1、第三節 海藻組織培養概況1 根據海藻材料的不同，海藻組織培養分為：海藻切段培養海藻愈傷組織培養海藻細胞培養海藻原生質體培養 一、海藻組織培養的分類2二、海藻組織培養研究歷史海藻組織培養開始于20世紀50年代，美國加州大學教授A.Gibor最早開始用褐藻(Cystoseira)進行海藻組織培養試驗。Chen和Taylor(1978)最早報道對紅藻門皺波角叉菜（Chondrus crispus）的髓部組織培養。3早期的海藻組織培養研究遇到了兩大難題：獲得無菌材料困難：海藻的表面寄生物多，且生長牢固，難以去除，必須采用劇烈的刷洗，而海藻的外表皮細胞無角質層類的保護層，很容易受損傷；同時由于寄生的微生

2、物種類多，數量大，所用的消毒劑和抗生素的量需加大，極易造成外植體畸形或死亡；海藻的基礎研究落后，缺乏控制其生長和分化的x相關知識。4海藻的生活環境復雜具有許多不同于高等植物的特性，使得組織培養研究進展相對緩慢。從20世紀80年代開始，進行了許多海藻表面消毒和無菌孢子獲得方法的研究。各種新的抗生素和清洗技術應用到大型海藻的組織培養中，許多海藻成功的實現了組織培養。同時對于愈傷組織產生的誘導條件進行了詳細的研究，包括各種培養條件，不同的培養基，產生部位以及來源（組織塊，細胞，原生質體）。5對于影響愈傷組織形成的物理因子，包括滲透壓，瓊膠強度，鹽度（Robaina et al.1990，Yokoya

3、 et al.1999），營養鹽包括甘油、有機碳源(Garcia-Jimenez et al.1998)，植物生長調節物質(Bradley&Cheney 1990，Yokoya&Handro 1996，Yokoya 2000) 等進行了詳細的研究。據統計迄今已有六十余種大型海藻通過原生質體、組織切塊實現了再生培養。 6三、海藻組織培養的應用海藻組織培養的優點：取材少，繁殖周期短、環境條件人為控制不受季節限制、易于工廠化生產等。7海藻組織培養主要應用在：種苗培育研究次生代謝產物生產8 種苗培育研究海藻種質庫：我國在大型經濟海藻的養殖與應用方面一直處于國際領先地位，同時也是少數幾個具有大型海藻種質

4、庫的國家之一，目前已保存了海帶、裙帶菜、紫菜的多個品系。苗種生產：利用植物離體繁殖進行大規模的苗種生產。目前，已在經濟海藻的苗種生產研究中取得了一定的進展。9劉鳳賢（1990）用殼聚多糖可將鷓鴣菜切段長成再生苗；朱仲嘉等（1992）羊棲菜組織培養芽生苗；裴魯青等（1993）石花菜切段再生。賀麗虹等（2004）條斑紫菜單細胞固體培養成苗；曾慶國等（2004）以壇紫菜單個體細胞克隆培養獲得的葉狀體，再用組織培養技術形成純和絲狀體，然后進行海上養殖等。10 次生代謝產物的生產海洋植物含有特殊的成分，在工業和醫藥中有特殊的利用價值。溫帶紅藻Agardhiella subulata含有稀有的通過脂肪氧化

5、代謝產生的類花生酸（Graber等1996）和具有抗濾過性病原體活性的磺酸鹽半乳糖體（Witvrouw等1994）；11熱帶紅藻Ochtodes secundiramea含有的多種鹵化類萜化合物（Maliakal等2001），可以通過月桂烯合成酶（Wise等2002）和海洋溴過氧化物酶（Roner等2001）產生。另外，從海藻組織培養中還可以生產有用的藥物或其他活性物質如胡蘿卜素、紅藻色素等。12四、海藻組織培養操作基本步驟： 實驗室消毒 實驗室器具洗滌與消毒培養基配制與消毒外植體準備與消毒外植體切割與接種外植體培養與觀察131、培養基的配制高等植物培養基主要有： MS培養基（Murashig

