1、發酵工業污染的防治策略發酵工業污染的防治策略發酵工業無菌操作的基本概念發酵工業無菌操作的基本概念發酵工業的無菌操作技術發酵工業的無菌操作技術發酵培養基及設備管道滅菌發酵培養基及設備管道滅菌空氣除菌空氣除菌一、一、發酵工業污染的防治策略發酵工業污染的防治策略什什么是染菌？么是染菌？即即“雜菌污染雜菌污染”，是，是指在發酵培養中侵入了除指在發酵培養中侵入了除菌種外，有礙生產的其他微生物。菌種外，有礙生產的其他微生物。（一）污染的（一）污染的危害危害l雜菌大量消耗培養基中的營養物質雜菌大量消耗培養基中的營養物質，使生產菌的生產能力下降，使生產菌的生產能力下降l雜雜菌產生的代謝產物，增加了發酵液中雜質

2、類型或改變了發酵液理化菌產生的代謝產物，增加了發酵液中雜質類型或改變了發酵液理化性質，從而導致增加了下游產物分離純化的難度，造成產物收率降低或性質，從而導致增加了下游產物分離純化的難度，造成產物收率降低或產品質量下降。（產品質量下降。（降低發酵降低發酵產率產率、提取、提取得率得率、產品、產品質量質量）l雜雜菌代謝會改變培養體系的菌代謝會改變培養體系的pHpH，使發酵過程異常。，使發酵過程異常。l雜雜菌的代謝可能會降解產物，使產物得率降低。菌的代謝可能會降解產物，使產物得率降低。l若細菌的培養過程中被噬菌體污染，細菌細胞會破裂，造成發酵失敗。若細菌的培養過程中被噬菌體污染，細菌細胞會破裂，造成發

3、酵失敗。A A細菌細菌谷氨酸：發酵周期短，培養基不太豐富，較少染雜菌，但噬菌體威脅大。肌苷：缺陷型生產菌，培養基豐富，易染菌，營養成分迅速被消耗，嚴重抑制菌生長和合成代謝產物。 B. B.霉菌霉菌PenG：青霉素水解酶上升，PenG迅速破壞，發酵一無所獲。檸檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防止前期染菌。C. C. 酵母菌酵母菌: : 易污染細菌以及野生酵母菌 D. D. 疫苗疫苗：無論污染的是活菌、死菌或內外毒素，都應全部廢棄。2022-7-82022-7-8青霉素青霉素：怕染細短產氣桿菌：怕染細短產氣桿菌鏈霉素：鏈霉素：怕染細短桿菌、假單孢桿菌和產氣怕染細短桿菌、假單孢桿菌和產氣桿菌桿菌四環

4、素：四環素：怕染雙球菌、芽孢桿菌和莢膜桿菌怕染雙球菌、芽孢桿菌和莢膜桿菌檸檬酸：檸檬酸：怕染青霉菌怕染青霉菌肌苷（酸）：肌苷（酸）：怕染芽孢桿菌怕染芽孢桿菌谷氨酸：谷氨酸：怕染噬菌體，易造成連續污染怕染噬菌體，易造成連續污染種子培養期發酵前期發酵中期發酵后期菌體濃度低、培養基營養豐富，菌體濃度低、培養基營養豐富，較易染菌較易染菌，應嚴格控，應嚴格控制。制。若將污染的種子帶入發酵罐，則損失更大，因此一經若將污染的種子帶入發酵罐，則損失更大，因此一經發現，應發現，應立即滅菌丟棄立即滅菌丟棄，并對種子罐、管道等進行，并對種子罐、管道等進行仔仔細檢查和徹底滅菌細檢查和徹底滅菌。 采用采用備用菌種備用菌

5、種或以無污染的適當菌齡的發酵罐內的或以無污染的適當菌齡的發酵罐內的發發酵液作為種子酵液作為種子，接入新鮮培養基中進行發酵。，接入新鮮培養基中進行發酵。發酵前期發酵前期易染菌易染菌，且危害很大，需特別注意防止，且危害很大，需特別注意防止一旦發現染菌，如原料營養還比較豐富，則進行一旦發現染菌，如原料營養還比較豐富，則進行重新滅重新滅菌菌、接種發酵接種發酵；如已消耗較多營養物質，則放掉部分料；如已消耗較多營養物質，則放掉部分料液、液、補充新鮮培養基補充新鮮培養基，重新滅菌、接種發，重新滅菌、接種發酵。酵。中期染菌會造成中期染菌會造成發酵異常發酵異常，產物，產物產量下降產量下降，應盡力做到，應盡力做到

