) 3. 冷凍蝕刻術(shù)（四）組織（細胞）化學(xué)術(shù)（五）免疫組織(細胞)化學(xué)術(shù)（六）原位雜交（七）細胞培養(yǎng)術(shù)（八）活體與活細胞染色（九）形態(tài)研究的定量術(shù)41. 常規(guī)方法：蘇

2、木素（Hematoxylin）-伊紅（Eosin）染色法/HE染色2. 特殊染色:（一）普通光鏡術(shù)（S）5HE染色6心肌細胞光鏡圖7小腦皮質(zhì)神經(jīng)元鍍銀染色8（二）特殊光鏡術(shù)（S）9始自于上世紀(jì)八十年代的，采用共聚焦顯微成像的原理，在熒光顯微成像的基礎(chǔ)上加裝了激光掃描裝置，再利用計算機進行圖像處理。可對組織細胞內(nèi)部進行立體斷層掃描，達到了動態(tài)觀察的一種全新的技術(shù)。有細胞CT之稱。激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)10（三）電鏡術(shù)（S）1. 透射電鏡術(shù) 2. 掃描電鏡術(shù) 3. 冷凍蝕刻術(shù)11漿細胞透射電鏡圖12血細胞掃描電鏡圖13（四）組織（細胞）化學(xué)術(shù)14（五）免疫組織（細胞）化學(xué)術(shù)15（六）原位雜交（S

3、）探針：DNA、RNA、寡核苷酸（ODN）標(biāo)記物：放射性核素；非放射性顯示：放射自顯影；免疫組化 16（七）細胞培養(yǎng)術(shù)（S）17（八）活體與活細胞染色（S）181. 形態(tài)計量術(shù)（體視學(xué)）2. 顯微分光光度術(shù) 3. 圖像分析術(shù) 4. 流式細胞術(shù)（九）形態(tài)研究的定量術(shù)（S） 19二、組織化學(xué)（histochemistry）組織化學(xué)（histochemistry）：以組織學(xué)為基礎(chǔ)，應(yīng)用物理和化學(xué)的技術(shù)方法顯示細胞組織結(jié)構(gòu)中的各種化學(xué)成分，并對這些物質(zhì)進行定位、定性和定量，從而分析研究生物體在生理或病理狀態(tài)下細胞和組織代謝、功能及形態(tài)變化規(guī)律的科學(xué)。20細胞化學(xué)技術(shù)能夠?qū)毎麅?nèi)的各種成分進行定性、定位

4、、定量研究，包括懸浮胸腹水細胞、血液細胞以及體外培養(yǎng)細胞均能產(chǎn)生同樣良好的效果。目前，用細胞化學(xué)技術(shù)所能顯示的化學(xué)成分有蛋白質(zhì)（顯示某些特定蛋白、某些氨基酸或功能基）、RNA、DNA、糖類（如糖原、粘多糖和糖脂等）、脂類（如中性脂肪、磷脂和固醇等）、酶（如磷酸酶）、特異抗原（其化學(xué)本質(zhì)可能是多肽、蛋白、糖蛋白等）、無機鹽和微量元素（如鐵、銅、鋅、鎂等）。 細胞化學(xué)技術(shù)（S）21細胞化學(xué)染色（S）原理：細胞中的化學(xué)成分和其相應(yīng)的底物呈一系列的化學(xué)反應(yīng)，形成于顯微鏡下可見到的反應(yīng)產(chǎn)物。常見的有：1. 孚爾根反應(yīng)法（Feulgen reaction）：顯示DNA呈現(xiàn)紫紅色。2. 甲綠-派郎寧法（Me

