1、青島農(nóng)業(yè)大學(xué)畢業(yè)論文題 目： 紫扇貝線粒體cox基因片段克隆及序列分析 姓 名： 鄒坦坦 學(xué) 院： 海洋科學(xué)與工程學(xué)院 專 業(yè)： 水產(chǎn)養(yǎng)殖 班 級(jí)： 09.2 學(xué) 號(hào)： 20093618 指導(dǎo)教師： 李朝霞 16目錄中文摘要·······························&#

2、183;····························1Abstract····················

3、;········································1引言·········&#

4、183;·················································&#

5、183;····21 材料與方法············································

6、············31.1 實(shí)驗(yàn)材料····································

7、83;···················31.2 實(shí)驗(yàn)試劑·····························

8、···························31.3 方法······················

9、;······································31.3.1 簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)·········

10、3;········································31.3.2 DNA提取·······

11、3;···············································41.3.3 PCR擴(kuò)增

12、3;·················································

13、3;···41.3.4 染色及凝膠電泳············································&#

14、183;···51.3.5 染色拍照············································

15、83;·········51.3.6 DNA回收······································

16、83;················51.3.7 連接································

17、··························51.3.8 轉(zhuǎn)化······················

18、83;···································51.3.9 挑單菌落培養(yǎng)測(cè)序············

19、··································61.3.10 測(cè)序及序列分析·············

20、83;·································62結(jié)果與分析···············&#

21、183;········································62.1 基因組DNA提取·······&

22、#183;··········································62.2 PCR擴(kuò)增·····

23、83;·················································

24、83;72.3紫扇貝cox基因測(cè)序結(jié)果·········································72.4 同源性對(duì)比····&

25、#183;·················································8

26、2.5 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹················································&

27、#183;113 討論················································&

28、#183;············12參考文獻(xiàn)····································&

29、#183;······················14紫扇貝線粒體cox基因片段克隆及序列分析水產(chǎn)養(yǎng)殖專業(yè) 鄒坦坦指導(dǎo)教師 李朝霞摘要：目前，線粒體DNA序列廣泛的運(yùn)用于鑒定和區(qū)分物種，以及解決相應(yīng)生物系統(tǒng)的進(jìn)化關(guān)系問題。尤其是相對(duì)于細(xì)胞核基因，動(dòng)物界的物種在進(jìn)行親緣關(guān)系鑒定時(shí)通常都更多的采用線粒體基因，因?yàn)閙tDNA表現(xiàn)為母系遺傳，其結(jié)構(gòu)類型是反映母系脈絡(luò)的重要指標(biāo)。在多

30、數(shù)動(dòng)物種類中，線粒體基因都存在比較明顯的序列變異。本文采用同源克隆技術(shù)，以引進(jìn)的秘魯紫扇貝閉殼肌為材料，進(jìn)行紫扇貝線粒體DNA（mtDNA）細(xì)胞色素c氧化酶第亞基（cox）部分序列的克隆及序列分析。序列分析結(jié)果表明，該序列在不同物種甚至扇貝種間存在明顯的序列變異，紫扇貝與海灣扇貝同源性最高，達(dá)到85.55%，其次為櫛孔扇貝和蝦夷扇貝，同源性分別達(dá)到76.81%和72.62%。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為鑒別紫扇貝與其雜交扇貝之間的親緣關(guān)系與遺傳差異提供了分子生物學(xué)方面的依據(jù)。關(guān)鍵詞：紫扇貝；線粒體DNA；cox基因；系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系Cloning and sequence analysis of mit

31、ochondrial coxgene of Argopecten purpuratusAquaculture    Tantan Zou Tutor     Zhaoxia LiAbstract: The gene sequence of mitochondrial DNA has been more widely used in identification and distinction between species, as well as analysis

32、of evolutionary relationship of biological systems. Relative to that of nuclear genes, mitochondrial genes was especially used in genetic research and relationship identification. The mtDNA is maternal inheritance and the structure type would be the important index of reflecting the matrilineal gene