6、早早發現、快處理發現、快處理。可通過可通過加入加入一部分一部分發酵旺盛發酵旺盛的的培養料培養料，調節通風、溫度、，調節通風、溫度、pHpH等措施挽救，如發酵單位到達一定水平則可等措施挽救，如發酵單位到達一定水平則可提前放罐提前放罐。后期染菌對抗生素、檸檬酸發酵影響不大，但對氨基酸、后期染菌對抗生素、檸檬酸發酵影響不大，但對氨基酸、核苷酸等破壞較大。核苷酸等破壞較大。發酵后期如發酵后期如染菌量不多染菌量不多，可，可繼續發酵繼續發酵。如。如染菌嚴重染菌嚴重，破壞，破壞性較大，可性較大，可提前放罐提前放罐。發酵罐中的發酵罐中的雜菌數量越多雜菌數量越多，即染菌程度越大，則對發酵，即染菌程度越大，則對發

7、酵的的危害越大危害越大。如生產菌大量繁殖后，發酵物中含少量雜菌，如每升發如生產菌大量繁殖后，發酵物中含少量雜菌，如每升發酵液中有酵液中有1-21-2個雜菌，一般對發酵沒有什么影響。個雜菌，一般對發酵沒有什么影響。對過濾的影響對過濾的影響染菌后特別是污染細菌后，發酵液一般發粘，導致染菌后特別是污染細菌后，發酵液一般發粘，導致過濾過濾困難困難。可采取加熱、添加助濾劑等措施，或加絮凝劑使蛋白質可采取加熱、添加助濾劑等措施，或加絮凝劑使蛋白質沉淀，有利于過濾。沉淀，有利于過濾。對提煉與產品質量的影響對提煉與產品質量的影響染菌發酵液中含有較多水溶性蛋白和其它雜質。染菌發酵液中含有較多水溶性蛋白和其它雜質

8、。增加提增加提煉難度煉難度，增加產物提取成本，增加產物提取成本，降低產物純度降低產物純度。二、雜菌污染的防治二、雜菌污染的防治某藥廠鏈霉素發酵染菌原因分析某藥廠鏈霉素發酵染菌原因分析檢檢查雜菌的方法，要求準確可靠和快速，這樣才查雜菌的方法，要求準確可靠和快速，這樣才能在短時間內獲得效果，主要方法有能在短時間內獲得效果，主要方法有： 顯微鏡顯微鏡檢查檢查平板劃平板劃線檢查線檢查肉湯培肉湯培養檢查養檢查發酵過發酵過程異常程異常觀察觀察 前前3 3種檢查法未發現種檢查法未發現染菌，還不能肯定未被染菌，還不能肯定未被染菌；染菌； 原因是以上檢查法只原因是以上檢查法只能檢查雜菌濃度較大的能檢查雜菌濃度較

9、大的染菌情況（染菌情況（11個個/ml/ml）發發酵過程的異常現象酵過程的異常現象菌體生長差；菌體生長差；pHpH值過高或過低；值過高或過低；溶解氧水平異常；溶解氧水平異常；泡沫過多；泡沫過多；菌體濃度過高或過低；菌體濃度過高或過低；COCO2 2排放異常排放異常溶溶解氧水平異常變化顯示染菌解氧水平異常變化顯示染菌發酵時間發酵時間溶氧濃度溶氧濃度正常發酵正常發酵污染噬菌體污染噬菌體發酵時間發酵時間溶氧濃度溶氧濃度正常發酵正常發酵污染好氣性雜菌污染好氣性雜菌污染嫌氣性雜菌污染嫌氣性雜菌COCO2 2異常顯示染菌異常顯示染菌Y工藝一定，尾氣中工藝一定，尾氣中COCO2 2量變化有一定規律量變化有一

10、定規律Y污染雜菌污染雜菌，糖耗加快，尾氣中，糖耗加快，尾氣中COCO2 2量增加量增加Y污染噬菌體污染噬菌體，糖耗減慢，尾氣中，糖耗減慢，尾氣中COCO2 2量減少量減少噬菌體是什么？噬菌體是什么？噬菌體是病毒的一種，是一種極微噬菌體是病毒的一種，是一種極微小的生物，體積是細菌的小的生物，體積是細菌的1/10001/1000左左右，它可以通過細菌過濾器，只有右，它可以通過細菌過濾器，只有在電子顯微鏡下才能看到。在電子顯微鏡下才能看到。26消除潛在的污染隱患-1涉及菌體相關的操作要盡可能在生物安全柜中進行；在菌體培養過程中，盡量不要打開瓶口。如果實在需要打開瓶口的話，必需在無菌的環境下操作。生物

