1、植物組織培養技術簡介及其應用植物組織培養技術簡介及其應用主要內容 植物組織培養技術簡介 組織培養技術的應用 植物組織培養基本操作植物組織培養技術簡介 組織培養的概念組織培養的概念 植物組織培養是指在無菌條件下植物組織培養是指在無菌條件下, , 將離體的將離體的植物器官植物器官( (如根尖、莖尖、葉、如根尖、莖尖、葉、花、未成熟的果實、種子等花、未成熟的果實、種子等) )、組織組織( (如形成層、花藥組織、胚乳、皮層等如形成層、花藥組織、胚乳、皮層等) )、細胞細胞( (如體細胞、生殖細胞等如體細胞、生殖細胞等) )、胚胎胚胎( (如成熟和未成熟的胚如成熟和未成熟的胚) )、原生質體原生質體(

2、(如如脫壁后仍具有生活力的原生質體脫壁后仍具有生活力的原生質體), ), 培養在人工配制的培養基上培養在人工配制的培養基上, , 給予適宜給予適宜的培養條件的培養條件, , 誘發產生愈傷組織誘發產生愈傷組織, , 或潛伏芽等或潛伏芽等, , 或長成完整的植株或長成完整的植株, , 統稱為統稱為植物組織培養。植物組織培養。 由于是在試管內培養由于是在試管內培養, , 而且培養的是脫離植株母體的培養而且培養的是脫離植株母體的培養物物, , 因此也稱離體培養或試管培養。因此也稱離體培養或試管培養。 根據外植體來源和培養對象的不同根據外植體來源和培養對象的不同, , 又分為又分為植株培養植株培養、胚胎

3、培養胚胎培養、器官培養器官培養、組織培養組織培養、原生質體培養原生質體培養等。等。植物組織培養技術簡介 (1) 植株培養植株培養(plant culture) 對完整植株材料的培養，如幼苗及較大植株的培養。對完整植株材料的培養，如幼苗及較大植株的培養。 (2) 器官培養器官培養(organ culture) 離體器官的培養，可以包括分離莖尖、莖段、根尖、葉片、葉原基、離體器官的培養，可以包括分離莖尖、莖段、根尖、葉片、葉原基、子葉、花瓣、雄蕊、雌蕊、胚珠、胚、子房、果實等外植體的培養子葉、花瓣、雄蕊、雌蕊、胚珠、胚、子房、果實等外植體的培養。 (3) 組織或愈傷組織培養組織或愈傷組織培養(ti

4、ssure callus culture) 對植物體的各部分組織進行培養或對由植物器官培養產生的愈傷組織對植物體的各部分組織進行培養或對由植物器官培養產生的愈傷組織進行培養，二者均通過再分化誘導形成植株。進行培養，二者均通過再分化誘導形成植株。 (4) 細胞培養細胞培養(cell culture) 對由愈傷組織等進行液體振蕩培養所得到的能保持較好分散性的離體對由愈傷組織等進行液體振蕩培養所得到的能保持較好分散性的離體單細胞或花粉單細胞或很小的細胞團的培養。單細胞或花粉單細胞或很小的細胞團的培養。 (5) 原生質體培養原生質體培養(proplast culture) 用酶及物理方法除去細胞壁的原

5、生質體的培養。用酶及物理方法除去細胞壁的原生質體的培養。植物組織培養技術簡介 外植體（器官、組織、細胞）外植體（器官、組織、細胞） 完整植物完整植物 植物細胞全能性植物細胞全能性：植物的單個細胞所具有的產生完整：植物的單個細胞所具有的產生完整植物個體的潛在能力。細胞的植物個體的潛在能力。細胞的脫分化脫分化和和再分化再分化是離體是離體培養過程中細胞全能性表現的基本過程。培養過程中細胞全能性表現的基本過程。植物組織培養技術簡介 在培養條件下，植物細胞通過再分化形成完整個體可以通在培養條件下，植物細胞通過再分化形成完整個體可以通過兩種途徑：過兩種途徑： 器官發生：器官發生： 經過愈傷組織的器官發生（

