1、明膠酶譜法原理：酶譜法的基本過程是先將樣品進行聚丙烯酰胺（，含明膠）電泳分離，然后在有二價金屬離子存在的緩沖系統中使樣品中的（基質金屬蛋白酶）和恢復活性，在各自的遷移位置水解凝膠里的明膠，最后用考馬斯亮藍將凝膠染色，再脫色，在藍色背景下可出現白色條帶，條帶的強弱與和活性成正比。復性原理：在電泳過程中，與樣品中的結合（當然是可逆性結合），破壞其氫鍵、疏水鍵而使不能發揮其分解明膠的作用，而只有當將膠置中洗脫（最好是放在搖床上搖,靜置于中是不妥的）時，由于恢復了活性。/次，做次或次，次。被結合而去除，從而使試劑的配制配制聚丙烯酰胺凝膠（含明膠，配好后周內使用，明膠含量低靈敏度高）A分離膠的配制（注：

2、根據你所用的電泳儀膠的大小確定配制膠的量）聚丙烯酰胺凝膠（包括）丙烯酰胺）水浴溶解）30儲%備膠（0.8（過硫酸銨（）明膠（明膠濃.縮膠的配制濃縮膠30儲明備膠10過明硫酸銨60ul）-甘氨酸電極緩沖液i甘氨酸，（8x上樣緩沖液甘明油溴酚藍洗）脫液：40分鐘兩次，中間換液,（分鐘次）（孵甲%醇，10乙%酸（染色3小時）0%乙,酸1濃0度%分,別為10%,1（5漂）洗液：50mmol/L，T孵育液：育42小時）染色液：亮藍脫色液A、：甲醇濃度分別為（分別脫色）實驗步驟取對數期的癌細胞在的無血清培養基中培養4次日收集上清液，將上清液移入離心管中離心，C儲存備用。（3根）據細胞計數調整各組細胞培養上

3、清液中的蛋白濃度（或者測定蛋白濃度調整使所上蛋白總量一致）。與X上樣緩沖液混合，樣本上樣緩沖液。（不要用槍用力吹打，防止出現過多氣泡）配制分離膠和濃縮膠，孔上樣（根據表達強度和蛋白濃度確定上樣量）,C進行電泳約小時（電泳時在周圍敷上冰，有利于使條帶跑直）。TOC o 1-5 h z電泳結束后將凝膠置于洗脫液1,L中振蕩洗脫次每次分鐘然后用漂洗液除不含外其余同洗脫液漂洗次每次分鐘接著將凝膠置于孵育液中C孵育2孵育結束后經染色液亮藍、甲醇、乙酸染色及脫色液、甲醇濃度分別為、乙酸濃度分別為、分別脫色、后，顯示出和為位于藍色背景上的透亮帶，用凝膠圖像分析系統分析讀取條帶面積，寬度和灰度值，做統計分析。

4、注意事項：制備聚丙烯酰胺時應注意排除氣泡。明膠酶譜的活性受鈣離子，鋅離子，和值等因素的影響，因此緩沖液配制應嚴格準確，盡量用超純水，孵育溫度也掌握好。（3用）大梳子孵育液的最好在-復性的時間長了會有絮狀物，所以實驗時盡量使用新鮮配置的。孵育的度不要在培養箱中，因為會改變孵育液的值，在普通孵箱即可。（6明）膠要4度保存，配好后1周內使用凝膠制備：（1玻）璃板對齊后放入夾中，垂直卡緊，加滿水檢漏。配分離膠，和作用為促凝，最后灌膠前加。若板不漏水，則將水倒出，并用吸水紙洗凈后灌膠，灌至大約3/處4，上面加滿水壓平。配濃縮膠，同樣地，和最后加，分離膠灌入約后觀察小燒杯中剩余分離膠是否已凝，同時仔細觀察可見玻板水和膠間有一條折線，說明膠已凝固。（4將）上面的水倒去，吸水紙洗凈，灌入濃縮膠，灌滿，注意一定不要有氣泡，然后將梳子插入，注意保持水平，約后凝固可用。（5拔）梳子在電泳緩沖液中拔，加樣孔用小針筒沖洗干凈再上樣，注意上樣時勿使樣品逸至鄰孔，樣品混勻時要輕，不要產生氣泡，否則加樣時易導致逸出而使結果不準確。【某種酶蛋白活性分析】（1）用于測定蛋白酶活性。（2）三個主要內容：生物軛合物；試劑盒；分析方法。（3）生物軛合物包含：連接物；熒光劑；猝滅劑。（4）連接物包含能識別所檢測的酶并且與之相互作用的部分；熒光劑包含多種熒光物質，并與所述連接物的第一位置軛合