33、tic systems. In most of the animal species, the mitochondrial genes showed the sequence variation obviously. In this study, the partial of the mitochondrial cytochrome oxidase subunitgene (cox) was amplified from scallop Argopecten purpuratus and the coxsequences were aligned using the Clustal

34、X and NJ trees were constructed. Comparison of the sequences of coxrevealed that the highest identity (85.55%) was found between that of the A. purpuratus and A. irradias. The homology was 76.81% and 72.62% relatively, when compared with Chlamys Farreri and Patinopecten yessoensis. The results would

35、 provide the evidence for the relationship identification and genetic differences between Argopecten purpuratus and its hybrid scallops. Key words: Argopecten purpuratus; Mitochondrial DNA; coxgene; phylogenetic relationship引言紫扇貝(Argopecten purpuratus) 屬軟體動(dòng)物門（Mollusca）、雙殼綱（Lamell

36、ibranchia）、翼形亞綱（Pterimorphia）、珍珠貝目（Pterioida）、扇貝科（Pectinidae）、扇貝屬。原產(chǎn)自南太平洋東岸1，是一種速生型中型扇貝2，它的生長(zhǎng)速度快，殼長(zhǎng)最長(zhǎng)可以達(dá)到為15cm，殼體比較寬大，殼形優(yōu)美，閉殼肌肥大，出肉率高，味道鮮美，具有很高的商品價(jià)值，是世界上公認(rèn)的優(yōu)良扇貝品種。在原產(chǎn)地，一般生長(zhǎng)14-16個(gè)月就可以長(zhǎng)到9cm3，即可達(dá)到商品規(guī)格進(jìn)行銷售。1998年智利紫扇貝年產(chǎn)量已經(jīng)達(dá)到1.6萬t4。2008年，成功從秘魯引進(jìn)了這一品種，并在2009年人工育苗養(yǎng)殖成功。紫扇貝雖然個(gè)體比海灣扇貝大， 壽命比海灣扇貝長(zhǎng)，但其溫度適應(yīng)范圍較窄在青島地區(qū)

37、以南（包括青島）不能度夏，在北方海區(qū)則不能越冬，在我國(guó)大部分地區(qū)不能直接養(yǎng)殖，這大大限制了紫扇貝在中國(guó)的養(yǎng)殖發(fā)展前景。由于海灣扇貝和紫扇貝的主要經(jīng)濟(jì)性狀互補(bǔ)，且兩者同屬，因此有可能通過種間雜交的方法培育出生長(zhǎng)快、個(gè)體大、溫度耐受范圍廣的多年生扇貝。目前通過兩種扇貝的種間雜交試驗(yàn)5，獲得了理想的效果，雜交子代比墨西哥灣扇貝的平均殼高增加24.65%、殼長(zhǎng)增加27.40%、體重增加84.14%，雜種優(yōu)勢(shì)十分明顯6。雜交種經(jīng)推廣有望緩解了我國(guó)北方扇貝養(yǎng)殖業(yè)種質(zhì)退化和育苗過程中死亡率高的問題7-8。目前，紫扇貝與櫛孔扇貝及墨西哥灣扇貝間的雜交工作也取得了一定的進(jìn)展。然而，由于雜交子代的外部形態(tài)與親本有

38、一定的相似性，僅通過外部形態(tài)的方式來進(jìn)行子代鑒定的結(jié)果是不可靠的，因此，需要從其分子基礎(chǔ)方面提供理論支持。對(duì)于紫扇貝雜交子代的鑒定，采用了SSR、ITS等多種方法，但是鑒于不同種間形成的雜交子代的遺傳結(jié)構(gòu)復(fù)雜性，尚需開發(fā)出更多能夠進(jìn)行子代鑒定的技術(shù)方法。一般來講，相對(duì)于細(xì)胞核基因，動(dòng)物界的物種在進(jìn)行基因方面的研究和DNA的鑒定時(shí)通常都更多的采用線粒體基因，因?yàn)閙tDNA表現(xiàn)為母系遺傳，其結(jié)構(gòu)類型是反映母系脈絡(luò)的重要指標(biāo)。細(xì)胞色素C氧化酶是線粒體呼吸鏈電子傳遞的終末復(fù)合物，是含血紅素-銅終端氧化酶的超家族成員之一，是調(diào)節(jié)線粒體氧化能力的關(guān)鍵部位。細(xì)胞色素C氧化酶亞基（cox）是細(xì)胞色素C氧化酶具