6、間接器官發生途徑）經過愈傷組織的器官發生（間接器官發生途徑） 不經過愈傷組織的器官發生（直接器官發生途徑）不經過愈傷組織的器官發生（直接器官發生途徑） 體細胞胚胎發生：體細胞胚胎發生： 經過愈傷組織的體細胞胚發生（間接體胚發生途徑）經過愈傷組織的體細胞胚發生（間接體胚發生途徑） 體細胞胚從外植體上直接發生（直接體胚發生途徑）體細胞胚從外植體上直接發生（直接體胚發生途徑）組織培養技術的應用 在植物脫毒和快速繁殖上的應用 在植物育種上的應用 (1) (1) 單倍體育種單倍體育種 單倍體植株往往不能結實單倍體植株往往不能結實, 在培養中用秋水仙素處理在培養中用秋水仙素處理, 可使染可使染色體加倍色體

7、加倍, 成為純合二倍體植株成為純合二倍體植株, 這種培養技術在育種上的應這種培養技術在育種上的應用稱為單倍體育種。單倍體育種具有高速、高效率、基因型一用稱為單倍體育種。單倍體育種具有高速、高效率、基因型一次純合等優點次純合等優點, 因此因此, 通過花藥或花粉培養的單倍體育種通過花藥或花粉培養的單倍體育種, 已經已經作為一種嶄新的育種手段作為一種嶄新的育種手段, 并已開始育成大面積種植的作物新并已開始育成大面積種植的作物新品種。品種。組織培養技術的應用 (2) (2) 胚胎培養胚胎培養 在植物在植物種間雜交或遠緣雜交種間雜交或遠緣雜交中中, , 雜交不孕給遠緣雜交帶來了許雜交不孕給遠緣雜交帶來了

8、許多困難。而多困難。而采用胚的早期離體培養采用胚的早期離體培養可以使胚正常發育并成功地可以使胚正常發育并成功地培養出雜交后代。培養出雜交后代。 遠緣雜交中遠緣雜交中, , 可把未受精的胚珠分離出來可把未受精的胚珠分離出來, , 在試管內用異種花在試管內用異種花粉在胚珠上萌發受精粉在胚珠上萌發受精, , 產生的雜種胚在試管中發育成完整植株產生的雜種胚在試管中發育成完整植株, , 此法稱為此法稱為“試管受精試管受精”。 用用胚乳培養胚乳培養可以獲得三倍體植株可以獲得三倍體植株, , 為誘導形成三倍體植物開辟為誘導形成三倍體植物開辟了一條新途徑。三倍體加倍后可得到六倍體了一條新途徑。三倍體加倍后可得

9、到六倍體, , 可育成多倍體新可育成多倍體新品種。品種。組織培養技術的應用 (3)(3)細胞融合細胞融合 植物體細胞雜交在植物遠源雜交育種中植物體細胞雜交在植物遠源雜交育種中, ,除了應用離體胚培養除了應用離體胚培養或離體受精和授粉培養技術之外或離體受精和授粉培養技術之外, , 還可采用植物體細胞雜交技還可采用植物體細胞雜交技術術原生質體融合原生質體融合。 由于不同來源的原生質體都有彼此融合的能力由于不同來源的原生質體都有彼此融合的能力, ,在遠源雜交中在遠源雜交中, ,通過細胞融合可獲得種間、屬間、科間、甚至界間的細胞融合通過細胞融合可獲得種間、屬間、科間、甚至界間的細胞融合體系，因此，細胞

10、融合打破了種屬間的界限，克服遠緣雜交不體系，因此，細胞融合打破了種屬間的界限，克服遠緣雜交不親和性障礙，在植物新品種的培育和種性改良中有著巨大的潛親和性障礙，在植物新品種的培育和種性改良中有著巨大的潛力。力。 目前，采用原生質體融合技術已經能從不雜交的植物中如番茄目前，采用原生質體融合技術已經能從不雜交的植物中如番茄和馬鈴薯、煙草和龍葵、芥菜和油菜等獲得屬間雜種。和馬鈴薯、煙草和龍葵、芥菜和油菜等獲得屬間雜種。組織培養技術的應用 (4)(4)基因工程基因工程 基因轉化是有目的地將外源基因或基因轉化是有目的地將外源基因或DNADNA導入植物細胞內導入植物細胞內, ,使之整使之整合、表達并遺傳，通