11、安全柜和超凈臺應注意清潔和消毒；每年更換HEPA過濾膜。27 使用膠頭、移液器、電動移液器吸取溶液后，不能水平放置，以防液體進入。 一旦液體進入要及時更換濾膜，并做好消毒措施。消除潛在的污染隱患-228消除潛在的污染隱患-3普通大腸桿菌的轉化及劃線后平板建議用石蠟膜完全密封后培養和放置。 29消除潛在的污染隱患-4菌液培養時將蓋擰緊30消除潛在的污染隱患-5菌體相關垃圾處理： 生物安全柜或處理菌體的超凈臺應配備密封垃圾桶，以防止污染源外泄； 帶有菌體的垃圾要做到當日滅菌； 如果當日不能滅菌，應使用垃圾袋密封后放置。31消除潛在的污染隱患-6分光光度計周圍：菌體相關的廢液建議收集到專門密閉容器，

12、每日滅菌；盛放過菌液的比色皿應注意清洗，清洗液同上處理。32消除潛在的污染隱患-7高壓滅菌后的槍頭，務必烘干使用33消除潛在的污染隱患-8玻璃器皿特別是菌體培養用器具使用前用鋁箔包裹后，在180干熱滅菌。34消除潛在的污染隱患-9 培養裝置應經常清洗消毒； 水浴搖床中的水要經常更換，長時間不用要將水排空，擦拭干凈放置。35消除潛在的污染隱患-10在培養時最好使用無菌的棉塞（不要使用鋁箔覆蓋培養瓶）；不要使用潮濕或臟的瓶塞。滅菌時滅菌時培養時培養時36消除潛在的污染隱患-11接觸菌體頻率高，空隙多容易隱匿菌體的器具要經常清洗消毒。StandsCentrifuge & its rotor 37消除

13、潛在的污染隱患-12臟的移液器反復使用的電擊槽與噬菌體污染的培養液接觸過的電極或buffer染菌原因分析就是總結染菌的教訓，防染菌原因分析就是總結染菌的教訓，防范于未然。范于未然。主要染菌原因：主要染菌原因： 種子帶菌種子帶菌 無菌空氣帶菌無菌空氣帶菌 設備滲漏設備滲漏 滅菌不徹底滅菌不徹底 操作失誤操作失誤 技術管理不善技術管理不善（1 1）染菌的時間分析染菌的時間分析種子培養階段：種子，滅菌，操作；種子培養階段：種子，滅菌，操作；發酵前期：種子，滅菌，操作；發酵前期：種子，滅菌，操作；發酵后期：空氣，補料，設備滲漏，泡沫發酵后期：空氣，補料，設備滲漏，泡沫（2 2）染菌的雜菌種類分析：染菌

14、的雜菌種類分析：污染耐熱芽孢桿菌：培養基或設備滅菌不徹底；污染不耐熱雜菌：種子帶菌、空氣除菌不徹底、設備滲漏或操作問題；污染淺綠色菌落雜菌：冷卻盤管滲漏引起；污染霉菌：無菌室滅菌不徹底，或操作問題；污染酵母菌：糖液滅菌不徹底。（3 3）染菌的規模分析染菌的規模分析 大批量發酵罐染菌：種子、空氣；大批量發酵罐染菌：種子、空氣； 前期：種子帶菌，滅菌問題；前期：種子帶菌，滅菌問題； 中中后期：空氣帶菌；后期：空氣帶菌； 部分發酵罐染菌：部分發酵罐染菌： 個別發酵罐連續染菌：設備滲漏個別發酵罐連續染菌：設備滲漏（1 1）種子帶菌及其防止）種子帶菌及其防止原原因因 ：菌菌種培養或保藏過程染菌、培養基及

15、用具滅菌不徹底、菌種移接種培養或保藏過程染菌、培養基及用具滅菌不徹底、菌種移接過程污過程污染染措施：措施： 嚴格控制無菌室污染，嚴格嚴格控制無菌室污染，嚴格無菌操作無菌操作； 種子保存管的種子保存管的棉花塞棉花塞應有一定的緊密度，且有一定的長度；應有一定的緊密度，且有一定的長度； 培養和保存培養和保存溫度溫度不宜有太大變化；不宜有太大變化； 菌種培養基或器具進行嚴格的菌種培養基或器具進行嚴格的滅菌滅菌處理處理 ； 每一級種子培養物均應經嚴格每一級種子培養物均應經嚴格檢查檢查，確保未受污染后才能使，確保未受污染后才能使用用（2 2）空氣帶菌及其防止）空氣帶菌及其防止空氣的凈化空氣的凈化工藝和設備