39、有酶催化活性的3個(gè)亞基之一。在多數(shù)動(dòng)物種類中，線粒體基因，特別是其中的cox基因等都存在比較明顯的序列變異，它的進(jìn)化速度快，包含從種內(nèi)到種間的遺傳進(jìn)化信息，而且細(xì)胞色素氧化酶亞基靠近5端的序列可以有效的對(duì)各物種進(jìn)行基因鑒定9，可用于比較生物體進(jìn)化之間的相互關(guān)系10。線粒體cox基因部分序列足夠保守，可以通過引物進(jìn)行大范圍擴(kuò)增，并且還有足夠的變異來區(qū)分不同物種的DNA序列，被廣泛用于分析絳蟲11及靈長(zhǎng)類12的系統(tǒng)發(fā)育規(guī)律，最近也被用來分析水產(chǎn)動(dòng)物的分子進(jìn)化及親緣關(guān)系13-14。所以線粒體cox基因一般用作生物領(lǐng)域的 "DNA條形碼" 14。因此，線粒體cox基因序列具有廣闊的

40、應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)以紫扇貝為材料，通過同源克隆技術(shù)獲得其線粒體cox基因部分序列，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析其進(jìn)化關(guān)系，從而明確紫扇貝線粒體cox基因部分序列能否成為理想的種間遺傳標(biāo)記。1 材料與方法 1.1 實(shí)驗(yàn)材料本實(shí)驗(yàn)采用的紫扇貝為2008年從秘魯引進(jìn)的紫扇貝（Argopecten purpuratus）后代的閉殼肌凍存品，樣品保存于-70。1.2 實(shí)驗(yàn)試劑海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒（TIANamp Marine Animals DNA Kit離心柱型，50preps）；rTaq酶（大連寶生物公司產(chǎn)品）；PCR試劑（Buffer、MgCl2、dNTPs，為大連寶生物公司產(chǎn)品）；瓊脂糖凝

41、膠DNA回收試劑盒（TIANgel Midi Purification Kit普通離心柱型，50preps）。1.3 方法1.3.1 簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)在NCBI PubMed數(shù)據(jù)庫中查找櫛孔扇貝（Accession: NC_012138.1）、海灣扇貝（Accession: AF526204.1）、蝦夷扇貝（Accession: AB033666.1）等物種mtDNA基因的cox片段，通過DNAman軟件進(jìn)行序列的同源性比對(duì)，根據(jù)保守區(qū)域利用Primer5.0設(shè)計(jì)引物。引物序列如下：coxF1：TWATTGTRGGAATGTGGTC coxR1：CGATTRCCAACCAWYAAAGGACG co

42、xF2：AGTTGGATRATGCGGYTSGAG coxR2：GTAGGMACRGCAATHARCAT簡(jiǎn)并堿基： R:AG Y:CT M:AC K:GT S:GC W:AT H:ATC B:GTC V:GAC D:GAT N:ATGC引物由上海生工生物科技有限公司進(jìn)行合成。1.3.2 DNA提取采用海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒。（1）切取不多于30mg的紫扇貝閉殼肌凍存組織，放入裝有200lGA緩沖液的離心管中，渦旋振蕩15秒。（2）加入20l蛋白酶K（20mg/ml）溶液，用渦旋振蕩的方式混勻，于56水浴中加熱半小時(shí)，觀察溶液直至閉殼肌組織完全溶解。（3）加入200l緩沖液GB，充分

43、顛倒混勻，70水浴加熱10分鐘。（4）加入200l無水乙醇，充分顛倒混勻。（5）將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12,000 rpm(13,400×g）離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。（6）向吸附柱CB3中加入500l緩沖液GD（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇），12,000 rpm（13,400×g）離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。（7）向吸附柱CB3中加入700ul漂洗液PW，12,000 rpm（13,400×g）離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。（8）向吸附柱C