11、過外源基因的導入，并植物體內表達，有合、表達并遺傳，通過外源基因的導入，并植物體內表達，有目的地改變植物性狀，以提高作物的抗逆性，改良作物品質。目的地改變植物性狀，以提高作物的抗逆性，改良作物品質。 植物組織培養是外源基因導入植物細胞的關鍵技術，通過組織植物組織培養是外源基因導入植物細胞的關鍵技術，通過組織培養技術可以建立一個良好的培養技術可以建立一個良好的植物轉化系統植物轉化系統，目前通常使用的，目前通常使用的再生系統再生系統有愈傷組織再生系統、直接分化再生系統、原生質體有愈傷組織再生系統、直接分化再生系統、原生質體再生系統、胚狀體再生系統和生殖細胞受體系統等。再生系統、胚狀體再生系統和生殖

12、細胞受體系統等。組織培養技術的應用 (5)(5)培養細胞突變體培養細胞突變體l無論是愈傷組織培養，還是細胞培養，培養細胞均無論是愈傷組織培養，還是細胞培養，培養細胞均處在不斷分生狀態，容易受培養條件和外界壓力處在不斷分生狀態，容易受培養條件和外界壓力( (如如射線、化學物質等射線、化學物質等) ) 的影響而產生誘變，從中可以的影響而產生誘變，從中可以篩選出對人們有用的突變體，從而育成新品種。篩選出對人們有用的突變體，從而育成新品種。l目前，用這種方法已篩選出抗病、抗鹽、高賴氨酸、目前，用這種方法已篩選出抗病、抗鹽、高賴氨酸、高蛋白、矮稈高產的突變體，有些已用于生產。高蛋白、矮稈高產的突變體，有

13、些已用于生產。組織培養技術的應用 在提取植物次生產物生產上的應用在提取植物次生產物生產上的應用 在人工種子和種質保存方面的應用在人工種子和種質保存方面的應用 在植物檢疫方面的作用在植物檢疫方面的作用植物組織培養基本操作 洗滌洗滌( (略）略） 培養基配制培養基配制 離體培養體系的建立離體培養體系的建立培養基的配制 培養基的種類和成分培養基的種類和成分 目前國際上流行的培養基有幾十種，如：目前國際上流行的培養基有幾十種，如：MSMS培養基培養基 、B5B5培養基、培養基、 WPMWPM培養基、培養基、 WhiteWhite培養基培養基 、N6N6培養基等。培養基等。 培養基的成分主要可以分水、無

14、機鹽、有機物、天然復合物、培培養基的成分主要可以分水、無機鹽、有機物、天然復合物、培養體的支持材料等五大類。養體的支持材料等五大類。 1、水水 大規模生產時可用自來水。但在少量研究上盡量用蒸餾大規模生產時可用自來水。但在少量研究上盡量用蒸餾水；水； 2、無機元素無機元素 大量元素大量元素：有：有N，P，K，Ca，Mg，S等等；微量微量元素元素： Fe，B，Mn，Cu，Mo，Co等。等。Fe鹽鹽：FeSO4 7H2O和和Na2-EDTA結合成螯合物使用。結合成螯合物使用。培養基的配制3 3、有機化合物、有機化合物 (1)(1)碳水化合物碳水化合物 最常用的碳源是蔗糖，蔗糖使用濃度在最常用的碳源是

15、蔗糖，蔗糖使用濃度在2-3， 常用常用3； (2)(2)維生素維生素(vitamin) 主要有主要有VB1(鹽酸硫胺素鹽酸硫胺素)、VB6(鹽酸吡鹽酸吡哆醇哆醇)、Vpp(煙酸煙酸)、VC(抗壞血酸抗壞血酸)、有時還使用生物素、葉酸、有時還使用生物素、葉酸、VB2等。一般用量為等。一般用量為0.1-1.0mg/L。 (3)(3)肌醇肌醇 又叫環己六醇。使用濃度一般為又叫環己六醇。使用濃度一般為100mg/L。 (4)(4)氨基酸氨基酸 是有機氮源，可直接被細胞吸收利用。培養基中是有機氮源，可直接被細胞吸收利用。培養基中最常用最常用甘氨酸甘氨酸。培養基的配制4植物激素植物激素(hormone)在