16、工藝和設備的設計的設計過濾介質過濾介質的選用和裝填的選用和裝填過濾介質的過濾介質的滅菌和管理滅菌和管理等等（3 3）培養基和設備滅菌不徹底染菌及防止）培養基和設備滅菌不徹底染菌及防止L 原料原料含較多菌含較多菌L 未充分排除罐內未充分排除罐內空氣空氣L 滅菌滅菌溫度、時間溫度、時間未控制好未控制好L 設備、管道存在設備、管道存在死角死角A.A.原料性狀：淀粉質原料，升溫過快或混合不均原料性狀：淀粉質原料，升溫過快或混合不均勻，易結塊，團塊中包埋的活菌不易殺滅；可勻，易結塊，團塊中包埋的活菌不易殺滅；可升溫前攪拌和加淀粉酶。升溫前攪拌和加淀粉酶。B.B.實罐滅菌時未充分排除罐內空氣：造成假壓，實

17、罐滅菌時未充分排除罐內空氣：造成假壓，升溫時，應打開排氣等閥門放氣。升溫時，應打開排氣等閥門放氣。C.C.連續滅菌時，蒸汽壓力波動大，培養基未達到連續滅菌時，蒸汽壓力波動大，培養基未達到滅滅 菌溫度，導致滅菌不徹底。菌溫度，導致滅菌不徹底。D.D.設備和管道存在設備和管道存在“死角死角” 死角：由于操作、設備結構、安裝或人為造死角：由于操作、設備結構、安裝或人為造成的屏障等原因，引起蒸汽不能有效到達或不能成的屏障等原因，引起蒸汽不能有效到達或不能充分到達預定應該到達的局部滅菌部位，從而不充分到達預定應該到達的局部滅菌部位，從而不能達到徹底滅菌的要求。能達到徹底滅菌的要求。常見的設備、管道常見的

18、設備、管道“死角死角” 發酵罐的發酵罐的“死角死角”：不銹鋼襯里破裂造成死角，：不銹鋼襯里破裂造成死角，發酵罐罐底膿皰狀積垢發酵罐罐底膿皰狀積垢。2022-7-8法蘭連接不當造成的法蘭連接不當造成的“死角死角” ” 2022-7-8滅菌時蒸汽不易通達的滅菌時蒸汽不易通達的“死角死角”及其消除方法及其消除方法（4 4）設備滲漏染菌及防止）設備滲漏染菌及防止原因原因發酵罐、補糖罐、冷卻盤管、管道閥門等，因加工制作不良發酵罐、補糖罐、冷卻盤管、管道閥門等，因加工制作不良或遭受腐蝕等原因而形成或遭受腐蝕等原因而形成微小漏孔微小漏孔后發生后發生滲漏染菌滲漏染菌。措施措施選用優質材料、科學合理加工、經常檢

19、查。選用優質材料、科學合理加工、經常檢查。（5 5）操作失誤染菌及防止）操作失誤染菌及防止淀粉原料采用實罐滅菌，淀粉原料采用實罐滅菌，大顆粒大顆粒應先應先篩去篩去，再攪拌均勻，再攪拌均勻，加入一定量淀粉酶加入一定量淀粉酶液化或糖化后滅菌液化或糖化后滅菌。在滅菌升溫時，要打開排氣閥門，在滅菌升溫時，要打開排氣閥門，排盡罐內冷空氣排盡罐內冷空氣。嚴防泡沫升頂嚴防泡沫升頂，可添加消泡劑防止泡沫的大量產生。，可添加消泡劑防止泡沫的大量產生。嚴格嚴格控制滅菌溫度控制滅菌溫度，避免蒸汽壓力的波動過大。，避免蒸汽壓力的波動過大。發酵過程越來越多采用自動控制，發酵過程越來越多采用自動控制，控制儀器控制儀器如用