6、e和Skoog,1962） ER培養基（Eriksson,1965） B5培養基（Gambor等，1968） SH培養基（Shenk和Hildebrandt，1972） HE培養基（Heller，1953） 14 海藻組織培養培養基（海水加富型培養基）主要有： 培養褐藻的PESI培養基； 培養紅藻和綠藻的PES培養基、MES培養基、VAS培養基； 培養一般海藻的Erd（-shreiher）培養基和ESS培養基。1516人工海水培養基 這種培養基，在對海藻營養要求進行調查和調整及生理生化過程的研究時采用，適用于海藻的一般性無菌培養，主要有： 綠藻常用Asp1培養基、Asp7培養基； 紅藻常用As

7、p2培養基、Asp6培養基； 褐藻常用Asp12培養基； 綠藻常用KDX培養基。 1718MES培養基配制步驟： MP II原液的配制 MES enrichment 原液的配制19 MES培養液的配制 1000mL MES培養液 = 20mL MES enrichment 原液 + 980mL 消毒海水 熔化瓊脂 電爐加熱至瓊脂熔化，將配制好的混合培養液加入到瓊脂中，定容。 調pH 正常海水的pH值一般為8.1-8.3。 用1mol/L NaOH溶液調pH 培養基的分裝 用錐形瓶分裝，培養基的量約為錐形瓶容量的1/51/4，用2塊硫酸紙中間夾1層牛皮紙封蓋瓶口，并用線繩捆扎，貼標簽，待消毒。2

8、02、外植體的選擇與消毒外植體選擇:外植體（explant）是指用于離體培養的活的植物組織、器官等材料。外植體的來源：生長在自然環境下野生或栽培的海藻21最適于用作組織培養的外植體是靠近藻體生長部的分生組織，健康無毒。組織部位、植株年齡、取材季節以及植株的生理狀態和質量都對培養時器官的分化有一定影響。22外植體消毒:消毒的尺度是既能全都殺滅外植體上附帶的微生物，而又不傷害植物材料的生活力。一般使用消毒海水反復清洗進行藻體消毒，或者用碘化鉀或次氯酸鈉溶液進行藻體表面消毒。海藻組織培養只能做到少菌而不能真正做到無菌。23表1 常用消毒劑的使用和效果（引自潘瑞熾，2001）*質量分數24如果海藻外植

9、體確實需要無菌，可以使用抗生素消毒，但成功率不高。使用一定濃度的抗生素浸泡一定時間，每隔一定時間挑出外植體進行無菌檢測，直到確實無菌為止。培養基中應該含有300ug/mL的青霉素 G（ Penicillin G ）、100ug/mL的硫酸鏈霉素（ Streptomycin sulphate ）、50ug/mL的新霉素B（ Neomycin B ）、200ug/mL的康納徽素（ Kanamycin）253、外植體切割與接種切割: 海藻多是頂端生長，切取外植體時要注意選取具有分生組織的部位，同時要注意切取藻體的大小。外植體的組織塊大小：不同海藻用于組織培養的最佳長度和大小是不同的。 如，江蘺組織培

10、養切段至少要在3mm以上； 多管藻只含1個細胞長度的切段也能再生； 不了解藻體再生能力，可以設立不同長度和大小的梯度試驗，以找到組織培養的最佳藻體長度和大小。26切割一般在培養皿上進行 培養皿內消毒前放入3-4層圓形濾紙，在濾紙上進行切割。 每切割1次外植體需要更換位點，同時器具需要用酒精燈火焰消毒1次，以免交叉感染。27接種:接種就是將消毒過的外植體接入液體培養基中或插入固體培養基中，要無菌操作。接種量： 固體培養基 每瓶接種4-10個外植體切段 液體培養基 接種量為液體培養基重量的 5-20%左右28接種基本步驟： 將外植體在培養皿濾紙上切割好 用經過消毒的鑷子將外植體接入已消毒的培養液中