16、培養基的各成分中植物激素是培養基的關鍵物質在培養基的各成分中植物激素是培養基的關鍵物質,對植物組織培養起著決定性作用。對植物組織培養起著決定性作用。(1)(1)生長素類生長素類(auxin)，如如NAA、IAA、IBA、2, 4-D等主要被用于誘等主要被用于誘導愈傷組織形成，誘導根的分化和促進細胞分裂、伸長生長；導愈傷組織形成，誘導根的分化和促進細胞分裂、伸長生長；(2)(2)細胞分裂素類細胞分裂素類(cytokinin) ，如，如BA、TDZ、KT、ZT等多用于誘等多用于誘導不定芽的分化、莖、苗的增殖，而避免在生根培養時使用；導不定芽的分化、莖、苗的增殖，而避免在生根培養時使用；(3)(3)

17、GA( 赤霉素赤霉素)用于打破休眠，促進種子、塊莖、鱗莖等提前萌發；用于打破休眠，促進種子、塊莖、鱗莖等提前萌發；(4)(4)ABA（ 脫落酸）促進細胞成熟老化等。脫落酸）促進細胞成熟老化等。培養基的配制 5.瓊脂瓊脂(agar) 在固體培養時瓊脂是最好的固化劑。瓊脂能溶解在熱水中，在固體培養時瓊脂是最好的固化劑。瓊脂能溶解在熱水中，成為溶膠，冷卻至成為溶膠，冷卻至40即凝固為固體狀凝膠。瓊脂溶解于即凝固為固體狀凝膠。瓊脂溶解于90以上的熱水。瓊脂的用量在以上的熱水。瓊脂的用量在6-10gL之間。之間。培養基的配制 配制培養基的方法和步驟配制培養基的方法和步驟 1、MS培養基及激素母液的配制培

18、養基及激素母液的配制 培養基配方中各種成分的用量從每升幾毫克到幾千毫克不等，培養基配方中各種成分的用量從每升幾毫克到幾千毫克不等，為了配制培養基的方便，通常將培養基的不同成分為了配制培養基的方便，通常將培養基的不同成分先配制成高先配制成高濃度的母液濃度的母液。無機鹽按。無機鹽按大量元素大量元素、微量元素微量元素和和Fe鹽鹽3部分分別部分分別配制。一般將大量元素配制成配制。一般將大量元素配制成20母液，微量元素、母液，微量元素、Fe鹽和鹽和有機成分配制成有機成分配制成200母液。母液。 激素的使用濃度很低，一般分別配制成激素的使用濃度很低，一般分別配制成0.11mg/ml濃度的溶濃度的溶液。配好

19、的母液貯存于液。配好的母液貯存于24的冰箱中備用。的冰箱中備用。 培養基的配制2、MS培養基的配制及分裝培養基的配制及分裝 按照各種母液順序和規定量，用移液管或量筒取母液，放在燒按照各種母液順序和規定量，用移液管或量筒取母液，放在燒杯或三角瓶中。稱取蔗糖（杯或三角瓶中。稱取蔗糖（30g/L）、瓊脂（）、瓊脂（7.5g/L），倒入），倒入約占配制培養基總量約占配制培養基總量1/2以上的蒸餾水中，然后邊攪拌邊加入以上的蒸餾水中，然后邊攪拌邊加入各種母液混合，最后定容，各種母液混合，最后定容，用用1mol/L的的NaOH或或HCl溶液調節溶液調節PH值至值至5.86.0。加熱混合均勻后，趁熱將配制好

20、的培養基加熱混合均勻后，趁熱將配制好的培養基分裝入培養容器中，封口。分裝入培養容器中，封口。培養基的配制（以MS為例）：母液的配制和保存，稱量，溶解，定容，分裝，標簽，滅菌保存。 母液種類母液種類成分成分規定用量規定用量擴大擴大稱取量稱取量母液定容母液定容配配1LMS培養基吸培養基吸取量取量(ml)(mg/L)倍數倍數(mg)體積體積(ml)KNO3190038000NH4NO3165033000大量元素MgSO4.7H2O370207400100050KH2PO41703400CaCI.2H2O4408800微量元素MnSO4.4H2O22.34460ZnSO47H2O8.61720H3BO

21、36.2200124010005KI0.83166Na2MoO4.2H2O0.2550CuSO4.5H2O0.0255CoCI2.6H2O0.0255鐵鹽Na2-EDTA37.3200746010005FeSO4.7H2O27.85560有機物煙酸煙酸0. 5100甘氨酸甘氨酸2400VB0. 12002010005VB0. 5100肌醇肌醇10020000培養基的配制 配制培養基時應注意的問題配制培養基時應注意的問題 1、在配制培養基母液或者培養基時，各種成分要嚴格按照添加方式和添、在配制培養基母液或者培養基時，各種成分要嚴格按照添加方式和添加順序加入，以免培養基產生沉淀現象。如：加順序加入