20、化學試劑如用化學試劑滅菌滅菌，一定要，一定要徹底徹底。（6 6）噬菌體污染及其防治）噬菌體污染及其防治 染噬菌體對發酵的影響染噬菌體對發酵的影響發酵過程如受噬菌體侵染，一般發生溶菌，隨之出現發酵發酵過程如受噬菌體侵染，一般發生溶菌，隨之出現發酵遲緩或停止，而且往往會反復連續感染，使生產無法進行，遲緩或停止，而且往往會反復連續感染，使生產無法進行，甚至使種子全部喪失，對發酵威脅很大。甚至使種子全部喪失，對發酵威脅很大。 噬菌體污染根本原因噬菌體污染根本原因 生產中把生產中把活菌體排放到環境中活菌體排放到環境中，造成了自然界中相應噬，造成了自然界中相應噬菌體大量增殖。菌體大量增殖。 這些噬菌體隨風

21、沙塵土和空氣流動到處傳播，有可能潛這些噬菌體隨風沙塵土和空氣流動到處傳播，有可能潛入生產的各個環節，尤其是通過空氣系統進入種子室、種子入生產的各個環節，尤其是通過空氣系統進入種子室、種子罐、發酵罐。罐、發酵罐。噬菌體的防治噬菌體的防治E嚴禁活菌體排放嚴禁活菌體排放，切斷噬菌體的，切斷噬菌體的“根源根源”；E凈化生產環境凈化生產環境，消滅污染源；，消滅污染源；E保證純種培養保證純種培養，嚴防種子本身帶噬菌體，特別是溶源性，嚴防種子本身帶噬菌體，特別是溶源性 噬菌體；噬菌體；E輪換使用菌種輪換使用菌種或或使用抗性菌株使用抗性菌株。2 2、染菌的處理、染菌的處理染菌后處理染菌后處理p染菌后必須對所有

22、相關原料、儀器設備、管道等進行染菌后必須對所有相關原料、儀器設備、管道等進行徹徹底滅菌底滅菌。p盡量盡量查明染菌原因查明染菌原因，以免重復污染。，以免重復污染。3.污染原因分析主要原因：主要原因： 種子帶菌種子帶菌 無菌空氣帶菌無菌空氣帶菌 設備滲漏設備滲漏 滅菌不徹底滅菌不徹底 操作失誤操作失誤 技術管理不善技術管理不善從污染時間看：早期污染可能與從污染時間看：早期污染可能與接種操作不當接種操作不當有關；后期污染可能與及中間補料有關。有關；后期污染可能與及中間補料有關。從雜菌種類看：從雜菌種類看：耐熱芽孢桿菌：與有關耐熱芽孢桿菌：與有關球菌、無芽孢桿菌：與球菌、無芽孢桿菌：與 有關有關淺綠色

23、菌落的雜菌：與水有關，即冷卻盤管滲漏淺綠色菌落的雜菌：與水有關，即冷卻盤管滲漏霉菌：與有關，即無菌室滅菌不徹底或操作問題霉菌：與有關，即無菌室滅菌不徹底或操作問題酵母菌：糖液滅菌不徹底或放置時間較長酵母菌：糖液滅菌不徹底或放置時間較長 2022-7-8從染菌幅度看：各個發酵罐或多數發酵罐染菌，且所污染的是同一種雜菌，一般是空氣系統問題，若個別罐連續染菌，一般是設備問題。2022-7-81）從污染雜菌的種類分析污染耐熱芽孢桿菌：培養基或設備滅菌不徹底；污染不耐熱雜菌：種子帶菌、空氣除菌不徹底、設備滲漏或操作問題；污染淺綠色菌落雜菌：冷卻盤管滲漏引起；污染霉菌：無菌室滅菌不徹底，或操作問題；污染酵

24、母菌：糖液滅菌不徹底。2）從污染時間分析發酵前期染菌：種子帶菌、培養基或設備滅菌不徹底、操作不當或空氣帶菌；發酵后期染菌：中間補料污染、設備滲漏或操作問題。3）從染菌程度分析多個罐染菌：種子帶菌、空氣系統問題；個別罐染菌：設備問題、操作不當。物料、培養基、中間補料要滅菌；發酵設備及輔助設備（空氣過濾裝置、各種發酵罐進出口連接裝置）和管道要滅菌；好氣發酵通入的空氣要除菌；種子無污染；接種無菌操作過關；為了保持發酵的長期無菌狀態，需維持正壓。2022-7-8加熱滅菌法加熱滅菌法1 1輻射滅菌法輻射滅菌法2 2化學藥品滅菌法化學藥品滅菌法3 3過濾除菌法過濾除菌法4 4E滅菌：滅菌：用物理或化學的方