44、B3中加入900ul漂洗液PW，12,000 rpm（13,400×g）離心30秒，倒掉廢液。（9）將吸附柱CB3放回收集管中，12,000 rpm（13,400×g）離心2分鐘，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中的殘余漂洗液。（10）將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中間部位懸空滴加50-200l洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5分鐘，12,000 rpm（13,400×g）離心2分鐘，然后將溶液收集到離心管中。DNA產(chǎn)物保存在-20，以防DNA降解。將提取的DNA于0.8%的瓊脂糖凝膠電泳中檢測(cè)濃度及純度（圖1）。1.3.

45、3 PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增體系為20l，其中ddH2O 13.6l，10×PCR Buffer 2.0l，dNTP 1.6l，5U/l Taq 0.2l，DNA模板1l，正反向引物各0.8l。反應(yīng)在PTC-200型PCR儀(美國(guó)MJ Research 公司) 上進(jìn)行。擴(kuò)增條件為： 94預(yù)變性10 min；94變性30 s，45退火30 s72延伸1 min，共進(jìn)行33個(gè)循環(huán)；72延伸5min。1.3.4 染色及凝膠電泳取5l PCR產(chǎn)物，分別與0.5l SYB Green染色劑混合。10min后，加入1l Loading Buffer。采用1瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電壓標(biāo)準(zhǔn)為5V/cm，電

46、泳時(shí)間為20min左右。1.3.5 染色拍照電泳完成后，小心取出瓊脂糖凝膠，放入凝膠攝像機(jī)中進(jìn)行紫外線下的觀察、采用核酸蛋白凝膠圖像管理系統(tǒng)（GEL DOC 2000）進(jìn)行PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析以及圖像采集。1.3.6 DNA回收采用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（TIANgel Midi Purification Kit普通離心柱型，50preps）（1）先在漂洗液W2 中加入無水乙醇。 將單一的目的DNA 條帶從瓊脂糖凝膠中切下，放入干凈的離心管中，稱取重量。（2） 向裝有膠塊的離心管中加入膠塊2 倍體積溶膠液，55水浴10min左右，其間不斷溫和地上下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解

47、。（3） 將上一步所得溶液加入一個(gè)吸附柱中（吸附柱放入收集管中），12,000 rpm (13,400×g )離心1 分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。1.3.7 連接pmd18-T 載體 1lPCR純化產(chǎn)物 2lddH2O 補(bǔ)齊至5l加入5l Solution 1 混勻； 16PCR儀中保溫過夜。1.3.8 轉(zhuǎn)化（1）向轉(zhuǎn)化管（含感受態(tài)細(xì)胞100l）中加入連接液（不超過10l），輕度搖晃，混勻后置于冰上30min；（2）將上述混合液轉(zhuǎn)移到預(yù)熱到42的水浴鍋中，熱休克90s（不要搖動(dòng)試管），然后將試管轉(zhuǎn)移到冰浴，冷卻1-2min；（3）向管中加入500l的LB培養(yǎng)液，然

48、后37培養(yǎng)1小時(shí)（搖床培養(yǎng)，50-100rpm）；（4）4000rpm離心1min，倒上清，加入50 l LB培養(yǎng)液混勻，取適量轉(zhuǎn)化細(xì)胞用滅過菌的玻璃棒均勻涂布在LB+Amp平板（100mlLB+50l Amp）上，室溫下放置幾分鐘；（5）倒置平板，37培養(yǎng)12-16小時(shí)。1.3.9挑單菌落培養(yǎng)測(cè)序（1）準(zhǔn)備LB+Amp培養(yǎng)液6-7ml；（2）挑單菌落置于培養(yǎng)液中；（3）300rpm，37培養(yǎng)3小時(shí)，做菌液PCR進(jìn)行檢測(cè)。不少于500l用于測(cè)序。1.3.10測(cè)序及序列分析將菌液送上海生工生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用DNAman5.0軟件進(jìn)行同源性分析。采用Mega3.1程序中的鄰接法（Ne