22、，以免培養基產生沉淀現象。如： 、配制、配制大量元素母液大量元素母液時，各種無機鹽單獨溶解后，必須按照硝酸鉀、時，各種無機鹽單獨溶解后，必須按照硝酸鉀、硝酸銨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀和硝酸銨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀和氯化鈣氯化鈣的次序混合定容，因為氯化鈣的次序混合定容，因為氯化鈣與磷酸二氫鉀、硫酸鎂極易形成磷酸三鈣、硫酸鈣之類不溶于水的沉與磷酸二氫鉀、硫酸鎂極易形成磷酸三鈣、硫酸鈣之類不溶于水的沉淀。淀。 、配制、配制微量元素母液微量元素母液時，應按硫酸錳、硫酸鋅、硫酸銅、硼酸、鉬時，應按硫酸錳、硫酸鋅、硫酸銅、硼酸、鉬酸鈉、碘化鉀和氯化鈷的順序混合定容。酸鈉、碘化鉀和氯化鈷的順序混合定容。 、配制、

23、配制Fe鹽鹽時，分別溶解時，分別溶解FeSO47H2O和和Na2EDTA2H2O在適當在適當體積的蒸餾水中，適當加熱并不停攪拌，待完全溶解后將二者混合在體積的蒸餾水中，適當加熱并不停攪拌，待完全溶解后將二者混合在一起，調整一起，調整pH至至5.5，最后定容到所需體積。，最后定容到所需體積。培養基的配制2、配制培養基母液時，應當按照培養基配方清單逐一添加成分，以、配制培養基母液時，應當按照培養基配方清單逐一添加成分，以免出現錯誤。此時如發生錯誤，將會導致以后用此母液配制的所免出現錯誤。此時如發生錯誤，將會導致以后用此母液配制的所有培養基都出現問題而不能及時發現。有培養基都出現問題而不能及時發現。

24、3、配好的鐵鹽應裝入棕色瓶。鐵鹽和有機化合物應放入冰箱保存。、配好的鐵鹽應裝入棕色瓶。鐵鹽和有機化合物應放入冰箱保存。4、培養基的、培養基的pH值會顯著影響培養物的生長狀態，因此要注意培養值會顯著影響培養物的生長狀態，因此要注意培養基在經過高壓蒸汽滅菌后基在經過高壓蒸汽滅菌后pH會降低會降低0.20.5個單位。個單位。5、新的玻璃器皿在第一次使用之前應當徹底清洗干凈。、新的玻璃器皿在第一次使用之前應當徹底清洗干凈。6、要添加的過濾滅菌成分，應當在經過高壓滅菌的培養基溫度降到要添加的過濾滅菌成分，應當在經過高壓滅菌的培養基溫度降到凝固溫度之上的凝固溫度之上的10左右時加入，添加后充分混勻，盡快分

25、裝左右時加入，添加后充分混勻，盡快分裝。7、滅菌后的培養基一般在、滅菌后的培養基一般在2周內使用，貯存時間過長會造成潛在的周內使用，貯存時間過長會造成潛在的污染。污染。培養基的配制 滅菌滅菌 培養基配置好后，在高壓滅菌鍋中培養基配置好后，在高壓滅菌鍋中121滅菌滅菌20min。瓶裝的培養基在滅菌前分裝，而要用培養皿的培養基瓶裝的培養基在滅菌前分裝，而要用培養皿的培養基在滅菌后分裝。在滅菌后分裝。 注意：對于不能高壓滅菌的成分，如注意：對于不能高壓滅菌的成分，如IAA、ZT、GA3、ABA、AgNO3、谷氨酰胺、抗生素等，需先、谷氨酰胺、抗生素等，需先過濾滅菌，待高壓滅菌的培養基冷至過濾滅菌，待