25、法殺死物料或設備用物理或化學的方法殺死物料或設備中所有的微生物。中所有的微生物。E消毒：消毒：用物理或化學的方法殺死空氣、地表用物理或化學的方法殺死空氣、地表以及容器和器具表面的微生物。以及容器和器具表面的微生物。 E防腐防腐: : 用物理或化學方法殺死或抑制微生物的用物理或化學方法殺死或抑制微生物的生長和繁殖生長和繁殖 。 消毒與滅菌的區別消毒與滅菌的區別消毒概念來自于衛生工作，僅僅是殺滅生物體或非生物體表消毒概念來自于衛生工作，僅僅是殺滅生物體或非生物體表面的微生物，而滅菌則是殺滅所有的生命體。因此，面的微生物，而滅菌則是殺滅所有的生命體。因此，消毒一消毒一般只能殺死營養細胞，不能殺死細胞

26、芽孢及真菌孢子，適合般只能殺死營養細胞，不能殺死細胞芽孢及真菌孢子，適合于發酵車間的環境和設備、器具的無菌處理。滅菌則適合培于發酵車間的環境和設備、器具的無菌處理。滅菌則適合培養基等物料的無菌處理。養基等物料的無菌處理。1. 1.干熱空氣滅菌法干熱空氣滅菌法在干燥環境（干熱在干燥環境（干熱空氣）進行滅菌的空氣）進行滅菌的技術。技術。滅菌溫度滅菌溫度/ /C C170170160160150150140140121121滅菌時間/min60120150180過夜表表1 1 干熱空氣滅菌需要的溫度和時間干熱空氣滅菌需要的溫度和時間適用于玻璃、陶瓷、金屬等制品。適用于玻璃、陶瓷、金屬等制品。2.2.

27、濕熱滅菌法濕熱滅菌法濕熱滅菌法是指用飽和水蒸氣、沸水或流通蒸汽進行滅菌的濕熱滅菌法是指用飽和水蒸氣、沸水或流通蒸汽進行滅菌的方法，以高溫高壓水蒸氣為介質，由于蒸汽潛熱大，穿透力方法，以高溫高壓水蒸氣為介質，由于蒸汽潛熱大，穿透力強，容易使蛋白質變性或凝固，最終導致微生物的死亡，所強，容易使蛋白質變性或凝固，最終導致微生物的死亡，所以該法的滅菌效率比干熱滅菌法高，以該法的滅菌效率比干熱滅菌法高，是藥物制劑生產過程中是藥物制劑生產過程中最常用的滅菌方法最常用的滅菌方法。濕熱滅菌法的類型濕熱滅菌法的類型煮沸滅菌法煮沸滅菌法巴氏消毒法巴氏消毒法間歇滅菌法間歇滅菌法高壓蒸氣法高壓蒸氣法（1）煮沸滅菌法n

28、營養細胞營養細胞水中煮沸水中煮沸1520min1520min；n芽孢芽孢水中煮沸水中煮沸12h12h。u適用于一般食品及器材的滅菌。適用于一般食品及器材的滅菌。（2）巴氏消毒法亦稱低溫消毒法，冷殺菌法，是亦稱低溫消毒法，冷殺菌法，是一種利用較低的溫度既可殺死病一種利用較低的溫度既可殺死病菌又能保持物品中營養物質風味菌又能保持物品中營養物質風味不變的消毒法。不變的消毒法。7070，保持，保持1530min1530min，殺死病原，殺死病原菌和部分微生物營養體。菌和部分微生物營養體。巴氏殺菌機巴氏殺菌機（3）間歇滅菌法利用反復多次的流通蒸汽加熱，殺滅所有微生物，包括利用反復多次的流通蒸汽加熱，殺滅

29、所有微生物，包括芽胞。方法同流通蒸汽滅菌法，但要重復芽胞。方法同流通蒸汽滅菌法，但要重復3 3次以上，每次次以上，每次間歇是將要滅菌的物體放到間歇是將要滅菌的物體放到3737孵箱過夜，目的是使芽孵箱過夜，目的是使芽胞發育成繁殖體。若被滅菌物不耐胞發育成繁殖體。若被滅菌物不耐100100高溫，可將溫度高溫，可將溫度降至降至75758080，加熱延長為，加熱延長為30306060分鐘，并增加次數。分鐘，并增加次數。適用于不耐高熱的含糖或牛奶的培養基。適用于不耐高熱的含糖或牛奶的培養基。4.4.高壓蒸汽法高壓蒸汽法適用行業：適用行業：發酵工業、醫療保健、食品檢測、微生物實驗室等。適用范圍：適用范圍：