5、thyl Green-Pyronin method）：顯示核酸（甲綠染DNA呈現(xiàn)綠色，派郎寧染RNA呈現(xiàn)紅色）。3. 蘇丹冰凍切片染色：顯示中性脂肪呈現(xiàn)橘紅色。4. 普魯士藍反應(yīng)：顯示組織中含鐵血黃素。5. 過碘酸雪夫反應(yīng)（Periodic acid schiff reaction，PAS）：顯示糖原和其它多糖物質(zhì)為紫紅色。 22PAS23蘇丹染色24三、免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry）（一）免疫組織化學(xué)的概念（二）免疫組織化學(xué)的簡要步驟（三）抗原-抗體反應(yīng)（四）免疫標(biāo)記化學(xué)反應(yīng)與檢測（五）常用免疫組織化學(xué)染色方法（六）免疫組組織化學(xué)在臨床病理診斷中的應(yīng)用（S） 25免

6、疫組織化學(xué)：免疫學(xué)與組織化學(xué)相結(jié)合的一個分支學(xué)科，以免疫學(xué)的抗原-抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)的理論，其可作為蛋白質(zhì)定位、定性及半定量檢測的方法之一。免疫組織化學(xué)已被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科學(xué)研究和臨床診斷中。（一）免疫組織化學(xué)的概念26（二）免疫組織化學(xué)的簡要步驟1. 抗體（anbibody，Ab）的制備（1）抗原的提取和純化（2）免疫動物制備多克隆抗體或細胞融合制備單克隆抗體（3）抗體效價檢測和純化（4）標(biāo)記復(fù)合物的制備2. 抗原（antigen，Ag）的檢測（1）細胞或組織切片的制備（2）免疫組織化學(xué)反應(yīng)和顯色3. 結(jié)果觀察和記錄27抗原的提取與純化免疫動物或細胞融合，制備特異性抗體及純化標(biāo)記物復(fù)合物的制備標(biāo)

7、本的處理抗原抗體反應(yīng)和呈色反應(yīng)觀察和記錄結(jié)果28（三）抗原-抗體反應(yīng)抗原-抗體反應(yīng)：由抗原物質(zhì)刺激機體產(chǎn)生相應(yīng)的特異性抗體后，抗原和其特異性的抗體在體內(nèi)或體外發(fā)生結(jié)合反應(yīng)的過程。29利用抗原、抗體在體外可以發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的特點，將其應(yīng)用到細胞組織化學(xué)中，可對各種抗原或生物活性物質(zhì)進行分離及檢測。30（四）免疫標(biāo)記化學(xué)反應(yīng)與檢測免疫標(biāo)記化學(xué)反應(yīng)：用熒光素等發(fā)光劑、酶等呈色物或放射性核素等作為示蹤物標(biāo)記抗體分子，在適宜的條件下（即適宜的溫度和pH等），標(biāo)記抗體與抗原發(fā)生特異性的反應(yīng)。3132常用標(biāo)記物1. 熒光素（1）異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)IT

8、C）：綠色熒光；（2）四乙基羅達明：橙紅色熒光；（3）四甲基異硫氰酸羅達明：橙紅色熒光；（4）藻紅蛋白：紅色熒光2. 酶（1）辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）；（2）堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）3. 金屬標(biāo)記物：如膠體金，多用于免疫電鏡。 4. 放射性核素：涉及污染，防護難，一般不用。33檢 測酶等呈色物與一定的底物結(jié)合后，可以形成具有特殊顏色的化合物，即可知道呈色物標(biāo)記的抗體與相應(yīng)的抗原形成的復(fù)合物的存在情況。熒光物質(zhì)可以在高壓汞燈的激發(fā)下，發(fā)出特定顏色的熒光，可以在熒光顯微鏡下被觀察到。膠體金顆粒可以在透射電子顯微鏡（t

9、ransmission electron microscope，TEM）下觀察。放射性同位素可以使膠片感光，經(jīng)放射自顯影后就可以知道標(biāo)記抗體與抗原反應(yīng)的情況。34毛細血管內(nèi)皮細胞呈vWF陽性 （熒光素標(biāo)記）35 海馬細胞微管蛋白 綠色(胞體、樹突) 軸突終末蛋白 紅色(突觸)36培養(yǎng)的成纖維細胞（微管呈綠色，核呈藍色）37胰島B細胞呈胰島素陽性（辣根過氧化物酶標(biāo)記）38上皮細胞膜MAM-6蛋白電鏡圖示（膠體金標(biāo)記）39（五）常用免疫組織化學(xué)染色方法1. 直接法2. 間接法3. PAP法4. APAAP法5. ABC法6. SABC法7. LSAB法8. SP法9. SAP法401. 直接法將熒