11、。如果為固體培養基則需將外植體插入到培養基表層中，約1/2露在培養基表面外； 接種后試管用無菌藥棉封口，培養瓶、培養皿用無菌膠帶封口； 將接種后的培養瓶或培養皿放置在培養室或培養箱中培養 。294、海藻組織培養方法培養方式: 分固體培養基培養和液體培養基培養兩種方式。 一般的小型實驗，可使用各種型號的培養皿或培養瓶進行液體培養基培養。 如果實驗材料比較多，常采用液體培養基懸浮培養法。30培養條件:光照條件：一般采用日光燈，光照強度范圍為15-40molm-2s-1，光照時間為每日12-16 h。溫度條件：根據培養材料在自然生態下的溫度變化來調整培養室的溫度高低，一般在15-25左右。濕度條件：

12、包括培養容器內的濕度條件和培養環境的濕度條件。31充氣條件：液體培養可以通過充氣方式進行攪拌培養。通入空氣，需要經過過濾裝置（濾膜孔徑為0.22um）以保證無菌狀態；或者用硫酸銅溶液除去雜藻以達到無污染。32培養液更換： 可以根據培養對象和培養要求更換全部培養液或只更換1/2或1/3的培養液。 注意：海水培養液因蒸發而使鹽度提高，故應每天定量補加蒸餾水。33培養物的檢查與觀察:定期檢查培養物細胞的分裂、生長、分化情況檢查的方法：首先，用肉眼觀察培養物的顏色、形狀變化；其次，在倒置顯微鏡下或解剖鏡下觀察培養物細胞的生長、分化情況。必要時還可取樣做細胞學、染色體研究，同時做好觀察記錄。34第四節

13、海藻切段再生 海藻切段再生是海藻組織培養最簡單的形式，就是將藻體切成段，通過無菌培養使切段再生成為植株。 大型海藻是一類低等植物，其藻體再生能力比高等植物更強。35一、海帶假根、柄、葉片切段再生Saga等（1977）用海帶藻體分別進行假根、莖、葉片切段再生試驗 結果證明：只有在離基部（包括假根、柄）一段才有再生能力。36按下圖的方法將藻體切成6段培養條件為：溫度10；光照周期為10L：14D；光照強度30molm-2s-1；用PESI培養液培養。372葉片+莖3莖+固著器4莖5固著器1葉片+莖+固著器6包括生長部的葉片1個月后，葉狀體上部和中部都死亡，其他結果：切段1從生長部伸長出葉片；切段2

14、葉狀體生長了約2cm，在莖的切口處從周圍生出約0.5cm固著器，長成為全長約3cm的藻體。切段3從莖的切口處周圍生長出約1cm的固著器，但沒有再生出葉狀體；切段4從莖的上下切口處周圍再生出固著器約0.2cm長；切段5有固著器切口處再生出1cm長的固著器；切段6向四周生長，再生成0.7cm不定形葉狀部。對照組完整的藻體全長再生長了2cm。38以上結果證明：不含生長部的葉狀體不能生存；雖然含有生長部的葉狀部可以生長，但不能再生其他器官；柄部能夠再生分化成固著器，但不能分化成葉；固著器可以再生，但只能再生成固著器。說明只有含有生長部和柄的切段才能再生成為完整的植株。39二、莖段切段再生Chen和Ta

15、ylor（1978）用角叉菜雌配子藻體的分枝（直徑大于2mm）為材料，進行了髓部組織培養試驗：用靠近頂端約3cm處的藻體切段，應用含有抗菌素的海水固體培養基（SWMD-1）培養，獲得無菌材料；在無菌操作下將靠近頂端的部分進行切段，并切去表皮及皮層，僅剩有內皮層和髓部小塊（大小約2mm3）；再按每瓶1塊組織接入50mL TC-1培養液，以200r/m的旋轉速度搖床培養 ，培養條件為溫度15，光照強度100molm-2s-1、光照周期16L:8D。實驗證明內皮層和髓部細胞具有較強的再生能力。40 脫分化：已經分化的植物細胞切割損傷后,在適宜的培養基上可以誘導形成失去分化狀態的比較均一的愈傷組織，這