30、培養基、發酵罐以及附屬設備和管道、玻璃器皿、工作服等的滅菌。方法：方法： 121121，103.42kPa103.42kPa，1520min1520min 生產中使用高壓蒸汽滅菌鍋的型號很多：生產中使用高壓蒸汽滅菌鍋的型號很多：手提式壓力滅菌器手提式壓力滅菌器立式壓力滅菌器立式壓力滅菌器臥式蒸氣高壓滅菌鍋臥式蒸氣高壓滅菌鍋注意事項注意事項n滅菌包不宜過大過緊，滅菌器內物品的放置總量不應超過滅菌器柜室容積的滅菌包不宜過大過緊，滅菌器內物品的放置總量不應超過滅菌器柜室容積的85%85%。各包。各包之間留有空隙，以便于蒸汽流通、滲入包裹中央，排氣時蒸汽迅速排出，保持物品干之間留有空隙，以便于蒸汽流通

31、、滲入包裹中央，排氣時蒸汽迅速排出，保持物品干燥。燥。n盛裝物品的容器應有孔，若無孔，應將容器蓋打開。盛裝物品的容器應有孔，若無孔，應將容器蓋打開。n布類物品放在金屬、搪瓷類物品之上。布類物品放在金屬、搪瓷類物品之上。n滅菌鍋密閉前，應將冷空氣充分排空。滅菌鍋密閉前，應將冷空氣充分排空。n隨時觀察壓力及溫度情況。隨時觀察壓力及溫度情況。n注意安全操作，每次滅菌前，應檢查滅菌器是否處于良好的工作狀態。注意安全操作，每次滅菌前，應檢查滅菌器是否處于良好的工作狀態。n滅菌完畢后減壓不要過猛，壓力表回歸滅菌完畢后減壓不要過猛，壓力表回歸“0”0”位后才可打開蓋或門。位后才可打開蓋或門。3.火焰滅菌法采

32、用火焰直接灼燒滅菌。適用范圍：接種針、試管口、三角瓶口等。射線滅菌是利用高能量的電磁輻射和微粒輻射來殺射線滅菌是利用高能量的電磁輻射和微粒輻射來殺死微生物。死微生物。常用的射線是常用的射線是紫外線紫外線和和電離輻射電離輻射。1.1.紫外線（紫外線（ultravioletultraviolet，UVUV）：）：波長波長136136nmnm3 39 90nm0nm的紫外線（包括日光中的紫外線）具有殺的紫外線（包括日光中的紫外線）具有殺菌作用，以菌作用，以260nm260nm左右的最強，與嘌呤和嘧啶的吸收光譜高峰左右的最強，與嘌呤和嘧啶的吸收光譜高峰一致。紫外線可使一致。紫外線可使DNADNA鏈上相

33、鄰的兩個胸腺嘧啶共價結合而形鏈上相鄰的兩個胸腺嘧啶共價結合而形成二聚體，阻礙成二聚體，阻礙DNADNA正常轉錄，導致微生物的變異或死亡。正常轉錄，導致微生物的變異或死亡。紫外線穿透力較弱，普通玻璃、紙張、塵埃、水蒸汽等均能紫外線穿透力較弱，普通玻璃、紙張、塵埃、水蒸汽等均能阻檔紫外線，一般用于阻檔紫外線，一般用于手術室、病房、實驗室的空氣消毒手術室、病房、實驗室的空氣消毒。紫外線可損傷皮膚和角膜，應注意防護。紫外線可損傷皮膚和角膜，應注意防護。2022-7-82022-7-82.電離輻射：包括射線、X射線和加速電子等，對各種微生物均有致死作用，細菌繁殖體對射線比芽胞要敏感。其機制是直接或者通過

34、產生游離基，破壞DNA分子的共價鍵。輻射源常用同位素鈷60，用于一次性醫用塑料制品批量滅菌。2022-7-8常用試劑有常用試劑有過氧化氫、過氧乙酸、環氧乙烷、過氧化氫、過氧乙酸、環氧乙烷、鹵素、甲醛、高錳酸鉀、季銨鹽（如新潔爾鹵素、甲醛、高錳酸鉀、季銨鹽（如新潔爾滅）、臭氧滅）、臭氧等。等。些物質易與微生物細胞中的一些成分產生化些物質易與微生物細胞中的一些成分產生化學反應，如使蛋白質變性、酶類失活、破壞學反應，如使蛋白質變性、酶類失活、破壞細胞膜通透性而殺滅微生物。細胞膜通透性而殺滅微生物。2022-7-8由于化學試劑也會與培養基中的一些成分作由于化學試劑也會與培養基中的一些成分作用，而且加入