26、高壓滅菌的培養基冷至50 左右時，左右時，再加入這些成分分裝。再加入這些成分分裝。離體培養體系的建立初代培養 植物外植體都是帶菌的，在進行離體培養之前，必須先對外植體植物外植體都是帶菌的，在進行離體培養之前，必須先對外植體進行消毒滅菌處理，以獲得無菌植物材料。進行消毒滅菌處理，以獲得無菌植物材料。 常用的方法是用消毒劑進行表面滅菌。消毒劑對植物細胞有殺傷常用的方法是用消毒劑進行表面滅菌。消毒劑對植物細胞有殺傷作用，因此，要根據外植體對消毒劑的敏感性和其受污染程度來作用，因此，要根據外植體對消毒劑的敏感性和其受污染程度來確定消毒劑種類、濃度及處理時間。確定消毒劑種類、濃度及處理時間。 常用的消毒

27、劑有酒精、次氯酸鈉、過氧化氫、升汞、硝酸銀和溴常用的消毒劑有酒精、次氯酸鈉、過氧化氫、升汞、硝酸銀和溴水等。用于無菌操作的器械采用灼燒滅菌。水等。用于無菌操作的器械采用灼燒滅菌。離體培養體系的建立初代培養 接種是嚴格的無菌操作。外植體經過滅菌后，立即在接種是嚴格的無菌操作。外植體經過滅菌后，立即在無菌操作臺上進行無菌操作。接種過程應盡可能快，無菌操作臺上進行無菌操作。接種過程應盡可能快，以避免染菌。操作要謹慎，操作不當極易引起污染。以避免染菌。操作要謹慎，操作不當極易引起污染。 接種后的材料盡快放置于適當的培養條件下培養。適接種后的材料盡快放置于適當的培養條件下培養。適宜的培養條件主要包括光照

28、、溫度、培養基宜的培養條件主要包括光照、溫度、培養基pH和培養和培養環境的空氣流通程度等。環境的空氣流通程度等。初代培養 1、外植體的選擇、外植體的選擇（1）、）、外植體的部位外植體的部位在組織培養中，如何選擇合適的，最能表達在組織培養中，如何選擇合適的，最能表達全能性的部位，是決定組織培養體系成功建立的前提之一。全能性的部位，是決定組織培養體系成功建立的前提之一。 （2）、）、取材季節取材季節 取材季節也是重要因素之一，對大多數植物，應取材季節也是重要因素之一，對大多數植物，應在其生長開始的季節。在其生長開始的季節。（3）、器官的生理特點和發育器官的生理特點和發育 幼年組織幼年組織比老年組織

29、具有較高的行比老年組織具有較高的行態發生能力。態發生能力。（4）、外植體的大小莖段長外植體的大小莖段長0.5cm，葉片面積，葉片面積5mm2。 初代培養 2、外植體的消毒、外植體的消毒 外植體的消毒步驟外植體的消毒步驟 首先，把材料切割成適當大小，即滅菌容器能放入為宜。置自首先，把材料切割成適當大小，即滅菌容器能放入為宜。置自來水龍頭下流水沖洗幾分鐘至數小時，洗時可加入洗衣粉清洗；來水龍頭下流水沖洗幾分鐘至數小時，洗時可加入洗衣粉清洗； 第二步要在超凈臺用第二步要在超凈臺用7070酒精消毒酒精消毒10-30s10-30s； 第三步是用殺菌劑第三步是用殺菌劑0 0. .1%1%升汞處理升汞處理5

30、-5-2020 min min； 第四步用無菌水涮洗第四步用無菌水涮洗4-64-6次，每次不少于次，每次不少于3min3min，以盡量去除殘，以盡量去除殘毒毒。初代培養 3、無菌操作、無菌操作 超凈工作臺滅菌超凈工作臺滅菌 開始無菌操作前半小時，打開超凈工作臺上的開始無菌操作前半小時，打開超凈工作臺上的紫外燈，照射紫外燈，照射20分鐘后，關閉紫外燈，使超凈工作臺正常送風，分鐘后，關閉紫外燈，使超凈工作臺正常送風，10分鐘左右后，即可開始無菌操作。分鐘左右后，即可開始無菌操作。 雙手及接種器械滅菌雙手及接種器械滅菌 進行無菌操作前，先用肥皂洗滌雙手，穿進行無菌操作前，先用肥皂洗滌雙手，穿好工作服

