1、基因檢測技術在 在食品生物平安領域的運用祝 長 青江蘇出入境檢驗檢疫局.食質量量平安理化平安生物平安.運用于食品平安領域的主要方面轉基因產品檢測 過敏原檢測 物種鑒別. 轉基因產品檢測.二十世紀80年代初，美國最早對轉基因生物進展研討。首例轉基因生物GMO于1983年問世，轉基因作物(1986同意進展田間實驗，延熟保鮮番茄1993在美國同意上市，開創了轉基因植物商業運用的先例.到2021年，全世界的轉基因食物的種植面積估計將增至6000萬公頃，市場總收入將到達3萬億美圓。.我國的轉基因植物現狀番茄華番1號甜椒抗病毒矮牽牛改動花樣木瓜抗病毒大米抗蟲、抗病毒，尚未同意.大斑蝶事件Losey等Los

2、ey et al., 1999的實驗結果在Nature上發表后引起了很大的驚動。他們在實驗室中用加有Bt玉米花粉的馬利筋葉片來喂飼大斑蝶幼蟲，加普通玉米花粉及不加玉米花粉的馬利筋葉片作為對照，結果闡明喂飼加有Bt玉米花粉的馬利筋的幼蟲第二天死亡10%以上，4天后死亡44%，而對照全部存活。此外，對加有Bt玉米花粉的馬利筋攝取量小，幼蟲生長緩慢，分量只需喂飼無花粉葉片的幼蟲的一半。從另外一角度也能夠要挾大斑蝶的生存，在無轉基因抗除草劑作物前，除草劑普通只能在作物種子萌生前噴灑一次。在種植抗除草劑作物后，就可在作物生長期多次噴灑除草劑，殺死雜草而對作物無要挾，隨著多次除草劑的噴灑，馬利筋就大量減少

3、。由于大斑蝶的獨一的食物是馬利筋，隨著馬利筋大量減少，也就要挾到大斑蝶的物種的生存。 .Pusztai土豆事件 英國研討一切位博士，他用轉雪花蓮凝集素基因的土豆喂大鼠，年秋天在英國電視臺發表講話，聲稱大鼠食用了這種土豆后，體重和器官分量減輕，免疫系統遭到了破壞。此事初次引起國際驚動。綠色和平組織、地球之友等反生物技術組織組織了了破壞轉基因作物實驗地等行動，熄滅了印度的兩塊實驗田，甚至美國加州大學戴維斯分校的非轉基因實驗資料也遭破壞，以致研討生的畢業論文都無法爭辯。 英國皇家學會對此非常注重，組織了同行評審，并于年月發表評論，指出的實驗有六方面的錯誤，即：不能確定轉基因和非轉基因馬鈴薯的化學成分

4、有差別；對食用轉基因土豆的大鼠，未補充蛋白質以防止饑餓；供試動物數量少，飼喂幾種不同的食物，且都不是大鼠的規范食物，很少統計學意義；實驗設計差，未作雙盲測定；統計方法不當；實驗結果無一致性等。 但此事曾經使GMO食品的平安性成為了全球民眾與各國政府的關注焦點。.StarLink玉米事件 StarLink玉米，它是由Aventis于1996年培育出來的一種能夠引起過敏的轉基因農作物，StarLink玉米與哮喘發作和其它一些過敏反響有關。這種玉米含有一種來自常見土壤細菌-蘇云金芽孢桿菌的cry9C蛋白，cry9C蛋白可以維護玉米免遭玉米鉆蟲和黑毛蟲的損害。 StarLink玉米于1998年被美國環

5、境維護協會同意用只能用于動物喂養和非食物性產品上，但到了2000年，在墨西哥的玉米食品等中發現有cry9C的DNA片段。隨后歐盟、日本等國也發現了StarLink玉米污染食品的情況。.轉基因水稻 1. 歐盟要求美國政府保證出口到歐盟地域的一切長粒水稻中不含有未經答應的轉基因水稻品系LL 601，該水稻品系是由拜耳公司研發的。歐盟表示，至少在今后6個月將要求進展轉基因水稻的檢測，而且能夠會要求進展附加檢測。日本和韓國也對此表示關注，一些媒體暗示政府能夠會發出禁令。 2. 2006年2021年，歐盟、日本等國在中國出口的大米或米制品中檢測到有抗蟲轉基因大米的污染，這些品系在中國都沒有得到允許商業化

6、種植的答應。因此對中國出口的米及米制品加大抽查檢測力度。.轉基因產品檢測 檢測技術 基因方法：Real-time PCR ，PCR DNA Microarray 蛋白檢測方法：ELISA, Quicktest strip 規范方法 5個ISO 國際規范 8 項國家規范 12項出入境行業規范 4項農業部行業規范 .Quicktest strip for Cry1Ab/Accontrol testpositivenegative.Primer annealing at 50-70CMelting of DNA at 95CPolymerisation at 72C1. Cycle2. CycleP