10、光素或酶直接標(biāo)記在第一抗體上，以檢測相應(yīng)的抗原。優(yōu)點：簡單；時間短；特異性強。缺點：靈敏度低，耗費抗體多。直接法412. 間接法先用熒光素或酶標(biāo)記第二抗體，一抗為特異性抗體， 二抗僅有種族特異性。特點： （1）較直接法靈敏。 （2）可標(biāo)記一種抗體，檢測多種抗原。間接法42先將過氧化物酶（HRP）免疫兔/羊/鼠，制成兔/羊/鼠抗HRP抗體；然后再與HRP結(jié)合，形成PAP復(fù)合物。特點：（1）敏感性較高；（2）背景染色低（相對）；（3）所染標(biāo)本可長期保存。3. 過氧化物酶-抗過氧化物酶法（Peroxidase anti-peroxidase method，PAP）43PAP的原理示意圖444. 堿性

11、磷酸酶-抗堿性磷酸酶法（ alkaline phosphatase anti-alkaline phosphatase method，APAAP法）APAAP法檢測淋巴細胞亞群45美籍華人Hsu于1981年首次報道。該法以卵白素作為橋，把生物素化的抗體（二抗）與生物素結(jié)合酶（如HRP標(biāo)記的生物素）連接起來。5. 親和素-生物素過氧化物酶復(fù)合物法（avidin biotin-peroxidase complex，ABC ）46生物素/維生素H：它經(jīng)過羥基丁二酰亞胺活化為生物素-N-羥基丁二酰亞胺酯（BNHS），其酯鍵可與抗原（Ag）、抗體（Ab）、酶以及核酸的氨基、羧基或糖基共價結(jié)合，達到很高的

12、比活性（即一個大分子上可以連接多個生物素分子）。生物素（biotin）/維生素H（S）47親和素（avidin）/卵白素/抗生物素蛋白：堿性糖蛋白，分子量68 kDa，由4個相同的亞基組成，每個亞基可以與一分子生物素結(jié)合。它對生物素的親和力很強，比抗原抗體的結(jié)合力高1萬倍以上。鏈霉親和素（streptavidin，SA）/鏈霉卵白素：鏈霉菌培養(yǎng)過程中的分泌產(chǎn)物，是一種非糖基化的酸性蛋白。它是一個四聚體蛋白，提供4個生物素結(jié)合位點。SA特異性更高，而且可以耐受較高的鹽濃度（如2 mol/L KCl）和較強的變性劑（如1% SDS）。親和素和鏈霉親和素（S）48ABC復(fù)合物的制備4950ABC法的

13、優(yōu)點（1）靈敏度較PAP法提高2040倍。（2）一抗和二抗可高度稀釋，使背景染色下降。516. SABC法（Streptavidin Biotin-peroxidase Complex）：將ABC復(fù)合物中的卵白素換成鏈霉親和素。7. LSAB法（labelled Streptavidin-Biotin）：將鏈霉親和素和生物素先連結(jié)起來。8. SP法（Streptavidin Peroxidase conjugataed method）：將鏈霉卵白素和辣根過氧化物酶直接偶聯(lián)在一起。9. SAP法（streptavidin alkaline phosphatase conjugataed meth