49、ighbor-joining Method，NJ）繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。2結(jié)果與分析 2.1 基因組DNA提取圖1為扇貝基因組DNA（條帶大于2000bp）提取結(jié)果，從圖中可以看出第3及第5組條帶最為明確清晰，無拖尾，無降解，產(chǎn)量高，可滿足后續(xù)的片段擴(kuò)增需要。圖1. 基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物 泳道1：分子量標(biāo)準(zhǔn) DL2000； 泳道2-6：模板DNA2.2 擴(kuò)增以紫扇貝的基因組DNA為模板，分別以四種引物組合F1R1、F1R2、F2R1和F2R2進(jìn)行擴(kuò)增（圖2），電泳結(jié)果顯示，引物組合F1R1、F1R2擴(kuò)增獲得清晰特異的電泳條帶，其中F1R1與F1R2的預(yù)期片段長(zhǎng)度分別為889bp和790bp，與電泳結(jié)

50、果相一致，本實(shí)驗(yàn)選擇由引物對(duì)F1R2擴(kuò)增片段進(jìn)行回收克隆。圖2. cox基因片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1.marker；2-5分別為F1R2、F2R2、F1R1、F2R1引物對(duì)擴(kuò)增結(jié)果2.3 紫扇貝cox基因測(cè)序結(jié)果將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物利用回收試劑盒進(jìn)行回收，經(jīng)連接轉(zhuǎn)化，挑取白色單菌落，進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，確定為目的片段，單菌落經(jīng)培養(yǎng)后送至上海生工生物有限公司測(cè)序，共獲得長(zhǎng)度為789bp的核苷酸片段，經(jīng)與NCBI數(shù)據(jù)庫中其他物種的cox片段比對(duì)同源性，確定所獲得序列為紫扇貝cox部分基因片段。該序列共編碼263個(gè)氨基酸，編碼氨基酸序列如下：1 ATAATGCGTTTAGAGTTGAGGCGTCCGGGAA

51、TATGGCTTCCTAGTTCTGAAGTCTATAAT1 I M R L E L R R P G I W L P S S E V Y N 61 GGAATTGTCACTCTTCACGCTATCATGATAATTTTCTTTTTTGTGATGCCTGTTTTAATT21 G I V T L H A I M I I F F F V M P V L I 121 GGTGGGTTTGGTAATTGGCTTTTACCAATAATGTTAGGTGCTATTGACATGAGGTTTCCT41 G G F G N W L L P I M L G A I D M R F P 181 CGACTAAATACA

52、TTTAGTTTTTGGGTGCTGCCTCCTGCTCTTTATTTGGTCATTGTTTCT61 R L N T F S F W V L P P A L Y L V I V S 241 TGTTTTATTGATTACGGTAGGGGAACTGGGTGGACTATGTACCCACCGCTATCAAGGACT81 C F I D Y G R G T G W T M Y P P L S R T 301 CCTTATTCTGGGGGGATGAGAACAGATTTAATAATCTTAGGTCTCCACTTAGCGGGAATT101 P Y S G G M R T D L I I L G L H L

53、A G I 361 AGGTCTTCAGCTGCTTCAATCAACTACTTAGTTACTTTTTTGAATGTTCGAAGAAAGGCT121 R S S A A S I N Y L V T F L N V R R K A 421 TTTAAGGCTGAATACTGTCCCCCCTTTGTTTGGGCTCTTTCTGTTACGAGGTTTTTGTTG141 F K A E Y C P P F V W A L S V T R F L L 481 TTGGTATCTCTTCCAGTTCTAGCCGGTGGGTTGACAATGTTGATTATAGACCGCCACTTT161 L V S L P

54、V L A G G L T M L I I D R H F 541 AACTGTAGGTTCTTTGATCCTTCGGGGGGGGGTGATCCGGTTTTGTTTCAGCATCTCTTT181 N C R F F D P S G G G D P V L F Q H L F 601 TGGTTCTTTGGTCATCCAGAAGTTTATGTTCTAATTTTACCTGGGTTTGGGCTAGTTTCT201 W F F G H P E V Y V L I L P G F G L V S 661 CATGTCCTGGTGTTTTATACTAAGAAGCTGCGAGTTTTTGGTTCAGTTGC