7、CR and TaqMan are registered trademarks of Hoffmann La Roche and Perkin ElmerPCR is an exponential process.定性常規PCR 樣品制備 樣品核酸提取 PCR體系配置 PCR擴增 凝膠電泳檢測只能進展定性結果的判別是/否，具有一定客觀性。. 實時熒光Real time PCR的原理 CT值 表示每個PCR反響管內熒光信號到達設定的域值時所閱歷的循環數。研討闡明，各模板的CT值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，CT值越小，反之亦然。圖 1.Rn與時間曲線 .熒光實時PCR與

8、普通PCR的比較實時在線監控 對樣品擴增的整個過程進展實時監控，可以實時地察看到產物的添加，直觀地看到反響的對數期降低反響的非特異性 運用引物和熒光探針同時與模板特異性結合，提高了PCR反響的特異性添加定量的準確性 全程監控，準確的算法進展定量結果分析更加快捷方便，無需進展凝膠電泳.Real time vs 終點法.熒光實時PCR的標志方法內摻式染料SYBR Green I序列特異性探針Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET).實時 PCR - TaqMan Technology.國內外常用的Real-time PCR 儀器Roche LightCy

9、cler 2.0Roche LightCycler 480Applied Biosystems 7500型PCR儀 Biorad iCycler.Screening targetsGene specific targetsConstruct specificEvent specific targetsLevels of specificity GMO sequencesLOWHIGHRecent Bt10 case demonstrates need for construct and event specific methods .GMO熒光PCR檢測工程挑選檢測 Target genes:

10、 CaMV 35S Promotor, Nos teminator , NptII等 品系特異性檢測 GTS40-3-2 (RoundUp Ready Soybean), BT 63, Bt176, Mon 863等 內標基因： GOS，Lectin，PLD，Zein等.本實驗室的GMO檢測任務 國家認監委首批認可的GMO檢測重點實驗室； 與轉基因檢測領先的Eurofins/GeneScan協作成立 了基因檢測結合實驗室 FoodScan； 利用LightCycler 1.2 多次參與英國CSL、APLAC 的轉基因檢測全球程度測試，結果稱心。 與農業部、中檢院等協作，利用 LightCycl

11、er 480完成了轉基因大米的國標協同驗證，結果稱心。 每年轉基因檢測的接近8001000批次，工程多達5000余項。.TT51外源基因的LC480檢測圖Error: 0.134Efficiency: 1.857Slope: -3.720Y Intercept: 41.62.Error: 0.0570Efficiency: 1.958Slope: -3.426Y Intercept: 38.60PLD內標基因的LC480檢測圖. 食品過敏原的檢測.最常見的食品過敏源Major serious allergens include 主要嚴重的過敏源包括 (IFST-1999):“Big eight

12、八大樣: eggs, cows milk, peanut, soybean, wheat, tree nuts, fish and crustacean蛋品、牛奶、花生、黃豆、小麥、樹木堅果、魚類和甲殼類食品。“Second eight八小樣: sesame seeds, sunflower seeds, cottonseed, poppy seed, fruits, beans other than green beans, peas and lentils.芝麻籽、葵花子、棉籽、罌粟籽、水果、豆類不包括綠豆、豌豆和小扁豆Others其它: tartrazine, sulphites and

13、 latex.KFI food allergen category list* KFI食品過敏源類別清單Celery 芹菜Eggs蛋類Cows milk牛奶Peanut 花生Soybean 大豆Sulphites 亞硫酸鹽Wheat 小麥Seeds 種子Seafood海鮮 Tree nuts樹木堅果Cottonseed棉籽poppy seeds罌粟子sesame seeds芝麻籽sunflower seeds葵花子Crustacean甲殼類Fish魚類almond 杏仁brazil nut巴西木堅果cashew 賈如樹堅果chestnut 栗子hazelnut 榛子macadamia nut

14、pine nuts 松子pistachio 阿月渾子的果實pecan美洲山核桃 walnut核桃*Some exemptions are included in the list - Example一些例外在-實例表中列出.1.ELISA方法檢測過敏原 澳大利亞ELISASYSTEMS)：1.原理： 第一步：參與樣品 第二步：參與酶標志物 第三步:參與發色劑及反響停頓液參與樣品后，假設樣品中有過敏原Allergy)，樣品中的過敏原(Allergy)將會與包被在微孔中的特異性抗體結合。孵育15分鐘后，洗去沒有結合的雜質。參與酶標志物后，酶標志物會與過敏原殘留物結合構成“三明治夾心體，孵育15分鐘