31、。用好工作服。用7075的酒精擦拭臺面并消毒雙手。所有接種器的酒精擦拭臺面并消毒雙手。所有接種器械用械用75酒精浸泡，在酒精燈上灼燒滅菌。酒精浸泡，在酒精燈上灼燒滅菌。 接種接種 切去材料兩端各切去材料兩端各0.5cm左右長度莖段，將莖段接種到初代左右長度莖段，將莖段接種到初代培養基上。在培養容器上標明培養基代號和接種日期。培養基上。在培養容器上標明培養基代號和接種日期。 4、初代培養、初代培養 接種完成后，盡快將接種材料置于適當的培養條件下進行培養。接種完成后，盡快將接種材料置于適當的培養條件下進行培養。并并定期進行觀察記錄。定期進行觀察記錄。初代培養 5、污染的原因及對策、污染的原因及對策

32、 污染：組培過程中培養基和培養材料滋生雜菌導致培養失敗現象。污染：組培過程中培養基和培養材料滋生雜菌導致培養失敗現象。 （1）污染的原因）污染的原因 外植體帶菌，培養基滅菌不徹底，操作員不遵守操作規程等。外植體帶菌，培養基滅菌不徹底，操作員不遵守操作規程等。 細菌污染細菌污染 在接種后在接種后1-2天可發現，菌斑呈粘液狀。天可發現，菌斑呈粘液狀。 真菌污染真菌污染 在接種在接種3天后可發現，污染部分長有不同顏色的霉菌。天后可發現，污染部分長有不同顏色的霉菌。 （2）污染的預防措施）污染的預防措施 將取的枝條用水沖干凈后插入自來水中使其抽枝，用新抽的枝將取的枝條用水沖干凈后插入自來水中使其抽枝，

33、用新抽的枝作外植體。作外植體。 晴天中午到下午晴天中午到下午采樣采樣 操作人員嚴格遵守操作規程接種操作人員嚴格遵守操作規程接種 培養基及其用具滅菌要徹底培養基及其用具滅菌要徹底組織培養時的注意事項 1、表面消毒劑對植物組織是有害的，應正確選擇消毒、表面消毒劑對植物組織是有害的，應正確選擇消毒劑的濃度和處理時間，以減少組織的死亡。劑的濃度和處理時間，以減少組織的死亡。 2、消毒劑最好在使用前臨時配制，氯化汞可在短時間、消毒劑最好在使用前臨時配制，氯化汞可在短時間內貯用。內貯用。 3、滅菌后的材料應立即接種，以免造成二次污染。、滅菌后的材料應立即接種，以免造成二次污染。 組織培養時的注意事項 4、

34、紫外線對人體有危害，在工作臺滅菌時，不能將皮、紫外線對人體有危害，在工作臺滅菌時，不能將皮膚暴露于紫外燈下，不可直接用眼睛看紫外光。超凈膚暴露于紫外燈下，不可直接用眼睛看紫外光。超凈工作臺上的紫外燈關閉后不要立即走近工作臺，以免工作臺上的紫外燈關閉后不要立即走近工作臺，以免臭氧傷害呼吸道和眼睛。臭氧傷害呼吸道和眼睛。 5、無菌操作時注意手臂切勿從培養基、無菌材料或接、無菌操作時注意手臂切勿從培養基、無菌材料或接種工具上方經過，以免引起污染。種工具上方經過，以免引起污染。離體培養體系的建立繼代與生根培養 1、無菌苗繼代培養、無菌苗繼代培養 2、生根培養、生根培養 當無菌苗植株健壯，高度達到當無菌

35、苗植株健壯，高度達到2-3cm時，即可進行生根時，即可進行生根培養。培養。 配制生根培養基配制生根培養基 在在1/2MS或或1/4MS培養基中，添加濃培養基中，添加濃度比例較高的生長素和細胞分裂素。度比例較高的生長素和細胞分裂素。繼代與生根培養 注意事項：注意事項：1、進行繼代時，如發現培養物的底部長出愈傷組織，應、進行繼代時，如發現培養物的底部長出愈傷組織，應將其切去。將其切去。2、無菌苗用于生根培養前，應適當進行壯苗，否則無菌、無菌苗用于生根培養前，應適當進行壯苗，否則無菌苗太弱小，不利于以后生根成活。苗太弱小，不利于以后生根成活。組培苗的移栽 1、練苗、練苗 練苗的主要措施是，移栽前將試管苗置于室溫環境下，增加