16、一過程稱為脫分化。第五節 海藻愈傷組織培養41一、愈傷組織的誘導形成 從一塊外植體或單個細胞形成愈傷組織大致要經過3個時期：1、起動期 是指細胞準備進行分裂的時期。 用于接種的外植體的細胞，通常都是成熟細胞，處在靜止狀態。起動期是通過一些刺激因素(如機械損傷、改變光照強度、增加氧等)和激素的誘導作用，使外植體細胞的合成代謝活動加強，迅速進行蛋白質和核酸的合成。42生長物質常用作誘導劑，高等植物的常用誘導劑有2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、萘乙酸（NAA）和細胞分裂素等，其作用是使細胞立即進入DNA復制以及全部細胞進入S期（DNA合成期）并發生同步分裂。海藻的誘導期比較短，其對誘導劑也不十分

17、敏感。432、分裂期 是指外植體細胞經過誘導以后脫分化，不斷分裂、增生子細胞的過程。外植體外層細胞開始細胞分裂，使細胞脫分化，形成薄壁分生組織。如果對這一期細胞不斷更換新鮮的培養基，則愈傷組織可以無限制地進行分裂而維持不分化狀態。有些海藻外植體脫分化比較容易，有些比較難； 不同器官、不同部位外植體脫分化差異較大，幼嫩組織較易，而成熟組織和老化組織較難。處于分裂期的愈傷組織的特點是：細胞分裂快，結構疏松，顏色淺而透明。443、形成期 分裂期后，細胞內部開始發生一系列的形態和生理變化，導致分化出形態和功能不同的細胞。 一般愈傷組織的顏色是淺色、透明、有光澤，老化或污染后就變為褐色或深色，直到死亡。

18、45二、影響愈傷組織生長分化的因素 由處于脫分化狀態的愈傷組織再度分化形成不同類型細胞的過程稱為再分化。1、影響愈傷組織生長分化的內在因素 外植體遺傳型 器官和部位 年齡 一般選擇較幼嫩的藻體或近頂端切段作為外植體462、影響愈傷組織生長分化的外部因素培養基 培養基中的無機營養元素和有機成分，特別是生長素和激動素等生長物質及其比例更起著重要作用；培養基的固體、半固體或液體狀態，對愈傷組織培養也有很大影響。47培養條件 主要是溫度、光照強度、光照周期、光質以及振動頻率、通氣量等。溫度控制在1025之間，光源可采用日光燈或自然光線，每天光照約16h，光照強度為1540 molm-2s-1。藍光有利

19、于芽的分化；而紅光、遠紅外光對芽的分化有抑制作用，但促進根的分化；紫光對生芽有刺激作用。48激素一般來說，細胞分裂素有利于愈傷組織誘導形成；高比例的細胞分裂素/生長素的培養基易于形成芽；高比例的生長素/細胞分裂素的培養基易于形成根；由于分化與激素的關系同植物的遺傳性有著密切的關系，有時會出現相反的結果。49三、海藻組織塊愈傷組織的誘導大型海藻如海帶目中的某些種類具有較大和較厚的葉狀體，可以用打孔器穿透葉狀體而得到藻體組織的圓片。以此為外植體，可以獲得無菌的培養物并可誘導形成愈傷組織和再分化形成葉狀體。現以狹葉海帶(Laminaria angustata)的孢子體為例介紹這一方法。 501儀器 培養箱，超凈臺，顯微鏡，打孔器(直徑3-5mm）數個，手術刀1把，三角瓶(100 mL)10個，酒精燈1個，其他小器具。512材料準備 一般選用自然生長和人工培養的幼苗的生長部為材料。 可以從海邊采集海帶目海藻為材料(或其他大型海藻)。采集時，將藻體和固著器一起采回，將藻體表面的附著生物洗刷干凈，將莖部和葉狀體下部生長點部位留下，其余部位切除棄之。用滅菌海水對留下的藻體部分反復沖洗，備用。523培養基 狹葉海帶采用ASP12NTA培養基(ASP12NTA的組成是每100mL ASP12培養基中加10