55、CATGATGTAC221 H V L V F Y T K K L R V F G S V A M M Y 721 GCTATAATTTCTATTGGTGTTTTAGGGTTTATTGTGTGGGGGCACCACATATATACAGTA241 A I I S I G V L G F I V W G H H I Y T V 781 GGGTTGGAT261 G L D 2.4 同源性對(duì)比NCBI數(shù)據(jù)庫中是世界各國(guó)受過分子生物學(xué)高級(jí)訓(xùn)練的工作人員通過來自各個(gè)實(shí)驗(yàn)室遞交的序列和同國(guó)際核酸序列數(shù)據(jù)庫（EMBL和DDBJ）交換數(shù)據(jù)建立的數(shù)據(jù)庫。從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載海灣扇貝（Argopecten irr

56、adians irradians）（NC_012977）、櫛孔扇貝（Chlamys farreri）（NC_012138）、蝦夷扇貝（Mizuhopecten yessoensis）（FJ595959）、真蛸（Octopus vulgaris）（AB158363）、菲律賓蛤仔（Ruditapes（Venerupis） philippinarum）（AB244412）、魁蚶（Scapharca broughtonii）（NC_020787）、雜色鮑（Haliotis diversicolor diversicolor）（AY319440）、中國(guó)對(duì)蝦（Fenneropenaeus chinensi

57、s）（NC_009679）、鋸緣青蟹（Scylla serrata）（FJ827758）、皺紋盤鮑（Haliotis discus hannai）（JF748806）的線粒體DNA cox序列，使用DNAMAN軟件，與紫扇貝cox片段進(jìn)行同源性比較。經(jīng)BLASTX序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)，紫扇貝cox與其他扇貝物種的同源性較高，其中，與海灣扇貝的的同源性最高，達(dá)到85.55%，其次為櫛孔扇貝和蝦夷扇貝，同源性分別達(dá)到76.81%和72.62%，紫扇貝與以上其他物種之間的同源性相對(duì)較低，介于57.03%-60.08%之間（圖3）。 圖3 . 不同物種間cox片段同源性比較2.5 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹在生物學(xué)中，進(jìn)

58、化樹用來表示物種之間的進(jìn)化關(guān)系，又稱"系統(tǒng)樹"、"系譜樹"。它可以根據(jù)各類生物間的親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，簡(jiǎn)明地表示生物的進(jìn)化歷程和親緣關(guān)系、物種之間的差異程度和基因間的進(jìn)化距離。將獲得的紫扇貝cox基因氨基酸序列和其他物種進(jìn)行ClustalX比對(duì)，然后利用MEGA程序的Neighbor-joining法作出基于cox序列的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4）。進(jìn)化樹結(jié)果顯示，基于線粒體DNA片段的cox片段，海灣扇貝與紫扇貝、蝦夷扇貝與櫛孔扇貝之間，親緣關(guān)系很接近，構(gòu)成了一個(gè)大組，同屬于扇貝屬。真蛸、金烏賊、皺紋盤鮑構(gòu)成了一個(gè)分支。菲律賓蛤仔、中國(guó)對(duì)蝦、鋸緣青蟹構(gòu)成了一個(gè)分

59、支。構(gòu)建的進(jìn)化樹的結(jié)果與物種與物種之間的親緣關(guān)系基本一致。 圖4. 基于線粒體DNA cox序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹3 討論 對(duì)雜交子代進(jìn)行正確鑒定，是促進(jìn)雜交種推廣應(yīng)用的重要前提。由于雜交種的形態(tài)往往介于兩親本之間，且與其中一方親本相似性較高，因此形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果往往存在偏差，限制了它的應(yīng)用，這時(shí)就需要采用其他方法對(duì)雜交種進(jìn)行分類鑒定，而分子分類學(xué)就是其中最快的一種。目前，mtDNA是分子生物學(xué)領(lǐng)域中研究物種起源、進(jìn)化及遺傳分化的理想研究對(duì)象，這主要是由于mtDNA作為一種核外遺傳物質(zhì)，與核DNA相比，具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、進(jìn)化速度快、存在母性遺傳現(xiàn)象及提取方便等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于判斷生物間的親