14、od ） ：將鏈霉卵白素和堿性磷酸酶直接偶聯(lián)在一起。52（六）免疫組化在臨床病理診斷中的應(yīng)用（S） 標(biāo)記淋巴造血組織及其腫瘤的細胞來源和細胞分化程度協(xié)助腫瘤良惡性的診斷鑒別低分化癌和肉瘤鑒別轉(zhuǎn)移癌的性質(zhì)協(xié)助發(fā)現(xiàn)骨髓、淋巴結(jié)微小轉(zhuǎn)移癌灶鑒別小細胞惡性腫瘤癌組織耐藥基因的檢測 為癌癥患者治療方案的擬定提供依據(jù)確定腫瘤組織的增殖活性評估癌癥患者的預(yù)后 檢測病原體53第二節(jié) 蛋白質(zhì)的定量檢測一、凱氏定氮法二、雙縮脲法三、Folin-酚試劑法（Lowry法）四、紫外分光光度法五、考馬斯亮藍G-250染色法六、BCA法54一、凱氏定氮法1983年由丹麥化學(xué)家凱道爾建立，以后經(jīng)過改良使其更符合蛋白質(zhì)定量的要

15、求。理論基礎(chǔ)：各種蛋白質(zhì)的含氮量很接近，通常占其總重量的16左右。蛋白質(zhì)樣品用濃硫酸消化后，可以轉(zhuǎn)變?yōu)榱蛩徜@，硫酸銨中的NH4+與NaOH反應(yīng)又可轉(zhuǎn)變?yōu)镹H3，用硼酸液吸收后，可由標(biāo)準(zhǔn)鹽酸滴定并定量。由于蛋白質(zhì)是體內(nèi)的主要含氮物，因此，通過測定生物樣品的含氮量便可估算出樣品中的總蛋白質(zhì)含量。 蛋白質(zhì)含量含氮量 6.25此方法的測定范圍為0.21.0 mg氮。55二、雙縮脲法原理：蛋白質(zhì)含有兩個以上的肽鍵，故有雙縮脲（NH2-CO-NH-CO-NH2）反應(yīng)。在堿性條件下，肽鍵的質(zhì)子被解離，Cu2+和失去質(zhì)子的多肽鏈的氮相結(jié)合產(chǎn)生穩(wěn)定的紫色絡(luò)合物，在540560 nm的光吸收值與蛋白質(zhì)的含量在一定

16、范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。雙縮脲法的具體操作參見P144145“雙縮脲法測定蛋白質(zhì)濃度”。 56顯色反應(yīng)僅與肽鍵數(shù)呈正比關(guān)系，與蛋白質(zhì)的種類、分子質(zhì)量及氨基酸組成無明顯關(guān)系。Cu2+與氨基酸（Arg除外）和二肽均不發(fā)生反應(yīng)，僅和1-亞氨基縮脲、2-亞氨基縮脲、丙二酰胺等少數(shù)幾種物質(zhì)有呈色反應(yīng)。基本上可以認為雙縮脲反應(yīng)是蛋白質(zhì)特有的反應(yīng)。571951年由Lowery建立，是目前應(yīng)用較廣泛、靈敏地測定蛋白質(zhì)含量的方法之一。原理：蛋白質(zhì)在堿性條件下與試劑甲（雙縮脲試劑）中的Cu2+形成絡(luò)合物。由于蛋白質(zhì)含芳香族氨基酸殘基（如Tyr和Trp），生成的絡(luò)合物可還原試劑乙（Folin-酚試劑）中的磷鉬酸和磷鎢酸而

17、產(chǎn)生鉬藍和鎢藍復(fù)合物，該復(fù)合物顯藍色，其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，可用于定量分析。三、Folin-酚試劑法/Lowry法（P145146）58Folin-酚試劑法注意事項Folin-酚試劑只在酸性溶液中穩(wěn)定，但本實驗在pH10條件下發(fā)生，因而加入Folin-酚試劑后立即混勻，使Folin-酚試劑在被破壞之前就發(fā)生反應(yīng)。59優(yōu)點：此法較雙縮脲法靈敏。缺點：較費時。（P54）標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線不太好。（P54）此法干擾物質(zhì)較多。例如琥珀酸緩沖液、Tris緩沖液；螯合劑（EDTA等）；糖類（葡萄糖、蔗糖等）；還原劑（酚、-巰基乙醇等）、去垢劑（Triton等）；尿素；硫酸銨；三氯乙酸等