15、后，洗去沒有結合的沒標志物。假設樣品中有過敏原，參與發色劑TMB底物溶液孵育10分鐘后與酶標志物結合顯藍色，參與反響停頓液停頓反響，溶液顯黃色，酶標儀讀數或用肉眼判讀顏色。.1.ELISA方法檢測過敏原澳大利亞ELISASYSTEMS)：2.檢測步驟：第一步：參與100ul的樣品及規范品到相應的微孔中，細微混合10秒，孵育15分鐘。第二步：倒掉微孔中的液體。第三步：用洗板緩沖液洗板，反復5次。第四步：在吸水紙上拍打，直到微孔中沒有殘留液體。第五步：100ul酶標志物綠蓋到每個微孔中， ，細微混合10秒，孵育15分鐘。第六、七、八步：同第二、三、四步.1.ELISA方法檢測過敏原澳大利亞ELIS

16、ASYSTEMS)：第九步：參與100ul發色劑TMB底物，細微混合10秒，孵育15分鐘。第十步：參與100ul的反響停頓液，細微混合10秒。第十一步：肉眼比色定性檢測或酶標儀讀數定量檢測.1.ELISA方法檢測過敏原澳大利亞ELISASYSTEMS)：食品過敏原檢測棉拭子法-用于設備外表殘留的檢測第一步：選擇一個棉拭子。第二步：在棉拭子管上標志樣品號。第三步：放置棉拭子管在棉拭子管架上。第四步：翻開棉拭子浸濕溶液管。第五步：將棉拭子插入浸濕溶液管浸濕棉拭子。第六步：轉移面拭子，假設棉拭子太濕，在棉拭子浸濕溶液管壁上細微壓一下。.1.ELISA方法檢測過敏原澳大利亞ELISASYSTEMS)：

17、第七步：用浸濕的棉拭子交叉的平行線畫出陰影，或用本人的方式涂布要檢測的區域。第八步：放置棉拭子到對應樣品的棉拭子管。第九步：封鎖好棉拭子管。第十步：儲存棉拭子管，直到提取、分析。.ELISA方法檢測過敏原澳大利亞ELISASYSTEMS)：過敏原ALLERGY檢測產品表ELISA法.2. 熒光PCR方法檢測食品過敏原檢測原理： PCRFast是一種即用型的分子生物學方法，用于檢測食品、設備殘留樣品中的特異性DNA片段。檢測系統符合國際PCR規范ISO。該試劑盒利用實時熒光定量Real-time PCR)的方法含有FAM報告基因和非熒光淬滅基因的探針檢測食品及設備殘留中過敏原的特異性DNA片段。

18、.2.PCR方法檢測過敏原(德國IFP6.樣品提取DNA提取： 每次PCR的分析，建議對每個樣本進展兩次提取，并且每個運轉分析都設置提取對照(ISO 21571, 用于檢測轉基因生物體的食品分析方法和用于衍消費品的核酸提取方法)。 對于不同的樣本，用以下優化的CTAB方法可以得到好的結果。根據不同的樣本也可以采取不同的提取方法。 對于食品樣本，例如蔬菜和動物脂肪或者卵磷脂，應該采用正己烷萃取法提取。 a. 經典的核酸提取方法如CTAB方法 b. 試劑盒法提取樣品核酸 用硅膠柱純化DNA，例如：PCRFast DNA純化。 一次PCR設置的每個分析系統都要進展提取對照ETC分析，只參與試劑不加樣

19、本。.2.PCR方法檢測過敏原(德國IFP6.3 DNA濃度的評價 總DNA的總量大于100ng不能進展PCR反響用260nm的紫外進展檢測，或者經過瓊脂糖凝膠進展估算因此，假設是含有高濃度DNA的樣本大豆粉、玉米粉、香腸等樣本，DNA提取物必需用0.1 x TE 緩沖液進展稀釋。 DNA提取物帶有抑制效應含有可可、巧克力的食品等同樣需求用0.1 x TE 緩沖液進展稀釋。例如：用步驟6.1(12)中100l的柱子或者步驟6.2中100l的洗脫柱子，已證明最正確稀釋比例如下：香腸樣本 1：401：80 玉米粉 1：20大豆粉 1：20 鳀魚片 純淀粉 純 巧克力 1：10和1：20動物飼料 1

20、：101：207. PCR設置 7.1 預備 從錫箔袋中取出所需數量的反響管，將其他的反響管和枯燥劑放回錫箔袋子，密封好，儲存于2 - 8 C。預備所需量的MasterMix每個反響管12.5 l。.2.PCR方法檢測過敏原(德國IFP7. PCR設置按以下表格所示汲取相應的量參與反響管：該當包括核酸提取對照、PCR陰性對照和陽性對照、試劑空白對照。reaction vialMaster- Mixextract sampleextract extraction controlwater deionizedfor each sample extractionsamplecolourless12.5 l12.5 l-per each analysis runpositive control PTCred12.5 l-12.5 lnegative control NTCcolourless12.5 l-12.5 lextraction control ETCcolourless12.5 l-12.5 l-.2.PCR方法檢測過敏原(德國IFP8. 評價：8.1實時評價樣本：下表顯示了評價。陽性反呼應該給出一個最后的熒光值，這個值明顯高于閾值。SampleInternal amplification co