60、緣關(guān)系、分析系統(tǒng)發(fā)生、物種進(jìn)化、物種分類及輔助選擇育種過程中。鑒于線粒體DNA的特點(diǎn)，在軟體動(dòng)物中已有大量關(guān)于mtDNA在判斷物種的親緣關(guān)系、正反交情況、產(chǎn)生優(yōu)良高產(chǎn)、抗逆性強(qiáng)的雜交子代方面的應(yīng)用。Hye Suck等對(duì)皺紋盤鮑6個(gè)種群進(jìn)行了cox片段遺傳多態(tài)性的分析，發(fā)現(xiàn)了13個(gè)多態(tài)位點(diǎn)共計(jì)10種單倍型15；Coren對(duì)牡蠣四個(gè)選擇后的品系與選擇前的群體的mtDNA進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)四品系間和與各自的來源群體間的mtDNA表現(xiàn)出豐富的多樣性16；Snyder 等在對(duì)深海種大西洋扇貝的研究中發(fā)現(xiàn)，其線粒體基因組是普通脊椎動(dòng)物的2倍17；Masahiro Matsumoto使用1對(duì)兼并引物對(duì)扇貝科17

61、種扇貝8種珍珠貝的cox基因片段進(jìn)行了擴(kuò)增立了系統(tǒng)進(jìn)化樹；Maremi Sato和Koji Nagashima從蝦夷扇貝擴(kuò)增出條13kb長(zhǎng)的片段，檢測(cè)到15個(gè)突變位點(diǎn)17種單倍型，說明這段區(qū)域可用于種群遺傳分析18。盡管目前已獲得許多生物的cox基因片段，但紫扇貝的cox序列尚屬未知。本次實(shí)驗(yàn)通過同源克隆的方法獲得了紫扇貝線粒體cox部分基因片段序列，為其應(yīng)用于紫扇貝的遺傳育種及擴(kuò)大養(yǎng)殖提供了可能。通過對(duì)不同物種的cox序列的同源性比較，結(jié)果表明，各物種cox的功能域序列高度一致，cox在物種進(jìn)化過程中相對(duì)保守。進(jìn)化樹分析表明紫扇貝cox與其他扇貝cox的親緣關(guān)系較近，而各物種cox相似性高低

62、與其來源的物種間的親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近是一致的。紫扇貝與海灣扇貝同源性為85.55%，種間關(guān)系非常接近，這一結(jié)果與紫扇貝和海灣扇貝可以成功雜交且沒有生殖隔離提供了一定的理論依據(jù)。另外由于線粒體DNA基因呈母系遺傳的特點(diǎn)，也可將其應(yīng)用于檢測(cè)兩親本的雜交后代屬于正交還是反交，這在生物遺傳學(xué)上也具有重要作用。紫扇貝由于其優(yōu)良的養(yǎng)殖性狀，越來越受到我國(guó)科研人員及養(yǎng)殖企業(yè)的重視，對(duì)其能在我國(guó)擴(kuò)大養(yǎng)殖也進(jìn)行了大量的嘗試與研究，紫扇貝分子遺傳信息的完善將大大促進(jìn)這一進(jìn)程，而目前對(duì)紫扇貝的遺傳結(jié)構(gòu)研究相對(duì)較少，因此，利用其他物種已知的生物信息來挖掘紫扇貝新的基因，探索其重要性狀的表達(dá)和調(diào)控機(jī)制，應(yīng)成為該物種未來的一個(gè)重要研究方向。參考文獻(xiàn)：1 DALL WThe mollusca and branehiopodaReport of the ared 19 operation AlbatrosBulletin Mollusca Comparative Zoology. 1909, 37: 147-2942 DALL W H. The mollusca and branchiopoda. Report of the dredging operation, Albatros. 1909,13: 31-38.3 Illanes J. Cuhivo del ostion del Notre.