18、。Folin-酚試劑法的優(yōu)點和缺點60四、紫外分光光度法由于蛋白質(zhì)中的Tyr、 Trp 和Phe殘基含有共軛雙鍵，蛋白質(zhì)溶液在275280 nm處有一紫外吸收高峰。在一定濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)的A280與其濃度呈正比，據(jù)此可進行蛋白質(zhì)定量測定。61五、考馬斯亮藍G-250染色法/Bradford法1976年由Bradford建立。原理：考馬斯亮藍G-250在酸性溶液中以游離態(tài)存在時呈棕紅色，它與蛋白質(zhì)通過疏水作用結(jié)合后，變?yōu)樗{色。色素對可見光譜的最大吸收值從465 nm轉(zhuǎn)移到595 nm處。蛋白質(zhì)與色素的結(jié)合反應(yīng)很快速，約在2 min左右的時間內(nèi)達到平衡，在室溫1 h之內(nèi)是穩(wěn)定的。在0.011.0

19、 mg蛋白質(zhì)/mL范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)含量與OD595值呈正比。考馬斯亮藍G-250染色法的具體操作參見P146147“Bradford檢測法”。62六、BCA法原理：BCA（bicinchoninic acid）是對一價銅離子（Cu+）敏感、穩(wěn)定和高特異性的試劑。在堿性溶液中，蛋白質(zhì)將Cu2+還原成Cu+，后者與測定試劑中BCA形成一個在562 nm處具有最大光吸收的紫色復(fù)合物。復(fù)合物的光吸收強度與蛋白質(zhì)濃度呈正比。BCA的結(jié)構(gòu)63BCA法原理示意圖64第三節(jié) 免疫印跡法分析特定蛋白質(zhì)的相對含量一、免疫印跡/Western blot的概念二、免疫印跡法檢測樣品中特異蛋白質(zhì)的基本流程三、 Weste

20、rn blot的常用緩沖液配置四、 Western blot的操作步驟五、注意的問題65Western blot/免疫印跡：蛋白樣品經(jīng)過電泳分離后，轉(zhuǎn)移并固定于膜上，然后應(yīng)用抗原抗體反應(yīng)進行特異性檢測的方法。免疫印跡法是檢測蛋白質(zhì)混合溶液中某種特定目的蛋白的定性方法，也可以作為確定同一種蛋白質(zhì)在不同細胞或同一種細胞在不同條件下的相對含量的半定量方法。Southern blotNorthern blot一、免疫印跡/Western blot的概念66二、免疫印跡法檢測樣品中特異蛋白質(zhì)的基本流程樣品的凝膠電泳蛋白印跡封閉反應(yīng)與特異性抗體（一抗）孵育與酶耦聯(lián)的二抗孵育顯色或化學(xué)發(fā)光顯影觀察和記錄結(jié)果

21、6768三、Western blot的常用緩沖液配置電轉(zhuǎn)移緩沖液 48 mmol/L Tris 39 mmol/L 甘氨酸 0.01% SDS 20% 甲醇TBST 20 mmol/L Tris-HCl/pH 7.5 0.15 mol/L NaCl 0.05% Tween-20封閉液（TBST+5%脫脂奶粉或牛血清白蛋白）抗體稀釋液（TBST+1%脫脂奶粉或牛血清白蛋白）69四、Western blot的操作步驟用純化的免疫小鼠，制備特異性的抗血清。制備樣品，用SDS電泳分離。用（半干式）電轉(zhuǎn)移法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVDF或NC膜上。（1）將聚丙稀酰胺凝膠浸泡在電轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡20 min以上。（

22、2）裁剪與凝膠大小一致的PVDF膜或NC膜。 注意：PVDF膜要先用甲醇浸潤10 s，蒸餾水漂洗10 min，然后在電轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10 min以上。NC膜直接在電轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10 min以上即可。（3）裁剪合適大小的濾紙，用電轉(zhuǎn)移緩沖液浸潤，按陽極、三層濾紙、PVDF膜或NC膜、凝膠、三層濾紙、陰極的順序疊放電轉(zhuǎn)移三明治。（4）按0.5 mA/cm2膜恒流電轉(zhuǎn)移1 h。70將膜在封閉液中室溫反應(yīng)60 min。轉(zhuǎn)移膜至特異性的抗血清（一抗工作液）中，室溫反應(yīng)45-60 min。用TBST漂洗。3次，每次10 min。轉(zhuǎn)移膜至堿性磷酸酶（AP）偶聯(lián)的羊抗鼠IgG（二抗工作液）中，室溫反應(yīng)4