35、培養基后不易去除，它用，而且加入培養基后不易去除，它不能用不能用于培養基的滅菌于培養基的滅菌，但染菌后的培養基可用化，但染菌后的培養基可用化學藥劑處理。學藥劑處理。常見的化學滅菌劑（見表常見的化學滅菌劑（見表4-44-4）2022-7-8來蘇爾（Lysol）為甲酚、植物油、氫氧化鈉的皂化液（含甲酚50%）。無色或黃色液體。使用方法和范圍：12%溶液用于手消毒（也可用于處理染菌桌面），35%溶液用于器械物品消毒，510%溶液用于環境、排泄物的消毒。對一般致病菌包括抗酸菌殺菌效果確實，對芽孢則需高濃度長時間才有殺菌作用。2022-7-8新潔爾滅，別名為苯扎溴銨，為溴化二甲基芐基烴銨的混合物。創面消

36、毒用0.01%溶液，皮膚及粘膜消毒用0.1%溶液，手術前洗手用0.05%0.1%溶液浸泡5分鐘；手術器械消毒用0.1%溶液(內加0.5%亞硝酸鈉以防生銹)煮沸15分鐘,再浸泡30分鐘。2022-7-8過濾除菌法是利用過濾方法阻截微生物以達到除菌的目的。適用于熱敏性物質和空氣的除菌。是將液體或氣體用微孔薄膜過濾，使大于孔徑的細菌等微生物顆粒阻留，從而達到除菌目的。用于遇熱容易變性而失效的試劑或培養液。 2022-7-8工業上對培養基、發酵設備、管道、閥門、流加物料等都采用蒸汽滅菌蒸汽滅菌。（一）濕熱滅菌（一）濕熱滅菌濕熱滅菌是指利用飽和蒸汽滅菌的方法。原理原理：借助蒸汽釋放的熱能，尤其是飽和蒸汽

37、冷凝時瞬間內釋放的大量潛熱，可使微生物菌體細胞溫度迅速升高，促使蛋白質、酶和核酸分子內部的化學鍵（尤其是氫鍵）受到破壞二引起不可逆變性，造成微生物死亡。適用范圍適用范圍：培養基、設備、管路及閥門的滅菌。優點優點：滅菌效果可靠、徹底；蒸汽來源容易，本身無毒，操作方便、費用低，易管理等。缺點缺點：對營養成分的破壞較強。葡萄糖滅菌溫度過高會產生糠醛，培養基顏色變深，糠醛對菌體生長不利。如果培養基中的葡萄糖濃度很低，就不用單獨滅菌，如果葡萄糖很高，培養條件又很嚴格，就單獨滅菌。量少的話過濾，量多的話，實驗室一般115度滅菌15min足夠了，工廠一般115度2030min。影響滅菌的因素：影響滅菌的因素

38、：滅菌時間；滅菌溫度；其他因素（如培養基成分、培養基的物理狀態、pH值、攪拌、泡沫等）發酵工業上最發酵工業上最常常用的滅菌條件：用的滅菌條件：121121C C，30min30min。致死溫度：致死溫度：殺死微生物的極限溫度稱為致死溫度。殺死微生物的極限溫度稱為致死溫度。致死時間：致死時間：在致死溫度下，殺死全部微生物所需在致死溫度下，殺死全部微生物所需要的時間稱為致死時間。要的時間稱為致死時間。一般認為滅菌徹底與否的是以一般認為滅菌徹底與否的是以能否殺死芽孢細菌能否殺死芽孢細菌為為標準。標準。（二）分批滅菌（二）分批滅菌定義定義：培養基的分批發酵是指將配制好的培養基放在發酵罐或其他貯存容器中，通入蒸汽，將培養基及所用設備一起滅菌的操作過程，也稱為間歇滅菌或實罐滅菌（實消）。適用范圍適用范圍：中小型發酵罐優點：優點：設備要求簡單，無需另外設置加熱冷卻裝置；操作要求低，適合手動操作；適合于小規模生產；適合于固體物質含量大的培養基滅菌。缺點：缺點：升溫降溫較慢，培養基營養物質損失較多，滅菌后培養基質量會下降；滅菌過程需反復進行加熱和冷卻，能耗較高；間歇式操作，發酵罐利用率較低；不適合于大規模生產的培養基滅菌。豐原生化豐原生化操作步驟操作步驟配料罐配料罐空氣分