23、5-60 min。用TBST漂洗。3次，每次10 min。顯色反應(yīng)。將膜浸泡在NBT/BCIP顯色液中，避光靜置，待出現(xiàn)清晰條帶后，把膜轉(zhuǎn)移至蒸餾水中中止反應(yīng)。觀測和記錄結(jié)果。71VP39的Western blot分析72五、注意的問題（一）樣品的凝膠電泳1. PAGE2. SDS3. Tris-Tricine膠電泳：用于分子量小于10 kDa的多肽及蛋白質(zhì)的電泳，能夠獲得較好的分離效果。73（二）轉(zhuǎn)膜1. 戴手套，避免用手接觸濾紙、凝膠和膜，因為手上的油脂會阻斷轉(zhuǎn)印。2. 濾紙和膜的尺寸與凝膠大小一致。3. 轉(zhuǎn)膜方向要正確：凝膠在陰極，膜在陽極。4. 排除濾紙、凝膠和膜之間的氣泡。5. 電轉(zhuǎn)

24、時間可根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的大小靈活選擇。6. 電轉(zhuǎn)結(jié)束后，凝膠可用考馬斯亮蘭染色以確定轉(zhuǎn)移效率。74（三）顯色或顯影1. 顯色辣根過氧化物酶：底物為DAB。堿性磷酸酶：底物為BCIP/NBT。2. 化學(xué)發(fā)光顯影最常用的辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶有不同的發(fā)光底物（商品化產(chǎn)品）。曝光的時間和顯影的時間根據(jù)實際情況而定。75第四節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbant assay，ELISA）一、ELIAS的原理二、ELIAS的類型三、ELISA的步驟四、ELISA的常規(guī)生色底物（S）五、結(jié)果判斷六、注意事項76原理：酶聯(lián)免疫吸附試驗是一種固相免疫測定技術(shù)，先將已知

25、的Ab或Ag包被到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。測定時，將待檢樣本和酶標(biāo)Ag或Ab按不同步驟與固相載體表面吸附的Ab或Ag發(fā)生特異性反應(yīng)。最后加入酶反應(yīng)底物，根據(jù)底物被酶催化產(chǎn)生的顏色及其光密度（OD）值的大小進行定性或定量分析。優(yōu)點：靈敏度高；特異性好；簡便；重復(fù)性好。一、ELIAS的原理77酶標(biāo)板780601酶標(biāo)儀79二、ELIAS的類型（根據(jù)檢測目的和操作步驟分類）1. 間接法2. 雙抗體夾心法3. 競爭法801. 間接法間接法測抗體812. 雙抗體夾心法/三明治法雙抗體夾心法測抗原只適用于大分子抗原，不能用于測定半抗原等小分子物質(zhì)823. 競爭法此法可用于抗原、半抗原和抗體的測定。原理：參考管中只加入酶標(biāo)Ag，不加受檢樣品，因而與固相抗體結(jié)合的酶標(biāo)Ag最多，顏色最深。測定管中加入酶標(biāo)Ag和受檢樣品。受檢樣品的Ag量越多，競爭性抑制酶標(biāo)Ag與固相Ab的結(jié)合，使得固相上結(jié)合的酶標(biāo)Ag越少，測定管顏色就越淺。根據(jù)參考管與測定管OD值之比，計算樣品中待測Ag的含量。競爭法測抗原83三、ELISA的步驟（以雙抗體夾心法為例）向微孔板內(nèi)加入抗特異性抗體進行包被。4C反應(yīng)24-36 h或37C反應(yīng)2